ホールマウント組織イメージングを用いた腸粘液の三次元定量化

Summary

この研究では、全マウント腸組織と多光子顕微鏡を使用して分泌された粘液を定量化し、塩化カルバモイルコリンなどの刺激に応答した粘液動態の正確な体積分析と視覚化を可能にする 3D イメージング法を提示します。

Abstract

粘液は、消化を促進し、微生物に対するバリアを形成し、腸内の免疫反応を調節することにより、腸の恒常性を維持する上で重要な役割を果たします。その分泌は、微生物感染や炎症など、さまざまな内因性および外因性要因によって調節されます。粘液分析の従来の方法は、組織切片での粘液の厚さの測定などの相対定量化に依存していますが、これらのアプローチでは、腸管腔内の分泌された粘液の実際の体積と空間分布についての洞察は限られています。ここでは、全マウント腸組織と多光子顕微鏡を使用して、粘液の絶対的な3次元定量のための詳細な方法論を提示します。このプロトコルには、結紮された腸ループの調製、杯細胞活性化の刺激としての塩化カルバモイルコリンによる治療、組織固定、およびイメージングのための染色が含まれます。多光子顕微鏡を用いて、管腔表面のZスタック画像を取得します。これらは Imaris ソフトウェアで処理され、分泌された粘液の量と空間分布を定量化します。塩化カルバモイルコリンが30分以内に回腸組織と結腸組織の両方で粘液分泌を強力に誘導することを実証します。分泌された粘液は内腔全体に散発的かつ不連続な方法で現れ、従来の 2 次元アプローチよりも体積分析の重要性を強調しています。このプロトコルにより、研究者は絶対的な定量データを取得し、 その場で粘液分布を視覚化することができ、生理学的および病理学的条件下での腸粘液動態を研究するための強力なツールを提供します。

Introduction

哺乳類の消化管の粘膜環境は非常に動的であり、多様な微生物群集のコロニー形成をサポートしています。腸上皮は、栄養素を吸収し、バリアの完全性を維持し、免疫系と通信するために協力するさまざまな特殊な細胞で構成されています¹。このうち、杯細胞はムチン顆粒を貯蔵し、定常状態で内腔に粘液を分泌します。この粘液は重要な物理的バリアを形成し、微生物と上皮層との直接接触を防ぎ、組織の炎症を調節し、腸の恒常性を維持します ^2,3。粘液分泌の調節不全はバリア機能を損ない、炎症と腫瘍形成に関連しています 4,5,6,7。

腸粘液分泌は、神経伝達物質であるアセチルコリンなどの内因性因子や共生体からの微生物成分によって引き起こされる可能性があります^8,9。腸内環境の複雑さを考えると、杯細胞粘液分泌に影響を与える多くの要因は未解明のままです。したがって、さまざまな刺激が分泌ダイナミクスにどのように影響するかを調査するには、管腔粘液を定量化するための正確な方法が不可欠です。従来のアプローチは、主に相対定量化に依存しており、例えば、ex vivo腸外植片システム^10,11で蛍光または木炭粒子を使用して粘液の厚さを測定すること、または染色された組織切片^12,13における管腔微生物と上皮の間の距離を評価すること。これらの方法は相対的な比較には便利ですが、特に分泌された粘液が必ずしも上皮を均一に覆っているとは限らないため、分泌された粘液の完全な分布や三次元構造を捉えることができない場合があります。

本研究では、全マウント腸組織を用いた管腔粘液の3次元可視化と絶対定量化の手法を提示する。このアプローチでは、構造の完全性と形態を維持するために適切な固定剤で新鮮な組織を固定し、その後、共焦点顕微鏡または多光子顕微鏡を使用して蛍光染色とイメージングを行う必要があります。この方法は、深く麻酔されたマウスの結紮された腸ループに直接試験剤を投与し、その後すぐに固定することにより、天然の粘液構造を維持し、分泌動態の分析を可能にします。イメージング深度が主に組織の厚さによって制限される切片化された組織と比較して、マウント組織全体のイメージング深度(脱脂なし)は、光散乱と組織の不透明度によって制約され、約200〜300μmに達します。この手法を使用して、受容体が杯細胞¹⁴に発現するアセチルコリン類似体である塩化カルバモイルコリン(CCh)が、急速な粘液分泌を強力に誘導することを示しています。特に、分泌された粘液は上皮に沿った連続層と内腔内の不連続構造の両方を形成しており、従来の組織切片では検出が困難な特徴です。このプロトコルは、腸粘液の三次元分布を定量化し、さまざまな刺激の粘液誘発の可能性を比較するための堅牢なプラットフォームを提供します。

Protocol

すべての動物実験は、長庚大学の施設動物管理および使用委員会 (IACUC) によって承認されています。長庚大学の動物施設は、実験動物管理評価認定協会 (AAALAC) の認定を受けています。これらの研究では、動物の健康上の懸念は観察されませんでした。

1. 固定ベースの準備

1. アガロース粉末をddH₂Oと混合し、電子レンジ対応フラスコで4%(w / v)の濃度にします。小さな泡がなく沸騰するまで電子レンジで2〜3分間加熱します。
   注:ボリュームはサンプルの数によって異なります。6cmの皿で約10mL。
2. アガロース溶液を~3分で~60°Cまで冷却します。液体の高さが皿の半分(6 cmの皿の場合は約10 mL)に達するまで、アガロースを6 cmの皿に慎重に注ぎます。
3. アガロースが完全に固まるまで、蓋付きの皿を密閉された場所に20〜30分間置きます。

2. 固定材の準備

1. 新しい銅線を用意し、5mmの長さにカットします。各組織には6〜8本のワイヤーが必要です。

3. CCh溶液の調製

1. 結晶性CChを滅菌PBSバッファーに溶解し、最終濃度10 μM(1つの腸ループで200 μL)に溶解します。

4. 注射用麻酔薬の調製

1. 麻酔用の原液を調製するには、2,2,2-トリブロモエタノールを2-メチル-2-ブタノールに溶解します。
2. 滅菌PBSを使用してストック溶液を希釈し、最終作業溶液に30 mg/mLの2,2,2-トリブロモエタノールと3%(v/v)の2-メチル-2-ブタノールが含まれるようにします。
3. 溶液中にペレットが残らなくなるまで~1分間完全にボルテックスします(最大速度:8)。
4. 劣化を避けるために、原液を4°Cの暗所に保管してください。準備後1ヶ月でストックを廃棄してください。
5. 麻酔前に、ストック溶液を滅菌PBSに引き込み、均一な分散を確保するためによく混合し、マウスあたり250 mg / kgの最終用量を達成します。
   注意:2,2,2-トリブロモエタノールには神経毒性があり、2-メチル-2-ブタノールは揮発性で刺激臭があります。適切な保護具を使用する必要があります。廃棄する場合は、廃棄物を密閉容器に収集し、施設の有害化学廃棄物処理手順に従ってください。

5. ループ注射による腸内接種

1. 2,2,2,2-トリブロモエタノール200μL(マウスあたり250mg/kg)の腹腔内注射で6〜8週齢のマウスを麻酔し、マウスを温熱パッドの上に置いて体温を維持します。
2. 皮膚表面をアルコールで滅菌した後、マウスの左下腹部を手術用ハサミで切開し、麻酔下で盲腸を露出させます。
3. 回腸または近位結腸を特定し、腸ループを滅菌ガーゼの上に置き、動脈クランプを使用して両端を固定し、長さ 3 cm の閉ループを作成します。
4. ガーゼの上の臓器を滅菌PBSですすいでください。
5. 麻酔下で、200 μL以下の容量の滅菌PBSまたはCCh試薬を結紮された腸ループに注入します。

6. 組織の採取、固定、染色

1. 30分の治療後、頸部脱臼によってマウスを安楽死させ、腸ループを採取します。
2. 鉗子を使用して腸ループを保持し、滅菌PBSで優しくすすいでください。
3. 腸ループを縦方向にそっと切り開き、滅菌PBSで組織をすすぎます。
4. 組織を平らにし、銅線セグメントを使用して、6 cmの皿内のアガロースに固定します。
5. 10 mLの4%パラホルムアルデヒド溶液で組織を皿内で12〜24時間固定します。
6. 残留パラホルムアルデヒドを除去するために、PBSで組織を少なくとも3回洗浄します。
7. 組織を10 mLのブロッキングバッファー(0.4%トリトンX-100および3%ウシ血清アルブミン[BSA]を添加したPBS)に4°Cで12〜24時間皿に浸します。
8. ブロッキングバッファー中の小麦胚芽凝集素(WGA、1:200)およびファロイジン(1:500)で組織を染色し、皿内で4°Cで120 rpmで12〜24時間振とうします。
   注:色素の消費を最小限に抑えるために、染色のために2 mLの色素バッファーに浸した3 cm皿内の固化アガロースに組織を固定することができます。
   注意: パラホルムアルデヒドは吸入の危険をもたらします。ヒュームフードでの操作など、取り扱い中は適切な保護具を使用する必要があります。廃棄する場合は、廃棄物を密閉容器に収集し、施設の有害化学廃棄物処理手順に従ってください。

7. 多光子顕微鏡による画像キャプチャ

1. 残りの染色バッファーをPBSで少なくとも3回洗い流します。
2. 10 mLのPBS中の6 cm皿に銅線で組織をアガロースに固定します。
3. 深部組織イメージング用の高NA対物レンズを備えた多光子顕微鏡を使用して、腸組織および関連する分泌粘液の100の光学切片(深さ99μmをカバー)を取得します。波長750nmに設定された多光子顕微鏡用の励起源を使用します。BP500-550 nmおよびBP565-610 nmバンドパスフィルターを使用して発光信号を収集します。スキャン速度を8に設定します。
   注:多光子顕微鏡の場合、最大スキャン速度は9で、値が高いほど取得が速いことを示します。速度設定は顕微鏡の容量によって異なります。3Dスタックの取得に使用するイメージングプラットフォームを使用する場合は、取得時間と画質のバランスをとるために、スキャン速度を8にすることをお勧めします。

8. 画像解析と粘液定量化(図1)

1. (WGAチャネル内の)各粘液粒子の体積を測定するには、ファイルをアリーナページにドラッグアンドドロップして、Imarisで画像スタックを開きます 。[サーフェス]アイコンをクリックして 、サーフェス作成ワークフローを開始します。標準的な手順に従って、zスタック内の粒子体積をセグメント化して定量化します。具体的なパラメータと処理手順を 図1に示します。
2. ほとんどが杯細胞である1,000μm³未満の粘液粒子を除外します(図2A、B)。
3. 各グループの分泌粘液の量を合計します。

9. 統計分析

1. 各グループの総量を分析および比較します。[ 列] に粘液量の値を入力し、ノンパラメトリックマンホイットニー検定を使用して分析します。

Results

この方法では、多光子顕微鏡で取得した全マウント組織の積層画像から腸粘液の量を定量化しました。腸組織を蛍光ファロイジンと小麦胚芽凝集素(WGA)で染色し、細胞のF-アクチンと粘液をそれぞれ視覚化しました^15,16。PBSで処理された回腸組織と結腸組織の両方で、WGA⁺粘液は主に上皮表面の杯細胞内で検出されました。塩化カルバモイルコリン(CCh)投与後、両方の組織の腸管腔で粘液量の増加が観察されました。特に、分泌された粘液は上皮上に連続層を形成しず、代わりに内腔全体に散発的に分布していました(図3A)。WGA⁺粘液の総量を計算するために、Imarisの[表面の作成]ツールを使用して、積み重ねられた画像内のすべてのWGA⁺構造をラベル付けし、細胞内杯細胞粘液と分泌された管腔粘液の両方をキャプチャしました(図3B...

Discussion

ここでは、全マウント組織染色、多光子顕微鏡、およびImarisソフトウェアによる分析を使用して、腸粘液の3次元定量化の方法を紹介します。この手順により、腸管腔内の粘液の不連続な分布を観察することができ、粘液量の絶対測定値が得られます。

刺激による不連続な粘液分布は、外植片組織^{培養システムでも}観察されています8。ex vivo外植片培養物を使用した以前の研究では、粘液の定量化は、補充されたビーズと組織表面の間の距離の測定に基づいていました^10,11。ただし、この方法は、刺激に反応して分泌された粘液の散在した斑状の分布を捉えることはできません。私たちの方法はこの制限に対処し、実験時間が麻酔の制約によって制限されない外植片組織培養システムでの使用にも適応できます。それにもかかわらず、私たちは2つのシステムが互いに補完し合うことを提案します。...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-トリブロモエタノール	シグマ・オルドリッチ	T48402
2-メチル-2-ブタノール	シグマ・オルドリッチ	240486
6cmの皿とnbsp;	アルファ・プラス	16021-1
アガロース	ヒスパナガル	A02599
BSA	バイオショップ	ALB001
カルバモイルコリン塩化物 &98%(滴定)、結晶性	シグマ	SI-C4382-1G
銅線(新品)	トップテックワイヤー&ケーブル産業	IW00125	絶縁層のない銅線
鉗子	シネテ	ST-M110
ガーゼ、滅菌	GMTH	1940年5月
GraphPadプリズム8	GraphPadソフトウェア
ヒートパッド	コンフォート	SY-666
IMARIS 10.0.0	オックスフォード・インストゥルメンツ
パラホルムアルデヒド	ビオボヴァス	BL0415-1000
PBS	ジーンスター	BL0180-1000
ファロイジンラベリングプローブ	インビトロジェン	A12379
鋏	シネテ	02-1250.18
トライトン X-100	メルク	1.08603.1000
小麦胚物凝集素(WGA)結合体	バイオティウム	29027
Zeiss 7MPにはW Plan-Apochromat 20 x/1.0 DIC III水浸対物レンズ(NA 1.0)、Spectra-Physics Mai Tai HP サファイアフェムト秒レーザー(DeepSeeモジュールなし)、BP500 nm-550 nmおよびBP565 nm-610 nm検出器、750 nmレーザー波長			深部組織イメージング用の高NA対物レンズを用いた3Dスタック取得に使用されたイメージングプラットフォーム;波長750 nmに設定された多光子顕微鏡用の励起源