Method Article

ホールマウント組織イメージングを用いた腸粘液の三次元定量化

DOI:

10.3791/68789

⸱

September 12th, 2025

 ,  ,  , 
1Laboratory of Host-Microbe Interactions and Cell Dynamics, Department of Medical Biotechnology and Laboratory Science, College of Medicine, Chang Gung University, 2Institute of Microbiology and Immunology, National Yang Ming Chiao Tung University, 3Program in Molecular Medicine, National Yang Ming Chiao Tung University and Academia Sinica, 4Graduate Institute of Biomedical Sciences, College of Medicine, Chang Gung University, 5Center for Molecular and Clinical Immunology, Chang Gung University, 6Division of General Surgery, Department of Surgery, Chang Gung Memorial Hospital

In This Article

Summary

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この研究では、全マウント腸組織と多光子顕微鏡を使用して分泌された粘液を定量化し、塩化カルバモイルコリンなどの刺激に応答した粘液動態の正確な体積分析と視覚化を可能にする 3D イメージング法を提示します。

Abstract

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粘液は、消化を促進し、微生物に対するバリアを形成し、腸内の免疫反応を調節することにより、腸の恒常性を維持する上で重要な役割を果たします。その分泌は、微生物感染や炎症など、さまざまな内因性および外因性要因によって調節されます。粘液分析の従来の方法は、組織切片での粘液の厚さの測定などの相対定量化に依存していますが、これらのアプローチでは、腸管腔内の分泌された粘液の実際の体積と空間分布についての洞察は限られています。ここでは、全マウント腸組織と多光子顕微鏡を使用して、粘液の絶対的な3次元定量のための詳細な方法論を提示します。このプロトコルには、結紮された腸ループの調製、杯細胞活性化の刺激としての塩化カルバモイルコリンによる治療、組織固定、およびイメージングのための染色が含まれます。多光子顕微鏡を用いて、管腔表面のZスタック画像を取得します。これらは Imaris ソフトウェアで処理され、分泌された粘液の量と空間分布を定量化します。塩化カルバモイルコリンが30分以内に回腸組織と結腸組織の両方で粘液分泌を強力に誘導することを実証します。分泌された粘液は内腔全体に散発的かつ不連続な方法で現れ、従来の 2 次元アプローチよりも体積分析の重要性を強調しています。このプロトコルにより、研究者は絶対的な定量データを取得し、 その場で粘液分布を視覚化することができ、生理学的および病理学的条件下での腸粘液動態を研究するための強力なツールを提供します。

Introduction

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哺乳類の消化管の粘膜環境は非常に動的であり、多様な微生物群集のコロニー形成をサポートしています。腸上皮は、栄養素を吸収し、バリアの完全性を維持し、免疫系と通信するために協力するさまざまな特殊な細胞で構成されています1。このうち、杯細胞はムチン顆粒を貯蔵し、定常状態で内腔に粘液を分泌します。この粘液は重要な物理的バリアを形成し、微生物と上皮層との直接接触を防ぎ、組織の炎症を調節し、腸の恒常性を維持します 2,3。粘液分泌の調節不全はバリア機能を損ない、炎症と腫瘍形成に関連しています 4,5,6,7。

腸粘液分泌は、神経伝達物質であるアセチルコリンなどの内因性因子や共生体からの微生物成分によって引き起こされる可能性があります8,9。腸内環境の複雑さを考えると、杯細胞粘液分泌に影響を....

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Protocol

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すべての動物実験は、長庚大学の施設動物管理および使用委員会 (IACUC) によって承認されています。長庚大学の動物施設は、実験動物管理評価認定協会 (AAALAC) の認定を受けています。これらの研究では、動物の健康上の懸念は観察されませんでした。

1. 固定ベースの準備

  1. アガロース粉末をddH2Oと混合し、電子レンジ対応フラスコで4%(w / v)の濃度にします。小さな泡がなく沸騰するまで電子レンジで2〜3分間加熱します。
    注:ボリュームはサンプルの数によって異なります。6cmの皿で約10mL。
  2. アガロース溶液を~3分で~60°Cまで冷却します。液体の高さが皿の半分(6 cmの皿の場合は約10 mL)に達するまで、アガロースを6 cmの皿に慎重に注ぎます。
  3. アガロースが完全に固まるまで、蓋付きの皿を密閉された場所に20〜30分間置きます。

2. 固定材の準備

  1. 新しい銅線を用意し、5mmの長さにカットします。各組織には6〜8本のワイヤーが必要です。

3. CCh溶液の調製

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Results

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この方法では、多光子顕微鏡で取得した全マウント組織の積層画像から腸粘液の量を定量化しました。腸組織を蛍光ファロイジンと小麦胚芽凝集素(WGA)で染色し、細胞のF-アクチンと粘液をそれぞれ視覚化しました15,16。PBSで処理された回腸組織と結腸組織の両方で、WGA+粘液は主に上皮表面の杯細胞内で検出されました。塩化カルバモイルコリン(CCh)投与後、両方の組織の腸管腔で粘液量の増加が観察されました。特に、分泌された粘液は上皮上に連続層を形成しず、代わりに内腔全体に散発的に分布していました(図3A)。WGA+粘液の総量を計算するために、Imarisの[表面の作成]ツールを使用して、積み重ねられた画像内のすべてのWGA+構造をラベル付けし、細胞内杯細胞粘液と分泌された管腔粘液の両方をキャプチャしました(図3B.......

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Discussion

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ここでは、全マウント組織染色、多光子顕微鏡、およびImarisソフトウェアによる分析を使用して、腸粘液の3次元定量化の方法を紹介します。この手順により、腸管腔内の粘液の不連続な分布を観察することができ、粘液量の絶対測定値が得られます。

刺激による不連続な粘液分布は、外植片組織培養システムでも観察されています8。ex vivo外植片培養物を使用した以前の研究では、粘液の定量化は、補充されたビーズと組織表面の間の距離の測定に基づいていました10,11。ただし、この方法は、刺激に反応して分泌された粘液の散在した斑状の分布を捉えることはできません。私たちの方法はこの制限に対処し、実験時間が麻酔の制約によって制限されない外植片組織培養システムでの使用にも適応できます。それにもかかわらず、私たちは2つのシステムが互いに補完し合うことを提案します。.......

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Disclosures

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著者には開示すべき利益相反はありません。

Acknowledgements

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技術支援をしてくれたリンコウの長庚記念病院の顕微鏡コア研究所に感謝します。また、Zeiss LSM 7 MP多光子顕微鏡の提供に対する国立陽明交通大学のイメージングコア施設の支援、特にPei-jun Chen氏とYung-yu Lu氏の技術サポートにも感謝します。著者らは、NSTC 110-2320-B-A49A-544-MY3 および 113-2628-B-182-002-MY3 (YHT へ) からの支援に感謝したいと考えています。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2,2,2-トリブロモエタノールシグマ・オルドリッチT48402
2-メチル-2-ブタノールシグマ・オルドリッチ240486
6cmの皿とnbsp;アルファ・プラス16021-1
アガロース ヒスパナガルA02599
BSAバイオショップALB001
カルバモイルコリン塩化物 &98%(滴定)、結晶性シグマSI-C4382-1G
銅線(新品)トップテックワイヤー&ケーブル産業IW00125絶縁層のない銅線
鉗子シネテST-M110
ガーゼ、滅菌GMTH1940年5月
GraphPadプリズム8 GraphPadソフトウェア
ヒートパッドコンフォートSY-666
IMARIS 10.0.0オックスフォード・インストゥルメンツ
パラホルムアルデヒドビオボヴァスBL0415-1000
PBSジーンスターBL0180-1000
ファロイジンラベリングプローブインビトロジェンA12379
鋏シネテ02-1250.18
トライトン X-100メルク1.08603.1000
小麦胚物凝集素(WGA)結合体バイオティウム29027
Zeiss 7MPにはW Plan-Apochromat 20 x/1.0 DIC III水浸対物レンズ(NA 1.0)、Spectra-Physics Mai Tai HP サファイアフェムト秒レーザー(DeepSeeモジュールなし)、BP500 nm-550 nmおよびBP565 nm-610 nm検出器、750 nmレーザー波長深部組織イメージング用の高NA対物レンズを用いた3Dスタック取得に使用されたイメージングプラットフォーム;波長750 nmに設定された多光子顕微鏡用の励起源

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haber, A. L., et al. A single-cell survey of the small intestinal epithelium. Nature. 551 (7680), 333-339 (2017).
  2. Bergstrom, K., et al. Proximal colon-derived O-glycosylated mucus encapsulates and modulates the microbiota. Science. 370 (651....

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