マイクロ流体フローフォーカシングデバイスを用いた室温での安定した単分散リン脂質被覆マイクロバブルの製造

サマリー

本稿では、マイクロ流体フローフォーカシング装置を用いて室温で単分散リン脂質被覆マイクロバブルを作製する方法について、リン脂質コーティング製剤の調製方法を含めて説明します。

要約

単分散マイクロバブルは、画像処理と治療用途の両方で超音波造影剤の有効性を高める上で大きな可能性を実証しています。これらのマイクロバブルは、マイクロ流体フローフォーカシング法を使用して直接生成できるため、サイズを正確に制御できます。ただし、製造中の合体を防ぐことは依然として重要な課題です。製造温度の上昇(55°Cなど)は合体を抑制する可能性がありますが、そのような条件はマイクロ流体デバイスの設計を複雑にし、標的薬剤や薬物複合体と互換性がない可能性があります。このプロトコルは、マイクロバブルの安定性と単分散性を少なくとも7日間維持しながら、室温で単分散リン脂質でコーティングされたマイクロバブルを製造する方法を概説する。このプロトコルはまた、再利用可能なPDMSマイクロ流体チップの製造および界面活性剤Pluronic F68を含むリン脂質コーティング製剤の調製についても説明している。私たちの調査結果は、この方法で生成されたマイクロバブルが 7 日間にわたってサイズと安定性を維持し、安定した制御可能な超音波造影剤が不可欠な臨床現場での将来の適用性をサポートすることを示しています。

概要

超音波造影剤 (UCA) は、臨床超音波検査および治療用途で広く使用されています ^1,2,3。静脈内投与されると、これらのマイクロバブルは血管系に閉じ込められたままになり、血液プール剤として機能します ^4,5。安定化シェルがマイクロバブルをコーティングし、ラプラス圧力によって駆動されるガス拡散を低減し、マイクロバブルの寿命を延ばします ^3,6。超音波にさらされると、マイクロバブルは振動し始め、ガスコア^7,8の圧縮性により強いエコーを生成します。振動は、マイクロバブルのサイズとシェル特性^9,10,11の影響を受けるマイクロバブルの共振周波数で最も顕著です。臨床的に承認されたUCAは、一般に、直径^12、13、14が約0.5〜10μmの範囲の広いサイズ分布の多分散マイクロバブルで構成されています。この広いサイズ分布により、これらのマイクロバブルが共鳴する周波数の範囲が広くなります。臨床超音波プローブは通常、狭い周波数帯域幅で動作することを考えると、UCA 集団のサブセットのみが効果的に共鳴します¹⁵。サイズ分布が狭い単分散マイクロバブル (PDI 3~10%^16,17 など) は、多分散マイクロバブルと比較して診断と治療を強化することが示されています。造影超音波画像では、強度は¹⁸桁2〜3桁増加し、サブハーモニック信号による非侵襲的圧力センシングの感度はほぼ2倍になり^19、20、21、ドラッグデリバリー効率は²²桁近く増加しました.したがって、サイズ分布が狭い単分散マイクロバブルを生成し、音響応答を行うことは、制御されたマイクロバブル振動が重要な超音波イメージングおよび治療用途の可能性を最大化するための鍵となります。

単分散マイクロバブルは、デカンテーション²³、機械的ろ過²⁴、および多分散マイクロバブル剤²⁵の遠心分離などのさまざまな方法によって製造することができる。ただし、これらの技術では、正確なサイズ制御と高い単分散性を達成することは依然として困難です²⁶。代替のより制御されたアプローチは、マイクロ流体フローフォーカシングデバイスを使用して単分散マイクロバブルを直接生成することです。このプロセスでは、ガススレッドがマイクロ流体チップ上の2つの水性リポソームストリームの間に集束され、ガススレッドの再現性のあるピンチオフにつながり、目的のサイズ²⁷で単分散マイクロバブルを高速に生成できます。フローフォーカシング法は、単分散液滴^28,29の製造に広く使用されているが、単分散マイクロバブル製造におけるそれらの適用は、合体を防止し、サイズ、単分散性、および濃度の点で長期安定性を適切に維持することが困難であるため、あまり一般的ではない³⁰。複数のマイクロバブルがより大きなマイクロバブルに融合する合体は、単分散性に影響を与えます。製造温度の上昇は合体を低下させることが示されています³¹ が、これはマイクロ流体システムの設計を複雑にし、標的薬剤または薬物複合体を含む製剤には適さない可能性があります。したがって、室温で単分散マイクロバブルを生成することが有利です。リン脂質でコーティングされたマイクロバブルは時間の経過とともに収縮、崩壊、および単分散性を失う傾向があるため、同様に重要なのは、これらの単分散マイクロバブルを保存する方法です³²。単分散マイクロバブル技術を臨床応用に応用するには、保管中に数日間にわたって長期安定性を確保することが重要です。

このプロトコルでは、室温でフローフォーカシングマイクロ流体プラットフォームを使用して、リン脂質でコーティングされた単分散マイクロバブルを製造する方法について説明します。この方法は、13-42 μL/min の範囲の脂質流量と互換性があり、室温での使用を想定して設計されているため、マイクロ流体システムの温度制御が不足している研究室に適しています。このプロトコルは、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[カルボニル-メトキシポリエチレングリコール](DPPE-PEG5000)、および安定性と再現性を保証するプルロニックF68からなるリン脂質製剤を利用します。このプロトコルは、再利用可能なPDMSマイクロ流体チップの製造、リン脂質コーティング溶液の調製、および室温での製造中のマイクロバブルの合体を防ぐための界面活性剤Pluronic F68の組み込みに関する段階的な手順を提供します。また、ノズルの目詰まりを防ぐためにマイクロ流体システムを洗浄する手順、マイクロバブルのサイズを制御するためのガス圧力と液体流量の調整、長期安定性のために生成されたマイクロバブルを収集して保管する手順についても詳しく説明します。この方法は、室温で正確なサイズ制御により安定した単分散マイクロバブルを生成するための実用的なアプローチを提供します。

プロトコル

1. 脂質膜の製造

注:単分散マイクロバブル製造用の脂質混合物は、モル比90:10のDSPCとDPPE-PEG5000のバイナリー混合物で配合されます。DSPCが主な脂質として選ばれたのは、多分散^33,34と単分散マイクロバブル³¹の両方でガス溶解に対して優れた安定性を提供することが示されているためである。この安定性の向上は、55°^C35という比較的高いゲルから液晶への相転移温度に起因すると仮定されており、これはDPPC(~41°C)³⁵などの他の一般的に使用される脂質の温度よりも高く、それによって室温でより剛性で不浸透性の脂質シェルをもたらす³⁶。ここでは、3mLのリン脂質コーティング液を調製する例を示します。単分散マイクロバブル^16,17を製造するための典型的な濃度である20 mg / mLの最終リン脂質濃度を達成するには、60 mgのリン脂質が必要です。各リン脂質成分の所望量を表1に示します。

1. リン脂質粉末を-20°Cの冷凍庫から取り出し、室温で1時間解凍します。
2. 必要な脂質粉末を別々の2 mLメスフラスコで計量します。
3. 100 mLのガラス製計量シリンダーを使用して90 mLのクロロホルムを測定し、これを250 mLのガラス三角機に移すことにより、100 mLのクロロホルム:メタノール溶媒の90:10 V / v混合物をヒュームフードで調製します。次に、100 mLのガラス製計量シリンダーを使用して10 mLのメタノールを測定し、すでにクロロホルムが含まれている250 mLのガラス三角紙に注ぎます。ガラス三角紙をガラス栓で閉じ、溶液が透明になるまで三角紙をそっと回転させて2つの溶媒を混合します。
   注意: クロロホルムとメタノールは有毒化学物質です。クロロホルムは潜在的な発がん性物質であり、呼吸器、皮膚、目の炎症を引き起こす可能性があります。メタノールは可燃性が高く、吸入、摂取、または皮膚から吸収されると有毒であり、摂取すると失明を引き起こす可能性があります。ヒュームの吸入を避けるために、常に換気の良いヒュームフードでクロロホルム/メタノールの混合物を使用して作業してください。手袋、安全ゴーグル、白衣などの適切な個人用保護具を着用してください。メタノールを取り扱うときは、裸火や発火源が存在しないようにしてください。溶剤廃棄物は、施設の有害廃棄物プロトコルに従って処分します。
4. ステップ1.2で計量した脂質粉末を完全に溶解するには、2mLのメスグラスフラスコにクロロホルム/メタノール混合物のmLを加え、蒸発を防ぐためにガラスの蓋をすばやく閉じます。
   注:脂質粉末が完全に溶解していることを確認してください。必要に応じて、フラスコをゆっくりと回転させて溶解しやすくします。
5. 溶解した脂質溶液を30mLのガラスバイアルに混合し、各溶液を順番に注ぎます。
6. アルゴンガスの安定した流れの下で溶媒を蒸発させ、バイアルを回転させてガラス表面に脂質膜が均一に分布するようにします。
   注:最終的な微量の溶媒は、アルゴンガスのみを使用して蒸発するのが難しい場合があります。バイアルをヒュームフードに2時間放置し、さらに乾燥させます。アルゴンガスが利用できない場合は、窒素ガス³⁷または6°^C31,38(すなわち、DSPCの相転移温度55°^C35以上)で作動する真空ロータリーエバポレーターを使用して、クロロホルム/メタノール溶媒を蒸発させることができる。
7. 溶媒蒸発後、脂質混合物を真空にかけて、残留する有機溶媒を除去します。ガラスバイアルをパラフィルムの層で密封し、針でいくつかの穴に穴を開けて、真空中に空気が流れるようにします。
   注:パラフィルムを使用する目的は、凍結乾燥プロセス中に脂質がガラスバイアルから分散するのを防ぐことです。
8. バイアルを真空下で凍結乾燥機に一晩入れて、残留有機溶媒を除去します。
9. 次のステップに進むか、脂質膜を必要になるまで-20°Cで保存します。
   注:このセクションまたはプロトコルの他の場所では、遠心分離ステップは使用されていません。

2. フローフォーカシングマイクロ流体チップの作製

注:単分散マイクロバブルは、 図1Aに示すように、フローフォーカシングマイクロ流体チップを使用して生成されます。ノズルと出口の寸法を含むマイクロ流体チャネル形状の概略図は、 補足図S1に示されています。これらの金型の調製に使用されるSU-8ベースのフォトリソグラフィーの詳細な製造プロトコルは、以前に³⁷ 説明されており、このプロトコルの 補足情報 として見つけることができます。PDMS チップの製造プロセスの概要は、次の手順で説明します。

1. PDMSベース(23.g)と硬化剤(2.3g)を10:1の重量比で混合して、合計25.5gのPDMSを得る。
2. マスターモールドをシャーレに入れ、その上にPDMS混合物を注ぎます。
3. 真空(2~7 mbar)下で混合物を40分間脱気し、閉じ込められた気泡を除去します。
   注: 大量の場合、気泡を完全に除去するために、より長い脱気時間が必要になる場合があります。
4. 金型を75°Cのホットプレートに1時間置きます。
   注:大量の場合、硬化時間が長くなる場合があります。
5. PDMSを室温まで冷まします。メスを使用して、硬化したPDMSの周りを慎重に切り取り、剥がしてチップを解放します。
6. PDMSチップを希望のサイズにカットし、1mmパンチを使用して入口/出口の穴を開けます。
7. PDMSチップを粘着テープで洗浄し、ほこりの粒子を取り除きます。
8. PDMSチップとスライドガラスの両方をイソプロパノールで洗浄し、続いて脱イオン水で洗浄します。
9. PDMSを空気プラズマクリーナーで60%の電力(60 W)で1分間処理して、スライドガラスに接着します。
10. 接着したチップを95°Cのホットプレートに3分間置き、接着を強化します。
11. PDMSチップを室温まで冷まします。完全に製造されたチップを 図1Cに示し、ノズルの顕微鏡明視野画像を 図1Dに示します。
12. 結合したチップをプラズマクリーナーに80%の電力(80 W)で5分間入れて、マイクロ流体チャネルの表面親水性を回復します。
13. 親水性を維持するために、すぐにチップにMilli-Q水を入れます。
14. チップは、使用するまで室温でMilli-Q水に保管してください。

3. リン脂質コーティング液の調製

1. 調製した脂質膜を-20°Cの冷凍庫から取り出し、室温で1時間解凍します。
2. 3 mLの予熱(55°C)リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を脂質膜(60 mg)に加え、最終脂質濃度20 mg/mLにします。バイアルを55°Cの水浴に40分間入れ、15分ごとに中速でボルテックスします(ボルテックスミキサーのレベル3/5)。
   注:このステップは、ステップ3.5の超音波処理の前に、脂質成分をPBSに事前に溶解し、均一に分散させるのに役立ちます。この温度は^DSPC39の相転移温度であり、部分可溶化を促進し、脂質凝集を減少させます。ステップ3.6の超音波処理は、完全な光学的透明性を達成するために必要ですが、予備的な熱インキュベーションは、大きな脂質凝集体の形成を最小限に抑え、分散液の均質性を高めることにより、より効率的で再現性のある超音波処理を促進します。
3. 脂質混合物に0.43mLのプルロニックF68溶液を加えて、モル濃度10%、すなわちDSPC:DPPE-PEG5000:プルロニックF68 = 81:9:10モル%に達します。その後、サンプルは視覚的に図 2Aのようになりますが、これは曇った溶液です。
   注:プルロニックF68は、単分散マイクロバブル生成中の合体を防ぐために使用される界面活性剤です^16,40。プルロニックF68が存在しない場合、単分散マイクロバブルは、ホライゾンマイクロ流体デバイス³⁷およびこのプロトコル¹⁶に記載されている脂質製剤を用いて形成できない。この化合物は、得られた単分散マイクロバブル懸濁液³⁸の単分散性と安定性の両方を損なうことが報告されているため、脂質製剤にはプロピレングリコールは使用されなかった。
4. 蛍光標識単分散マイクロバブルの調製には、この段階で親油性カルボシアニン色素などの脂質色素を混合物に組み込みます。
5. 脂質混合物を水浴中で100%の電力で20分間超音波処理し、水温を55°Cに維持します。 脂質溶液は20分後に 図2B のようになり、ステップ3.4よりも濁りにくい溶液です。 図2Cに示すように、溶液が透明になるまで10分間隔で超音波処理を続けます。
   注: 図2Cの溶液では、明確な溶液を得るために30分間の超音波処理が必要でした。脂質溶液の特性評価は、例えば動的光散乱体を使用してリポソームサイズを測定することによって実行することができる。
6. 脂質溶液を室温まで冷ましてからさらに処理します。

4. マイクロバブル収集バイアルの準備

注:単分散マイクロバブルを長期保存するには、収集バイアルとして気密性のある医療用バイアルが必要です。

1. 5 mLのガラス製医療用バイアルをゴム栓で密封し、バイアルにC₄F₁₀ ガスを入れます。その後、バイアルの周りにアルミニウム キャップを圧着して、気密性を確保します。これで、収集バイアルを使用する準備が整いました。

5. マイクロ流体プラットフォームの準備

注: 図3Aに示すように、システムは、ホライゾンマイクロ流体プラットフォーム³⁷ (以下「マイクロ流体プラットフォーム」という))、制御用のコンピュータ、生産プロセスを監視するための高速カメラ、高速イメージング中の照明用の外部発光ダイオード(LED)光源、および生産中に特定の間隔で高速イメージングをトリガーするための関数波形発生器で構成されます。マイクロバブルの生成を開始する前に、ノズルの目詰まりの可能性を減らすためにデバイスを洗浄する必要があります。洗浄手順には、チューブとマイクロ流体チップの両方が含まれます。

1. チューブ洗浄手順
   1. 右側にあるマイクロ流体プラットフォームの電源スイッチをオンにします(図3A)。
      注: 「電源スイッチ」とは、システムの内部マイクロコントローラー、ポンプ、およびセンサーを作動させる Horizon プラットフォームの主電源制御ユニットを指します。
   2. 70%エタノールで満たされた4 mLのガラスバイアルを、マイクロ流体プラットフォームのPポンプチャンバーの左側に入れます(図3)。液体の流れを100 μL/分で開始し、液体入口チューブをバイアルからの70%エタノールで洗い流します。5分後に液体の流れを止めてフラッシングを停止します。
      注: P ポンプとは、マイクロ流体システム内に統合された圧力制御ガス供給ユニットを指します。このステップは、チューブの洗浄のみを目的としています。この段階では、チューブをマイクロ流体チップに接続しないでください。このプロセスにより、エタノールに溶ける粉塵や汚染物質が流体システムから除去されます。
   3. エタノール入りのバイアルをMilli-Qの水入りバイアルと交換します。
   4. チューブを 100 μL/分の Milli-Q 水で 5 分間洗い流し、システムから残留エタノールを除去します。
2. 切りくず洗浄手順
   1. マイクロ流体プラットフォームの内部LEDライトスイッチをオンにします。
   2. PDMS チップをホルダーに挿入します。
   3. マニホールドをチップの上に置き、調整可能なホイールを使用して固定します。
   4. ピンセットを使用して、ガス、液体、および出口チューブをPDMSチップに取り付けます。接続構成を 図 3B に示します。出口チューブがバイアルにつながっていて、洗浄プロセスから廃液を回収していることを確認します。
   5. プラットフォームを調整して、チップのノズルを対物レンズの視野内に配置します。
   6. 1000 mbarのガス圧と100 μL/minの液体流量を使用して、Milli-Q水でチップを5分間洗浄します。最初にガスの流れを開始し、次に液体の流れに続きます。
      注:このステップは、ノズルの上流にあるマイクロ流体チップを洗浄することです。
   7. 液体の流れを止め、続いて気体の流れを止めます。
   8. (図3C)に示すように、ガスチューブと出口チューブを再接続します。
   9. 1000 mbarのガス圧と50 μL/minの液体流量を使用して、Milli-Q水でさらに5分間洗浄手順を繰り返します。最初にガスの流れを開始し、次に液体の流れに続きます。
      注:このセットアップは、ノズルの下流にあるマイクロ流体チップを洗浄します。
   10. 液体の流れを止め、続いて気体の流れを止めます。PDMSチップはマイクロバブル製造の準備が整いました。

6. 高速撮像のセットアップ

注:単分散マイクロバブルの生成を監視および制御するには、マイクロバブルは10⁵ マイクロバブル/秒を超える生産速度で生成されるため、高速カメラをマイクロ流体プラットフォームと統合することをお勧めします。この高速カメラにより、オンチップのマイクロバブルのサイズと生産速度の測定、およびマイクロチップのオンチップ合体の監視が可能になります。

1. LED光源を取り付けプラットフォームの上に取り付け(図3A)、高速イメージング中にマイクロ流体チップを照らします。
2. 高速カメラをマイクロ流体プラットフォームのサイドイメージングポートに結合します。
3. 外部ファンクション波形発生器を利用して、マイクロバブル生成の全期間にわたって10秒間隔で高速記録をトリガーします。波形発生器のTTLトリガ出力を、標準のBNCケーブルを使用して高速カメラの外部トリガ入力に接続し、同期した取得を保証します。このモニタリングは、ガススレッドの形状と製造中のマイクロバブルのサイズ安定性を評価するために必要です。
   メモ: 生産中に目詰まりが発生する可能性があるため、継続的な監視が重要です。さらに、高速画像シーケンスを使用して、時間分解されたオンチップマイクロバブルサイズ分布を抽出します。この10秒の間隔は、ユーザーの要件に応じて調整できます。

7. 単分散マイクロバブルの生成と特性評価

1. 生産を開始する前に、 図 4A に示すように収集バイアルをセットアップします。1本の針をゴム栓に刺して収集針として機能し、もう1本の針を換気針として栓に刺し、針の先端をバイアルの底近くに配置します。製造中は、クランプを使用して収集バイアルを逆さまにしてください。
   注:換気針は、収集中にバイアル内の圧力を一定に保ちます。C₄F₁₀ は空気よりも重いため、自発的にバイアルから出ることはありません。
2. 調製したリン脂質溶液をマイクロ流体プラットフォームのPポンプにロードします。
3. チップのノズル部分を対物レンズの視野に移動します。
   注:マイクロ流体プラットフォームには、ズームとフォーカスを調整できる内部光学モジュールと、高速カメラを取り付けるための外部Fマウントカプラーが含まれています。
4. マイクロバブルの生成を開始するには、ガス圧を 800 mbar、液体流量を 40 μL/min に設定します。
   注:マイクロ流体プラットフォームは、左側に1〜5 μL / min、右側に1〜100 μL / minの2つの流量制御液体チャネルと、1つの圧力制御ガスチャネルを統合しています。このプロトコルでは、1〜100 μL/minの液体チャネルと圧力制御ガスチャネルが使用されました。
5. 液体がノズルに到達すると、ガススレッドがつまんで出口から単分散マイクロバブルを放出します(図4A)。
6. 高速記録を≥ 200,000 fps のフレーム レートに設定し、高速記録を使用して、MATLAB の関数 imfindcircles を使用して 生成されたマイクロバブルのサイズを測定します。
7. ガス圧と液体流量を調整して、マイクロバブルのサイズを制御します。
   注:流量またはガス圧を調整した後、MATLABスクリプトを使用して、高速記録からオンチップサイズ分布をプロットします。サイズ分布をガウス分布で当てはめると、平均 μ と標準偏差 σ を導き出すことができます。 μ は、生成された単分散マイクロバブルのオンチップサイズを表します。マイクロバブル合体は、チューブ内に残留するミリQ水により、製造の初期段階で発生する可能性があり、脂質濃度が希釈されます。この問題は通常、原液の脂質溶液がノズルに到達すると解決します。 表2は 、800 mbarの一定のガス圧でいくつかの適用流量で得られるマイクロバブル直径をまとめたものです。ガス圧力と液体流量のさまざまな組み合わせにより、同様のサイズのマイクロバブルを生成できますが、異なるパラメータの組み合わせも生成速度に影響します。一定のガス流量では、生産速度は液体流量⁴¹と正の相関があることが知られている。このプロトコルにおけるマイクロバブル生成速度は、高速記録のフレームごとの分析に基づいて、毎秒~10⁵ マイクロバブルのオーダーであり、これは、同様のフローフォーカシング形状³⁷について以前に報告された値と一致している。
8. 所望のマイクロバブルサイズに達したら、出口チューブを収集バイアルに接続して、生成されたマイクロバブルを収集します。
9. 収集中は、生産プロセスを監視するために、10秒ごとにトリガーされる高速記録を設定します。
   注: 録音の間隔は、特定の要件に基づいて調整できます。
10. 十分なマイクロバブル懸濁液が収集されたら、換気針と収集針の両方を収集バイアルから取り外します。
11. 液体の流れを止め、続いて気体の流れを止めます。
12. 収集したマイクロバブルを室温で直立して保管し、バイアルの機械的撹拌を最小限に抑えます。
    注:マイクロバブル溶液は、図5Aに示すように、泡層、単分散マイクロバブル層、およびサブネントの3つの層を持ちます。以前の研究では、泡に関連する気泡が単分散サイズ^16,38 まで徐々に収縮する可能性があることが報告されているため、泡層をバイアルに残すのが最善です。このプロトコルを使用して製造されたマイクロバブルは、規制当局の安全性評価を受けていません。ただし、構成脂質 (DSPC、DPPE-PEG5000) と界面活性剤 (Pluronic F68) は、FDA 承認の注射製剤で一般的に使用されており、生体適合性があると考えられています^42,43。医療用途の安全性を確立するには、さらなる前臨床評価が必要です。
13. 製造後2時間(すなわち、単分散マイクロバブルの製造から2時間後)に、粒子特性評価機を使用してマイクロバブルの最終サイズと濃度を特徴付けます。
    注:フローフォーカシング法で生成された単分散マイクロバブルは、最終サイズ⁴⁴まで安定化するまでに約90分かかります。したがって、マイクロバブルを使用する前に、少なくとも2時間の安定化を許可することをお勧めします。
14. 19Gの針をmLシリンジ(以下「抽出シリンジ」と呼びます)に取り付けます。
15. 別の19 G針を換気針としてマイクロバブルバイアルに挿入します。マイクロバブル抽出中に空気の侵入を可能にし、内圧を維持するために、針の先端がバイアルの上部近くにとどまるようにしてください。
16. バイアルをそっと回転させて懸濁液を均質化します。懸濁液は、上部の発泡層、単分散マイクロバブルを含む中間層、および下部の水性層の 3 つの層に分離されます。
17. 抽出シリンジをすばやく挿入し、泡と下部の水性下清層を避けて、単分散マイクロバブル層の中央内に針先を慎重に配置します。必要な量のマイクロバブル懸濁液を引き出し、抽出シリンジをバイアルから取り出します。マイクロバブルの抽出が完了したら、換気針を取り外します。

8. クリーニングとシャットダウンの手順

注: マイクロバブルの生成後、マイクロ流体プラットフォームとチップは、適切に機能し、チップを再利用できるように徹底的に洗浄する必要があります。次の手順では、クリーニング プロセスの概要を示します。

1. チップの場合は、次の手順に従います。
   1. 脂質バイアルをMilli-Qウォーターバイアルに交換します。
   2. 800 mbarのガス圧と40 μL/minの液体流量を使用して、マイクロ流体チップを5分間洗い流します。
   3. 最初に液体の流れを止め、次にガスの流れを止めます。
   4. ガス入口チューブのみをマイクロ流体チップから外します。
   5. マイクロ流体チップにMilli-Q水を充填して、内面の親水性を維持します。
   6. 液体の流れを止め、残りのすべてのチューブをチップから外します。
   7. チップは、将来の使用に必要になるまでMilli-Q水に保管してください。
2. マイクロ流体システムの場合は、次のように進めます。
   1. Milli-Q ウォーターバイアルをマイクロ流体プラットフォーム内の 70% エタノールバイアルと交換します。
   2. 液体入口チューブを70%エタノールで100 μL/分の流量で5分間洗い流し、脂質残留物を除去します。
   3. エタノールバイアルをP-Pump1のMilli-Qウォーターバイアルと交換します。
   4. チューブを 100 μL/分の Milli-Q 水で 5 分間洗い流し、システムから残留エタノールを除去します。これでシステムはクリーンになりました。
   5. マイクロ流体プラットフォームと高速カメラシステムをシャットダウンします。

9. トラブルシューティングの手順

1. ノズルの詰まり
   注:ノズルのサイズが小さい(5 μm)ため、製造プロセス中に詰まりが発生する可能性があります。詰まりを解消するには、以下の手順に従ってください。
   1. すぐに液体の流れを止め、続いてガスの流れを止めます。
   2. 図3Bに示す設定に従ってチューブを再接続します。
   3. リン脂質充填バイアルを P-Pump1 の Milli-Q 水充填バイアルに交換します。
   4. 1000 mbarのガス圧を加え、液体流量を100 μL/minに5分間設定してノズルをフラッシュします。
      注:ほとんどの場合、詰まりは5分間すすぐと解消されます。ただし、詰まりが続く場合は、PDMS チップを新しいものと交換する必要がある場合があります。
   5. 詰まりが解消されたら、 図3Cに示すようにチューブを再接続します。
   6. 1000 mbar のガス圧と 50 μL/min の液体流量を使用して、チップを Milli-Q 水で 5 分間再度洗い流し、完全なクリアランスを確保します。
   7. Milli-Q 水充填バイアルを P-Pump1 のリン脂質充填バイアルに交換し、マイクロバブルの生成を再開します。
      注意: 製造中に詰まりが続く場合は、チューブまたはマイクロ流体チップの洗浄が不十分であることを示している可能性があります。この場合は、チューブをチップから外し、手順 5 で説明したクリーニング手順に従ってください。システム全体を徹底的に洗浄した後も詰まりが続く場合は、マイクロ流体プラットフォームの内部フィルターの故障を示唆している可能性があります。フィルターを新しいものと交換すると、問題が解決する場合があります。
2. 必要に応じてマイクロ流体チップを再利用します。
   注意: チップが適切に保管されていないと、親水性が失われる可能性があります。これが発生した場合、ガススレッドのピンチオフは 、図5Eに示すパターンのようになります。このような場合、一貫した信頼性の高いマイクロバブル生成を確保するために、親水性の新しいチップに切り替えることをお勧めします。

結果

このプロトコルでは、フローフォーカシングマイクロ流体チップを使用して、室温で安定した単分散マイクロバブルを生成する方法を提示します。PDMSチップは、図1に示すように、マスターモールドから鋳造して製造されます。PDMSチップをスライドガラスに接着するために、プラズマ処理が採用されます。プラズマ処理は、PDMS 表面を疎水性から親水性に変化させるため、非常に重要です。この親水性は、マイクロバブル生成中にガス糸の形状と位置を維持するために不可欠であり、一貫したサイズで単分散マイクロバブルを長期安定的に(数時間程度)生成することを可能にします(図5D)。 具体的には、親水性チップでは、ガスねじ山は毛細管現象によってガス入口チャネルの角に固定されるため、幾何学的に安定した状態を維持し、それによって安定した対称的なピンチオフガスねじの形状が維持されます。PDMS表面が親水性を失うと、ガススレッド(図5Eの白い矢印で強調表示)はガス入口チャネルの角に固定されなくなります(図5Eのオレンジ色...

ディスカッション

このプロトコルは、マイクロ流体フローフォーカシングチップを使用して、室温で安定した単分散マイクロバブルを生成および保存する方法を詳細に説明しています。単分散マイクロバブルは、造影超音波イメージング¹⁸、非侵襲的圧力センシング¹⁹、およびマイクロバブルを介したドラッグデリバ^リー22に、 in vitro および in vivoの両方で使用できます。

製造後の単分散マイクロバブルの安定化には、少なくとも90分⁴⁴が必要であると以前に報告されています。この安定化期間により、主にオストワルドの成熟により、実質的な泡層が形成されます 44,47,48。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 mm 生検パンチ	甲斐メディカル	143831
1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルリンドジカルボシアニン(DiD)	サーモフィッシャーサイエンティック	D307	親油性カルボシアニン色素
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[カルボニル-メトキシポリエチレングリコール] (DPPE-PEG5000)	リポイド	CAS番号384835-61-4
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)	リポイド	CAS番号816-94-4
100mLガラス製計量シリンダー	ブラウブランド
2 mLメスグラスグラス	ブラウブランド
250 mLガラス三角	ブラウブランド
30 mLガラスバイアル	DWKライフサイエンス	SCERC40752700D0C2
70%エタノール
75 & 度;Cホットプレート
粘着テープ
アルミキャップ	シグマ・アルドリッチ	27016
アルゴンガス	リンデガスベネルクス
C4F10ガス	F2ケミカル
クロロホルム	メルクKGaA	67-66-3
臨床的に利用可能 超音波造影剤(マイクロバブルなど)	Bracco, Plan-LesOuates, スイス	ソノビュー	図6A.
収集と換気 19G 針	100ステリカン	4657799
コールターカウンターマルチサイザー3	ベックマン・コールター	粒子特性評価装置
特注超音波造影剤(単分散マイクロバブル)	NA	F1-10PF型	図6A.によって説明されているように作成:Wang、Y.他。室温で生成した単分散りん脂質被覆マイクロバブルのサイズ安定性と音響挙動に及ぼすプルロニックF68の影響ACSアプリケーション。インターフェース 2025、17、8976−8986。(2025).
特注超音波造影剤(単分散マイクロバブル)	NA	F2-10 PF	図6A.によって説明されているように作成:Wang、Y.他。室温で生成した単分散りん脂質被覆マイクロバブルのサイズ安定性と音響挙動に及ぼすプルロニックF68の影響ACSアプリケーション。インターフェース 2025、17、8976−8986。(2025).
デミウォーター
外部LEDライト	GSVITEC株式会社	GS02370
凍結乾燥機	メルティン・クライストGmbH	アルファ 1–2 LDプラス
関数波形発生器	アジレント	33220A型
気密ガラスバイアル	シグマ・アルドリッチ	Z113964-288EA
スライドガラス	VWRの	631-1552
ハイスピードカメラ	フォトロン	ノヴァS16
ホライゾンマイクロ流体プラットフォーム	リーズ大学、イギリス		このプラットフォームは市販されており、Abou-Saleh, R. H. et al. Horizon: 治療用マイクロバブルおよびナノバブルの製造のためのマイクロ流体プラットフォーム。科学機器のレビュー。92 (7), 074105 (2021).
マトラブ	MathWorks の	R2023a
メタノール	メルクKGaA	67-56-1
ミリQ水
PDMSゲル	シルガード	シルガード® 184
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS 1x)	ギブコ	10010023
プラズマクリーナー	ヘニカーサイエンティフィック	HPT-100型
プルロニックF68	サーモフィッシャーサイエンティフィック	24040032
ゴム栓	シグマ	Z166065-100個
チューブ	マスターフレックス	MFLX06407-41	PTFE、1/32インチ内径×1/16インチ外径。25フィート
ピンセット
ボルテックス	シグマ・アルドリッチ	Z654779
水浴式超音波処理器	エマグ	エミ30HC