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方法論記事

急性リンパ芽球性白血病に対する導入化学療法への白血病再発のマウスモデル

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DOI:

10.3791/68797

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2025年10月17日

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1Leukemia Biology Laboratory, Boldrini Children's Center, 2Graduate Program in Genetics and Molecular Biology, University of Campinas, 3Boldrini Children's Center, 4Department of Translational Medicine, Faculty of Medical Sciences, University of Campinas

この記事について

サマリー

このプロトコルは、導入化学療法に対する反応のダイナミクスに基づいて、急性リンパ芽球性白血病の再発を生成するためのマウスモデルを説明することを目的としています。

要約

急性リンパ芽球性白血病 (ALL) は、未熟なリンパ前駆細胞の新生物であり、最も一般的な小児悪性腫瘍の 1 つです。小児 ALL の治癒率は 90% に近づいていますが、再発と薬剤耐性は依然として課題です。これに関連して、in vivoでのがん生物学の研究が不可欠であり、マウスモデルを使用した患者由来異種移植片(PDX)がこの目的のために広く使用されています。ただし、再発サンプルからの PDX は、または診断用サンプルと比較した PDX では、再発の開始と進行の背後にあるメカニズムを完全には評価していません。このプロトコルは、マウスでB-ALL PDX再発を生成することに依存しており、薬剤耐性を獲得するプロセス全体を通じて白血病細胞の収集を可能にします。B-ALL PDX細胞が生着した動物は、ALL療法で一般的に使用される4つの薬剤の組み合わせで治療され、デキサメタゾン、ビンクリスチン、L-アスパラギナーゼ、およびダウノルビシンという異なる作用機序を表します。4週間の寛解導入期の後、動物は休息期間中の再発について監視されます。再発までの時間が短縮されるまで治療と再発のサイクルが繰り返され、in vivo 薬剤耐性の増加の代用として機能します。再発と耐性の根底にあるメカニズムを調査するために、表現型および遺伝子分析のために各治療サイクルの前後に白血病細胞が収集されます。モデルを検証するために、コルチコステロイド療法の7日後の末梢血中の芽球の存在と、15、33、および78/96日目の微小残存病変(MRD)によって評価された、良好および不良の両方を含むさまざまな小児ALLサンプルがテストされました。マウスで観察された結果は患者データと一致しており、化学療法に対する臨床反応を模倣するモデルの精度が確認されました。このアプローチにより、B-ALL における再発と薬剤耐性の動的研究が可能になり、メカニズムの調査と新しい治療戦略の開発がサポートされます。

概要

急性リンパ芽球性白血病 (ALL) は、小児に最も多いがんです。ここ数十年で達成された高い治癒率にもかかわらず、高所得国では 5年全生存率が90%に達し1、新しい治療戦略の模索に大きな努力が払われていますが、先進国では、患者の15%〜20%が疾患から再発し、生存率は、最初の再発が診断後早期(18か月未満)またはそれ以降(36か月)に発生するかどうかに応じて30%〜60%の間で変動します2。3.これを考慮して、難治性と再発性はすべて克服すべき課題のままです。診断に関しては、難治性ALLは化学療法に対する感受性が低いことによって再発と区別されますが、再発ALLは寛解期間後の疾患の再発によって特徴付けられます。他のがんと同様に、ALLは、異数性、染色体再構成、およびさまざまな治療反応と再発リスクに関連するさまざまな遺伝子変異を含む遺伝的異常を特徴とします4。ALL の再発は、すでに最大強度の化学療法を受けている高リスク患者でより頻繁に発生するため、薬物の用量または組み合わせをさらに調整するだけでは十分ではない可能性があります。代わりに、薬剤耐性と再発の根底にあるメカニズムを特定することに努力を向ける必要があります。

これを踏まえて、研究者らは化学療法によって及ばされる選択圧が耐性細胞の出現にどのように寄与するかを理解しようと試みてきました。既存の文献のほとんどは、診断時にすでに存在していた耐性悪性サブクローンの増殖に帰属しています5。しかし、最近の研究では、転写プログラムを調節するエピジェネティックな修飾などの代替メカニズムの存在が示唆されており、これも再発に寄与する可能性がある6。

すべての再発を研究するための正確な in vivo モデルの作成に多大な努力が払われてきました。免疫不全マウスは、元の疾患特性を保持し、ALL生着に使用することに成功しており7,8、患者由来の異種移植片(PDX)の開発につながりました。このモデルは、互換性のある微小環境における元の腫瘍/白血病細胞の生着と増殖を可能にします。その主な利点の 1 つは、化学療法に対する移植された ALL 細胞の反応を評価できることです9。

PDX モデルは、ALL 再発を模倣して研究するためにも採用されています。たとえば、Samuelsら10 によって開発されたプロトコルでは、患者の白血病細胞を移植した非肥満の糖尿病/重度複合免疫不全(NOD / SCID)マウスを使用して、導入様化学療法レジメンに対する耐性メカニズムを調査しました。著者らは、ビンクリスチン、デキサメタゾン、L-アスパラギナーゼ、およびダウノルビシン(VXLD)による治療について説明し、治療サイクル数と再発のタイミングの例を示した。しかし、このモデルは、治療直後の細胞、つまり初期治療を生き延びた細胞の分析に焦点を当てており、再発ではなく微小残存病変(MRD)を表している可能性が高い。

より最近の研究では、ALL 移植された NOD の短期治療が評価されました。Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NOD、scid γ、または NSG) 免疫不全マウスは、対応する患者の再発を予測できる可能性があります11。再発患者と非再発患者の両方からの中リスクの ALL サンプルをマウスに移植し、ビンクリスチン、デキサメタゾン、および L-アスパラギナーゼ (VXL) からなる導入様レジメンで処理しました。生着までの時間と治療後の再発を測定し、比較しました。結果は、この PDX モデルが患者の転帰を予測するための予後ツールとして役立つ可能性があることを示唆しました。この発見は、ALL再発の生物学の研究におけるPDXマウスモデルの有用性を裏付けています。たとえば、再発の根底にあるメカニズムを明らかにするために、再発細胞をさまざまな時点で検査できた可能性があります。

この原稿では、B-ALL再発を研究するためのPDXマウスモデルの改良を紹介します。導入化学療法による整形後の疾患再発と再発細胞の特徴を研究することを目指しています。NSGマウス株を使用して、ビンクリスチン、デキサメタゾン、L-アスパラギナーゼ、およびダウノルビシンの4剤の誘導様レジメンが標準化されました。この株は、Prkdcscid 変異と遺伝毒性ストレスに対する感受性の増加により、繰り返される化学療法サイクルに耐えることに限界があることが知られています12。したがって、動物の体重は治療毒性のマーカーとして監視されました。B-ALL再発モデルは、3つの主要なステップに分けることができます:(1)末梢血中の0.2〜1%ヒトCD45⁺細胞の生着閾値を目指す、マウスへのALL細胞の移植。(2) 4 週間の化学療法治療、その後最初の再発までの休息期間 (R1)。(3) R1 の検出時に、1 週間の導入型治療サイクルを繰り返しました。その後の再発(R2、R3...RN) が発生する可能性があり、治療と再発の間隔 (Δt) が記録されます。Δtの進行性短縮は、後天的な薬剤耐性の兆候として解釈されます。再発メカニズムのより詳細な調査の一環として、B-ALL 細胞はプロトコルのさまざまな段階の前後に収集される場合があります。再発発生から細胞回復までの時間によっては、この現象の固有のメカニズムが保存されない可能性があることを強調することが重要です。この点から、再発確認後、迅速に再発細胞を採取することが極めて重要です。収集された細胞は、細胞周期のダイナミクス、細胞遊走、白血病開始細胞頻度、染色体変化、エピジェネティックな修飾などの評価を含む、将来の表現型および遺伝的分析に使用できます。

この記事では、再発マウスモデルの説明に焦点を当てます。移植、最初の再発までの治療 (R1)、および複数回の再発までの周期的治療 (R2、R3...) の 3 つの実験段階について詳細な情報が提供されます。このモデルにより、研究者が多様なサブタイプから化学療法抵抗性のB-ALL細胞を生成できるようになり、再発に関連する細胞および分子の変化をより深く調査できるようになることを願っています。最終的には、これは耐性メカニズムの理解を深め、より効果的で個別化された治療法の開発を促進する可能性があります。

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プロトコル

すべての動物実験は、Centro Infantil Boldrini の Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA/Boldrini 0047-2024) の規制および倫理ガイドラインに従って実施されました。この研究で使用された白血病サンプルは、インフォームドコンセントフォームを通じて細胞の使用を許可したCentro Infantil Boldriniで治療された患者のバイオバンクバイアルから採取されました。このプロジェクトは、施設倫理委員会 (CAAE 34601120.7.0000.5376) によって承認されました。

1. 白血病細胞移植と生着モニタリング

  1. マウス移植のための白血病サンプルの調製
    1. 患者の骨髄吸引液から採取したALL細胞の以前に凍結保存されたサンプルを解凍します。37°Cに設定したウォーターバスを使用してください。 クライオチューブを円を描くように動かしてサンプルを解凍します。
    2. 解凍したサンプルを15 mL遠心分離管に移します。14 mLの1x滅菌PBSをサンプルに加えて細胞を洗浄し、凍結保存液を除去します。チューブを300 x g で5分間遠心分離します。上清を取り除きます。
  2. 移植液の調製
    1. 解凍した細胞を滅菌1x PBSに再懸濁します。移植する動物ごとに100 μLのPBSの容量で5-10 x 106 個の生細胞を使用します。移植するまで移植液を氷の上に置いてください。
      注:細胞は、半自動法13に従ってカウントされました。
  3. マウス移植
    1. 生後2か月のオスまたはメスのNODを選択します。白血病移植のためのCg‐PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)マウス
      注:動物の性干渉のない均質な実験デザインを維持するために、ALLサンプルをマウスの性別の両方に移植し、すべての良好な白血病と不良の反応白血病が雌雄で等しく代表されるようにしました。その結果、雌マウスは雄マウスよりも早く生着することがわかりました。それを考慮して、将来の分析(生着動態など)でマウスの性別が干渉する可能性を回避するために、同じ白血病サンプルを扱う場合は、1つのマウスの性別のみを使用することをお勧めします。一方の性別を他方の性別よりも優先的に選択するために、他のパラメーターは使用されませんでした。
    2. 動物を適切に封じ込めるために、一度に 1 匹のマウスを安全で承認されたネズミ捕り器に入れます。動物の尻尾がトラップの外側にあり、移植のために簡単にアクセスできることを確認してください。
      注:白血病細胞は、静脈内(i.v.)注射によってマウスに移植されます。確立されたプロトコルは、この目的のために尾の側静脈を使用します11。
    3. 赤外線を使用して、適切な静脈拡張を確保します。滅菌された鋭利な使い捨て注射針を使用して、100 μLの移植液を注入します。移植されたマウスは、特定の病原体のない施設に保管してください。15日間休ませてください。
      1. 赤外線を使用するには、すでに拘束されている動物をケージの外に置き、光から30cm離してください。潜在的な光パワーに応じて、露光時間を調整します。中出力のライトを使用する場合、静脈の拡張を確実にするには 5 分間で十分です。尻尾を長時間露出したままにしておくと、動物に火傷やストレスを引き起こす可能性があります。
      2. 注射には、容量1 mL、針サイズ12.7 mm x 0.33 mmの針が取り付けられたインスリン注射器を使用します。使用する針の仕様は、 材料表に記載されています。マウスを12時間/ 12時間の明暗サイクルレジメンで維持します。さらに、この研究で使用した動物を、環境を豊かにしたオートクレーブ可能な半透明の琥珀色のポリカーボネートケージに収容し、巣を作ります。
  4. 末梢採血
    1. 接種後2週間後、およびその後毎週、各マウスから50 μLの末梢血サンプルを採取します。
    2. 左手で動物を手動で拘束し、頭がしっかりと保持されていることを確認します。右手で、滅菌された鋭利な使い捨てランセットを使用して、動物の顎下神経叢の顔面静脈に穴を開けます。
      注:これはマウスにとって潜在的に有害な手順であり、慎重に行う必要があります。
      1. 拘束中は動物が呼吸しやすいことを確認してください。呼吸数の変化(息切れ)と口の色の変化(紫や濃い青にならないようにしてください)に注意してください。顎下神経叢が正しく穿刺されていない場合、外耳道穿刺により耳の出血が発生する可能性があります。将来の実験者を導くために、神経叢の適切な位置を確保するために補 足図1 が利用可能です。
        注:別の方法として、尾静脈出血を使用して血液サンプルを採取することもできます。
    3. 収集後は、動物を放置しないでください。それはアクティブで無傷でなければなりません。マウスが転倒(頭または体)や活動をしない兆候を示した場合は、安楽死させる必要があります。血液量が多いと動物が死に至る可能性があるため、50 μLの容量を超えないようにしてください。
    4. サンプルの凝固を避けるために、採取した血液サンプルを8 μLの50 mM EDTAを含む1.5 mL遠心分離管に保管します。
      注:ここでは、以前に調製したEDTA溶液を抗凝固剤として使用しました。必要に応じて、採血用の市販の少量EDTAチューブもこのステップで使用できます。血液サンプルは同日に処理する必要があります。
  5. 処理用の末梢血サンプルの調製
    1. EDTAで血液を均質化します。50 μLの混合物をフローサイトメトリーチューブに移します。
    2. 抗マウスCD45抗体(mCD45)、抗ヒトCD45抗体(hCD45)、抗ヒトCD19抗体(hCD19)、および希釈液としての滅菌1x PBSからなる抗体混合物を各サンプルに添加する抗体混合物を調製します。
  6. 血液サンプル処理
    1. 各血液サンプルに10 μLの抗体混合物を加えます。人差し指で軽くたたいて均質化します。光から遮断した室温で30分間インキュベートします。
      注:サイトメーターの利用可能なチャネルを考慮して、上記の適切な抗体を選択してください。サンプルあたりの使用される抗体の量を決定するには、各抗体の滴定曲線を実行することを検討してください。私たちの研究で使用された抗体、蛍光色素、およびサンプルに選択された容量を 補足表1にリストします。抗体カタログ番号とクローン名の完全な説明は、 材料表に記載されています。
    2. 市販の1x赤血球(RBC)溶解液を各サンプルに1 mL加えます。人差し指で激しく均質化します。光から遮断して室温で15分間インキュベートします。
      注:このステップで使用される溶解液は、市販の10倍RBC溶解液です。別の試薬を使用する場合は、溶解の1倍作業量を調整する必要があります。
    3. 最初の洗浄ステップで、各サンプルに2 mLの滅菌1x PBSを加えます。サンプルを室温で200 x g (スイングローター内)で5分間遠心分離します。上清を反転させてそっと捨て、ペーパータオルでやさしく吸い取ってチューブ上部に残っている液体を乾かします。
      注:洗浄ステップでは、白血病細胞はサイトメーターチューブの底でペレット化され、残りの液体は廃棄されます。場合によってはペレットが識別できない場合があるため、サンプルを取り扱う際には注意が必要です。ペレットの完全性を確保するために、サンプルを振るとサンプルが失われる可能性があるため、避けてください。
    4. 手順 1.6.3 を繰り返します。白血病細胞を200 μLの滅菌1x PBSで再懸濁し、サイトメトリーチューブを人差し指で軽くたたきます。サンプルはフローサイトメトリーで分析する準備ができています。生着モニタリングは採血と同じ日に実施する必要があります。
  7. フローサイトメトリーによる生着モニタリング
    1. 標準的なフローサイトメトリー方法論9,14を採用して、マウスCD45+細胞に対する末梢血中のヒトCD45+細胞の割合(%hCD45+)を決定します。
    2. フローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用して、全CD45細胞(hCD45+とmCD45+)に対するhCD45+の割合をその後分析するために、フローサイトメトリーによって生成されたデータを収集します。
      注:生着を適切に監視するために、次の分析手順を同じ日に実行する必要があります。この毎日の順序は、将来の治療スケジュールの開始を検討する場合に特に重要であり、月曜日から開始することをお勧めします。月曜日に開始することが不可能な場合、末梢血のhCD45 + %(0.2%-1%)の達成に応じて、治療はどの曜日でも開始できます。
  8. フローサイトメトリーデータ解析のための環境整備
    1. フローサイトメトリー解析ソフトウェアを発売します。収集したデータをインポートし、ツールによる認識を待ちます。
    2. 最初のサンプルのデータを開き、リンパ球とラベル付けされたゲートを作成します。軸設定の確認:X軸に FSC-A 、Y軸に SSC-A を選択します。上部ゲート作成パネルで、ポリライナーツールを選択し、メインセル集団の輪郭を描きます。
      注:リンパ球は通常、X軸に50,000〜100,000、Y軸に0〜50,000の間に現れます。各白血病の特徴によって値が異なる場合があります。
    3. ゲート人口をダブルクリックして、新しいゲートを作成します。セルダブレットを除外するには、X軸にFSC-A、Y軸にFSC-Hを設定します。ポリライナーツールを使用して、初代細胞集団を単離します。X 軸に沿って遠く離れたイベントを除き、母集団の周囲にゲートを近づけます。
      注:このステップでは、個々のセルイベントを区別します。
  9. 細胞集団を区別するためのサイトメトリーパネルの作成
    1. 選択した集団をダブルクリックして、ヒトCD45細胞とマウスCD45細胞を区別します。X軸をmCD45蛍光色素に、Y軸をSSC-Aに設定します。形状ツールを使用して、mCD45 陰性母集団の周囲に正方形を描きます。
    2. 結果の集団をダブルクリックして、hCD19+および/またはhCD45+細胞を区別します。X軸をhCD19蛍光色素に、Y軸をhCD45に設定します。ゲート作成パネルで、[垂直線]を選択して、個別の母集団を分離します。
      注:別の方法として、研究者は、hCD45およびmCD45細胞を識別するためのゲートまたは可能性を使用できます。この可能性では、イベントの合計が 100% と見なされ、集団を特定するためのより正確な戦略が作成されます。
  10. 作成されたパネルへの統計の適用
    1. 獲得したすべてのイベントに対する各単離細胞集団の割合を計算します。ソフトウェアのメインウィンドウで、各サンプルのメイングラフから派生した サブグラフ アイコンを右クリックし、[ 統計量の作成]を選択します。開いたウィンドウで、[ 頻度] をクリックし、[ 単一セル]を選択します。このステップは、サブグラフごとに個別に実行します。
    2. ゲーティング戦略と関連する統計量をすべてのサンプルに適用するために行われたすべての変更を選択します。次に、マウスの左ボタンを使用して、選択した変更をメインソフトウェアウィンドウの[すべてのサンプル]オプションにドラッグします。
    3. メインウィンドウの 「テーブルエディタ 」をクリックして、計算されたすべての頻度を含むテーブルを生成します。ポップアップウィンドウで、 .xlsファイル形式を選択し、保存先フォルダーを指定して、[ テーブルの作成]をクリックします。
      注:フローサイトメトリー分析ソフトウェアを使用して実行されたすべてのステップは、 補足図2で視覚化できます。このステップによって生成された最終的な表には、経時的な生着進行を分析するためのグラフを生成するために必要なhCD45+の割合が含まれています。
  11. 生着進行のプロット
    1. グラフプロットおよび分析ソフトウェアを起動します。 XY テーブル形式を選択します。 メインウィンドウで、[ 入力]または[新しいテーブルにデータをインポート]を選択し、Xを[数値]に設定し、[Y]を[並べてサブ列に複製値を入力]に設定します。
    2. 開いたテーブルで、列タイトルを整理します:X列には生着日数を入力し、Yサブ列の最初のグループにはPB上の%hCD45+を入力します。生着モニタリングのための採血日に対応する注射後の日数をX列に記入します。各マウスの毎週収集されたhCD45+データの割合をYサブ列に手動で入力します。
    3. ソフトウェアメニューの[ファミリ]サブセットで、[ データ1]を選択します。ポップアップウィンドウで、[ ポイントと誤差線の接続線]という名前の2番目のグラフオプションを選択し、平均線と誤差線のプロットを有効にします。
    4. グラフの軸を目的の範囲に調整します。メニューの右上隅にある [エクスポート] をクリックして、最終的なグラフをダウンロードします。
      注:単一のALLを使用した実験中に収集されたすべてのデータは、実験の開始以来の経時的な分析を容易にするために、同じグラフにプロットする必要があります。グラフプロットの説明例を補 足図3に示します。

2.マウスの治療

  1. 薬物作動溶液の調製
    1. 1 mg / mLの濃度でビンクリスチン作業溶液を調製します。4 mg / mLのデキサメタゾン作業溶液を調製します。L-アスパラギナーゼ作業溶液を2,000 IU/mLで調製します。ダウノルビシン作業溶液を2 mg / mLで調製します。
      注:このプロトコルで使用される薬物は、患者15の臨床治療で使用される薬物と同等です。デキサメタゾン作業溶液ビヒクルは、クレアチニン、クエン酸ナトリウム二水和物、水酸化ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、および注射用水で構成されています。ビンクリスチン作業溶液ビヒクルは、マンニトール、硫酸、水酸化ナトリウム、および注射用水で構成されています。L-アスパラギナーゼとダウノルビシンは、凍結乾燥された形で入手できることがよくあります。このような場合、再構成に推奨されるビヒクルは注射用の滅菌水であり、正しい濃度を達成するために使用する必要があります。解凍の繰り返しサイクルによる薬物活性の損失を防ぐために、薬物は3回以下で使用される作業アリコートに分割する必要があります。
  2. 白血病が検出されたときの体重を量る動物
    1. マウスの末梢血中のhCD45+細胞の割合が0.2%から1%の中央値の範囲に達した時点で治療を開始します。そこに到達したら、移植されたマウスを 2 つの異なるグループに分けます: 1 つは治療を受けるグループ、もう 1 つは対照として機能します。
    2. 確立された閾値に達したら、白血病の進行を毎週監視し続けます。hCD45% データを継続的に収集して、治療に対する反応性、再発の発生、薬剤耐性の検出を監視します。
    3. 治療する動物の体重を量ります。重みの算術平均を使用して、グループに投与される各薬剤の用量を確認します。対照群の動物の体重を量り、グループ間の体重増減を比較します。
      1. 次の薬物用量を使用してください:ビンクリスチン、0.15 mg / kg;デキサメタゾン、5 mg/kg;L-アスパラギナーゼ、1,000 IU/kg;ダウノルビシン、1.2 mg/kg。すべての動物の体重を少なくとも週に 3 回、月曜日、水曜日、金曜日に測定します。重みを使用して、薬物の治療用量を調整し、治療毒性のレベルを監視します。
  3. 作業溶液アリコートからの薬物投与液の調製
    注:薬物投与液は、希釈剤としての滅菌1x PBSと、曜日ごとに投与される正しい量(動物の体重による)の作動薬物溶液(滅菌水は注射用ではなく再構成専用に使用されます)で構成されています。腹腔内に投与される薬物は、同じ溶液に結合することができます。ただし、薬物を静脈内投与する場合は、個々の溶液に入れる必要があります。各動物に投与する薬剤投与液の量は100μLである。
    注:上記のステップでは、針が取り付けられた滅菌インスリン注射器(1 mL、針の寸法12.7 mm X 0.33 mm)を使用しました。シリンジの完全な説明は 、材料表に記載されています。
    1. 月曜日に、デキサメタゾン、ビンクリスチン、PBSからなる薬物投与液を準備します。薬を腹腔内に投与します。
    2. 火曜日と木曜日に、デキサメタゾン、L-アスパラギナーゼ、PBSからなる薬物投与液を調製します。薬を腹腔内に投与します。
    3. 水曜日に、デキサメタゾンとPBSからなる薬物投与液を調製し、腹腔内投与します。ダウノルビシンとPBSからなる2番目の薬物投与液を調製します。静脈内投与します。
    4. 金曜日に、デキサメタゾンとPBSからなる薬物投与液を準備します。薬を腹腔内に投与します。
    5. 週末は動物を休ませてください。治療のサイクルを4週間繰り返します。
      注:包括的な治療スケジュールは、 補足表2に記載されています。マウス治療のためにすでに確立されている他のプロトコルがテストされたが、NSG株に対して高レベルの毒性をもたらしたことを明らかにすることが重要です。したがって、提案された治療スケジュールは、最初に毒性を軽減するための標準化プロセスに提出され、その結果、このプロトコルで提示された投与の用量と頻度が生まれました。治療投与により、治療群のhCD45+の割合は対照群のhCD45+の割合と比較して減少すると予想されます。
  4. 白血病反応性の薬物投与とモニタリング
    1. 左手で動物を手動で拘束して、腹腔内に薬物を投与します。腹側部分を上にして動物を保ちます。腹側部分で、右下象限を見つけます。
    2. 右手で、滅菌された鋭利な使い捨て注射針を使用し、100 μLの薬物投与液をマウスの右下象限に注入します。
      注:動物を拘束するときは注意してください。それはマウスにとって有害な手順であってはなりません。採血と同様に、呼吸器合併症に注意してください。腹腔内注射の場合は、臓器の穴あけを避けるために、常に針を垂直に保持してください。
    3. 白血病細胞を移植して静脈内投与するために使用するのと同じ指示に従ってください。治療投与の4週間後、ALL細胞が再出現するまでマウスを休ませます(ここでは最初の再発(R1)と呼ばれます。
      注:投与経路の違いにもかかわらず、静脈内注射は腹腔内注射と同じ量を使用します。
  5. 白血病反応性のモニタリングと初回再発の検出 (R1)
    1. 治療期または安静期に白血病の毎週のフローサイトメトリーモニタリングを中止しないでください。
      注: 週 5 日の治療を考慮すると、週の初めにモニタリングを行うことを強くお勧めします。私たちの研究では、採血、サンプル処理、および分析は常に月曜日に行われました。
    2. ステップ 1.4 から 1.11 に従って、モニタリングに必要な採血およびその後の手順を実行します。
      注:所定の休止期間の後、R1細胞は、マウスの末梢血中のhCD45+の割合の急激な増加によって検出されます。治療の終了から再発の発生までの期間はさまざまであり、スクリーニングされた白血病ごとに異なる場合があります。R1の検出時に、提案された再発のマウスモデルの第3段階と最終段階を実行する必要があります。モニタリングと反応分析を改善するために、Randall et al. (2024)16 によって記述されたガイドラインに従って、進行性疾患、安定した疾患、反応性レベル (部分的、完全、または維持)、寛解、耐性などの客観的な反応尺度を使用することをお勧めします。

3. 耐性細胞が出現するまで治療サイクルを繰り返す

  1. 最初の再発の検出
    1. 白血病再発(R1と名付けられた)を有するマウスに、すなわち末梢血中の0.2%hCD45+の閾値に達したときに、1週間の導入型治療を投与する。月曜日から金曜日までの1週間は、4週間の導入型治療に用いる薬物投与スケジュールに従ってください。
      注: この時点でのわずか 1 週間の治療の投与は、白血病細胞が化学療法に対する耐性を獲得したかどうかを in vivo でテストすることを目的としていますが、最終的には化学療法の圧力下で、時間の経過とともに白血病の進行を連続して再発させます。私たちは、過度の毒性と動物の損失を避ける手段として、2 回目の 4 週間のスケジュールを実施しないことにしました。
    2. 薬物投与の丸1週間の終わりにマウスを休ませます。ステップ1.4〜1.11に従って、フローサイトメトリーによる白血病反応の毎週のモニタリングを継続します。
      注:この時点で、白血病細胞は治療に反応し続けることが期待されます。その結果、白血病をモニタリングする場合、マウスのhCD45+の割合は減少し、一定期間陰性のままであるはずです。
  2. R2 外観の監視
    1. 再発R2が現れるのを待ちます(hCD45+細胞≥0.2%)。それが現れたら、治療の終了からR2の出現までの経過時間を数えます。この期間をΔt1と呼びます。
    2. 導入型治療の2週間目に進みます。このスケジュールの最初の管理と同じガイドラインに従ってください。
    3. 治療の最後にマウスを休ませます。白血病のモニタリングを継続します。
  3. R3 外観の監視
    1. 再発 R3 が表示されるのを待ちます。手順 3.2.1 と同じ方法で時間をカウントします。それをΔt2と呼びます。
    2. Δt1とΔt2を比較します。上記の手順を N 回繰り返して、複数の白血病再発 (R1、R2...RN)Δt周期が同じままである場合。Δt期間が短くなったら治療サイクルを中止します。
      注:再発に対するΔtの減少は、白血病細胞によって得られる薬剤耐性の兆候です。この結果は、化学療法抵抗性ALL細胞を生成する再発マウスモデルの能力を強化します。
    3. 以下のステップ4で説明するように、白血病細胞を回収します。凍結保存または意図された後続の分析と互換性のある防腐剤によって生きたまま保管してください。
      注:白血病細胞の回復に推奨されるイベントは、最近の文献16で説明されているように、末梢血中のhCD45+の最大25%です。

4. 臓器摘出による白血病細胞の回復

  1. 化学麻酔薬の過剰摂取によるマウスの安楽死
    1. 化学麻酔薬の過剰投与によってマウスを安楽死させ、その後、以下に説明するように安楽死を確認するために子宮頸部脱臼を行います。
    2. 深部麻酔用に滅菌1x PBSで希釈した3つの麻酔薬を含む混合物を調製します。安楽死させる動物ごとに、市販のマレイン酸アセプロマジン150 μL、市販のキシラジン50 μL、市販のケタミン80 μL、およびPBS 220 μLを使用します。
    3. 調製した混合物500 μLを腹腔内注射で投与します。手順2.4で説明されているのと同じ拘束および注射のガイドラインに従ってください。
    4. 化学麻酔薬の過剰摂取の影響下で、マウスはケージの底に横たわります。数分後、マウスが呼吸停止しているかどうかを観察します。その場合は、呼吸努力が止まるのを待ちます。安楽死手順が効果的であったことを確認するには、動物の後ろ足の片方に圧力を加えて、不随意反射の存在を確認します。安楽死を確認するには、子宮頸部脱臼に進みます。
  2. 頸部脱臼
    1. 体の後部をケージの飼料格子に当てて動物を持ちます。左手の人差し指と親指を使ってピンセットの形を作ります。ピンセットの形をした指を動物の頭の真下に置きます。背骨の頸部をしっかりと押します。
    2. 右手で動物の尻尾をつかみます。動物の頭が体の他の部分から離れるまで、しっかりと安定した動きで引き戻します。
      注: 子宮頸部脱臼は、安楽死を確認するために受け入れられている方法の 1 つです17、18、19。呼吸停止後、少なくとも 15 分間 CO2 への継続的な曝露など、他の方法を代替として使用できます。
  3. 臓器摘出のための動物の準備
    1. マウスの全身に70%のアルコールを塗布して消毒します。動物の体をげっ歯類用の手術台の上に置き、腹側部分を上にします。体の腹部を剃ります。
      注:げっ歯類の外科手術プラットフォームの完全な説明は、 材料表に記載されています。
  4. 脾臓の採取
    1. 滅菌手術用ハサミとピンセットで腹部の皮膚に小さな切開を行います。腹膜を露出させて腹部から取り除きます。
    2. 腹膜に小さな切開を行います。腹部にある臓器に完全にアクセスできるまで切断します。
    3. 動物の胃のすぐ下にある脾臓を見つけます。脾臓を取り除きます。さらなる処理のために、滅菌された1x PBSを含むレシピエントに入れます。
  5. 大腿骨の採取
    1. 腹腔を開いて動物の後ろ足にアクセスします。
    2. 大腿骨を見つけます。骨盤の骨と脛骨と腓骨と結合する関節を切断して取り除きます。両方の大腿骨に対してこのプロセスを実行します。
    3. 残っている筋肉、皮膚、組織を取り除いて骨をきれいにします。さらなる処理のために、滅菌された1x PBSを含むレシピエントに入れます。動物の死骸は、動物倫理委員会のガイドラインに従って廃棄してください。
      注: 研究の目的に応じて、肝臓、中枢神経系、胸腺、リンパ節などから ALL 細胞を収集することもできます。この原稿では、例として、脾臓と骨髄からのすべての細胞の収集について説明します。
  6. 臓器処理の準備
    1. 50 mL滅菌遠心分離管1本、1 mL滅菌シリンジ2本、滅菌25 mm x 0.6 mm皮下注射針1本、滅菌70 μm細胞ストレーナー2本を集めます。
  7. 脾臓処理
    1. 開いた50 mL遠心分離管の上部に1つのセルストレーナーを置きます。脾臓を細胞ストレーナーの表面に置きます。シリンジプランジャーの平らな部分で臓器を浸軟させ、大部分が見えなくなるまで浸軟させます。
    2. 浸軟した脾臓に滅菌1x PBSを加えます。シリンジプランジャーの平らな部分で円を描くように動かし、細胞のろ過を確実にします。
      注:PBSの注入は徐々に行うことができます。ただし、最終的な使用量は6mLを超えることはできません。脾臓処理が完了すると、細胞ストレーナーは透明で、残留組織がないはずです。セルストレーナーが飽和した場合は、代替のセルストレーナーを使用することが可能です。最初のストレーナーの内容物を2番目のストレーナーに移し、その後処理を続けることができます。この臓器内の腫瘍量にアクセスするために、脾臓の一部を分離して組織病理学的評価を行うことができます。
  8. 骨髄処理
    1. すでに使用されている遠心分離管に骨髄処理用の新しい細胞ストレーナーを組み込みます。骨髄の開口部にアクセスできるまで、大腿骨の端を切断します。皮下注射針を新しい注射器に挿入します。1 mLの滅菌1x PBSをシリンジに加えます。
      注: 研究の目的に応じて、脾臓と骨髄から得られたすべての細胞を別々に収集する必要があります。この場合、組織ごとに別々の遠心分離管を使用する必要があります。大腿骨の一部を分離して、組織病理学的評価を行い、この臓器内の腫瘍量を評価することができます。
    2. 細胞ストレーナーの上で骨髄フラッシュを実行します。針先を骨髄開口部の片側に挿入します。シリンジプランジャーをしっかりと一定の動きで押します。もう一方の大腿骨でも手順を繰り返します。
    3. 針を切り離します。注射器の平らな部分を利用して、洗い流した骨髄を浸軟させます。滅菌した1x PBSを浸軟した骨髄に加えます。シリンジプランジャーの平らな部分で円を描くように動かし、細胞のろ過を確実にします。処理手順が完了すると、50 mL 遠心分離管には、PBS で希釈された脾臓細胞と骨髄細胞の混合物を含む総容量 10 mL が含まれます。
      注:PBS注入プロセスは段階的に実行できます。ただし、最終的な使用量が 2 mL を超えないようにすることが不可欠です。

5. 勾配遠心分離による白血病細胞の単離

  1. 白血病細胞単離の準備
    1. 15 mL遠心分離管1本、滅菌使い捨てパスツールピペット、処理された臓器を含む50 mL遠心分離管、およびリンパ球単離用の密度勾配培地を集めます。
      注:培地は、遠心分離によって密度勾配を作成することにより、単核細胞の単離を容易にします。単核細胞(リンパ球、単球、およびALL細胞)は、培地と血漿の間の界面に層を形成します。
  2. 白血病細胞の分離
    1. リンパ球単離用の密度勾配培地5 mLを、使い捨てパスツールピペットを使用して15 mL遠心分離管に加えます。脾臓細胞と骨髄細胞の混合物10 mLを培地層上に徐々に加えます。チューブを約30°以下の浅い角度で持ち、密度媒体層が乱れないようにチューブ壁に沿ってセル混合物をゆっくりと加えます。
      注:このプロセス中は、細胞が密度培地と混合しないように注意してください。このプロセス中の外乱は、遠心分離中の密度勾配形成の失敗につながる可能性があります。
    2. 形成された相を乱さないように、スイングバケットローター上で15 mLチューブを420 x g で30分間、加速や中断なしで遠心分離します。
      注:白血病細胞は、密度培地と水相の間に層を形成します。
    3. 滅菌使い捨てパスツールピペットを使用して、上部の水相を取り除き、廃棄します。滅菌使い捨てパスツールピペットで形成された白血病細胞の層を収集します。新しい15 mL遠心分離管に移します。
      注:低密度培地層の一部が白血病細胞と一緒にピペッティングされても心配しないでください。
  3. 白血病細胞洗浄
    1. 15 mLの限界に達するまで、採取した細胞を含むチューブに滅菌1x PBSを加えます。
    2. 細胞を300 x gで5分間遠心分離します。最大の加速とブレーキを回復します。上清を取り除き、廃棄します。細胞を新しい滅菌コールド1x PBSに再懸濁します。5.3.3.細胞および細胞の生存率チェックに進みます。標準的な細胞数手順ガイドラインに従ってください13.洗浄した細胞を抗マウスCD45抗体(mCD45)、抗ヒトCD45抗体(hCD45)、および抗ヒトCD19抗体(hCD19)で染色し、続いて洗浄ステップとデータ取得を行うことができます。
      注:脾臓細胞と骨髄細胞を異なる遠心分離管で処理する場合、これらのサンプルの一部を使用して、フローサイトメトリーを介してこれらの臓器内の腫瘍量にアクセスできます。
  4. 白血病細胞凍結保存
    1. 300 x g で5分間遠心分離して細胞をペレットダウンします。上清を捨てます。細胞を氷の上に置いてください。
    2. 90%滅菌冷たウシ胎児血清(FBS)と10%ジメチルスルホキシド(DMSO)からなる凍結培地を調製します。凍結保存バイアルごとにこの溶液を 1 mL 使用します。
    3. 氷上で、調製した溶液に細胞を2 x 107 細胞/ mLの濃度で再懸濁します。細胞を凍結保存チューブに分注します。標準的な細胞培養凍結保存ガイドラインに従った凍結保存細胞20.
      注:これらのセルは、さらなる分析に使用できます。生細胞を凍結する代わりに、その後のDNA、RNA、タンパク質、および代謝産物の分析のために、細胞をさまざまな防腐剤に分注して保存することもできます。

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結果

私たちの研究の文脈では、前駆体B細胞ALLサンプルは2つの患者グループから選択されました:1つは、8日目の末梢血に白血病細胞が存在せず、15日目、33日目、および78/96日目に骨髄に残存白血病細胞がないことによって決定されるように、良好な反応を示しました。もう一方のグループは、 表 1 に示すように、微小残存病変 (MRD) によって評価された臨床反応が不十分な患者から得られた、以前のグループの分子サブグループに一致する LL によって形成されました。

選択されたALLサンプルを尾静脈からNSGマウスに移植し、末梢血のフローサイトメトリー分析によって毎週監視しました。フローサイトメーターからのデータは、ステップ1.7〜1.10で説明したように、フローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用して処理されました。ステップ1.11で概説したように、動物の末梢血...

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ディスカッション

腫瘍性疾患の根底にある生物学的メカニズムを理解することは、より効果的な治療法を開発し、患者の転帰を改善するために不可欠です。小児急性リンパ芽球性白血病などの症状では、これらの調査アプローチは治癒率の向上に関連するだけでなく、標準治療が治療強度と忍容性の限界に達している患者にとっても特に価値があります。再発と治療抵抗性の設定では、化学療法レジメンを調整するだけでは、もはや課題に対処することはできません。代わりに、耐性の分子的および細胞的メカニズムを明らかにする必要があり、現在の限界を克服できる新しい治療薬の開発に役立つ可能性があります。

再発と治療抵抗性の根底にあるメカニズムを解明するには、堅実で生理学的に適切な実験モデルの開発が不可欠です。これらの中で、動物モデル、特にマウスシステムは、in vivo微小環境内で白血病の進行を調査するための独自のプラットフォームを提供し、他の方法ではin vitroではアクセスできない生物学的ダイナミクスの探索を可能にします。患者由来異種移植片(...

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開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

Centro Infantil Boldriniと、この研究のためにサンプルを提供してくださったすべての患者に感謝します。マヌエラ・M・ホフは、サンパウロ研究財団からCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil(CAPES)からフェローシップを受けました(FAPESP、2024/ 03383-2)。ホセ・A・ユネスは、技術科学開発の国家顧問から生産性フェローシップを受賞しました(CNPq、308399/2021-8)。この研究は、PRONON プログラム (Programa Nacional de Apoio à Atenção Oncológica、NUP 25000.211174/2019-45) によるブラジル保健省からの研究資金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 mL  注射器BD #309628臓器摘出
注射用10mLの滅菌水ハレックス・イスタル・インドゥアキュート;stria Farmaceutica LTDAhttps://www.medstoremaringa.com.br/produtos/agua-destilada-10ml-pack-c-5un-isofarma/薬物再構成
10X 赤血球溶解液バイオレジェンド#420302マウス血液サンプルの処理
5チャネルセルアナライザーBDバイオサイエンス658226R1フローサイトメーター 
70 μMセルストレーナーファルコム#352350臓器摘出
アセプロマジンマレート Inj ヴェトニルLTDAhttps://vetnil.com.br/produto/acepran-r-1マウス麻酔
APC抗ヒトCD45 - アイソタイプマウスIgG1 - HI30クローンバイオレジェンド#304037リンパ球染色
アスパラギナーゼ10000 Uアギナーゼ/メダック#88660100マウス治療
Brilliant-Violet 605 アンチマウス CD45 - アイソタイプマウス IgG2 - 30-F11 クローンバイオレジェンド#103139リンパ球染色
ダウノルビシンファルマリン#116880025マウス治療
デキサメタゾン痛いほど;#00000066マウス治療
ジメチルスルホキシドシグマ・オルドリッチ#589569リンパ球凍結保存
使い捨て針 - 0.60 x 25 mm(23G x 1'’)BD#300388臓器摘出
エステリル使い捨てランセット 燕成慧大医療機器 https://www.cralplast.com.br/produto/lanceta-manual/マウスの血液採取
エチレンジアミネテトトレース酸生命技術#15576-O28EDTA解
胎児用牛血清カルティラブ#F083リンパ球凍結保存
フローサイトメトリーソフトウェア解析 - バージョン 10.10.0BDバイオサイエンスhttps://www.flowjo.com/フローサイトメトリー解析
グラフおよびプロッティングソフトウェア解析 - バージョン9.5.1ドットマティックスhttps://www.graphpad.com/featuresグラフプロットと解析
インスリン注射器(針付き)1mL FX 12.7 mm X 0.33 mmデスカーパックe0342101マウス移植と薬物投与
ケタミン・インジSespo Indúストリア・エ・コム&エカテ;RCIO LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/dopalen-pecuaria/マウス麻酔
齧歯類用の多機能手術プラットフォームケント・サイエンティフィック・コーポレーションhttps://www.kentscientific.com/products/surgisuite/マウスの手術
PE抗ヒトCD19 - アイソタイプマウスIgG1 - HIB19クローンバイオレジェンド#302208リンパ球染色
塩化カリウムシグマ・オルドリッチP3911-1KGPBSソリューション
リン酸カリウム二塩基性シグマ・オルドリッチP0662-1KGPBSソリューション
リンパ球分離試薬シチバ#17-1440-02、6セットセット&時間;100 ミリリットル摘出臓器からのリンパ球分離
塩化ナトリウムシグマ・オルドリッチS9888-1kgPBSソリューション
リン酸ナトリウム二塩基性ナトリウムおよびシグマ・オルドリッチS9763-1KGPBSソリューション
無菌解剖学的ピンセット - 12 cm ABC 0170ラボL&アキュート;デア120手術用マウスの手技
滅菌ハサミ 12cm - ABC 0321ラボL&アキュート;デア136手術用マウスの手技
ビンクリスチンリブス#7896094208483マウス治療
キシラジンINJSespo Indúストリア・エ・コム&エカテ;RCIO LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/anasedan-10-ml-bovinos-e-equinos/マウス麻酔

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