走査型電子顕微鏡互換光学イメージング法によるメソスコーピック全細胞脳マッピング

Summary

私たちは、光学多層干渉断層撮影(OMLIT)という新しいイメージング技術を導入し、脳標本内のすべての細胞をメソスケールで偏りなくイメージングでき、同じサンプル上のテープベースのシリアル走査型電子顕微鏡のイメージングワークフローにシームレスに統合できます。

Abstract

脳内の複雑な神経ネットワーク内の構造的および機能的関係を理解するには、広い視野と細胞内分解能の両方を持つ脳アトラスの構築が必要です。しかし、現在の光学顕微鏡および電子顕微鏡のイメージング方法にはそれぞれ制限があり、単一の試料内のすべての細胞を撮像するのは困難です。このプロトコルでは、光学多層干渉断層撮影(OMLIT)と呼ばれるイメージング技術を導入し、電子顕微鏡サンプルの準備後に作成された脳標本のすべての細胞を無差別に光学イメージングし、すべての神経細胞の完全な脳アトラスを再構築します。さらに、OMLITイメージングは自動テープ収集型ウルトラミクロトミー走査型電子顕微鏡(ATUM-SEM)のイメージングワークフローとシームレスに統合可能です。これにより、電子顕微鏡撮影前に細胞のメソスケール構造情報を取得でき、関心領域の正確な選択が可能となり、高分解能電子顕微鏡(EM)イメージングに必要な面積とデータ量を大幅に削減できます。この手法の正確性と適合性を成体マウスの大脳皮質の実際のサンプルで検証し、多スケール脳アトラス構築における広範な応用可能性を示しました。

Introduction

細胞および細胞内分解能での神経回路の包括的なマッピングは、脳の構造と機能を明らかにするために不可欠です。従来の光学イメージング手法、例えば二光子顕微鏡^1、蛍光微光学断層撮影(fMOST)^2,3,4、VISoRシステム⁵などは、メソスケール神経のイメージングや生体内機能イメージングを可能にしました。しかし、標識がまばらであるため、細胞全体の集団を捉えることはできません。一方、機能的光音響顕微鏡(fPAM)^6,7、光コヒーレンス断層撮影(OCT)⁸、定量位相顕微鏡⁹などのラベルフリー光学イメージング技術は、視野内のすべてのニューロンを同時に可視化する可能性を秘めています。しかしながら、これらの手法は通常、軸方向分解能が低く画像深さが浅いため、ハードウェアの複雑さから脳アトラス構築への広範な応用が妨げられています。これに対し、シリアルブロックフェイスSEM(SBF-SEM)^10,11、集束イオンビームSEM(FIB-SEM)12,13,14、自動テープ収集型ウルトラマイクロトミーSEM(ATUM-SEM)15,16,17などの連続断片電子顕微鏡(SSEM)技術がありますはナノメートル分解能で高密度なシナプス結合ネットワークを明らかにし、高解像度コネクトミクスに不可欠なツールを提供します。しかし、これらの技術は低スループット、長い取得時間、限られた視野、そして高いデータ処理および^{ハードウェアコストという}問題を抱えています。

上記の制約を克服するために、私たちは光学多層干渉断層撮影(OMLIT)というイメージング手法を開発しました。これは、超薄片上のすべての細胞を無差別・高コントラスト・広視野で撮像し、広範囲の組織領域でサブミクロン解像度を達成する低コストかつ高スループットのソリューションを提供します。同時に、OMLITはシリアルセクションSEMのワークフローとも本質的に互換性があります。高分解能電子顕微鏡が登場する前は、同じセクションの構造情報を提供し、正確なROIナビゲーションを可能にし、その後のEMイメージングに必要な面積とデータ量を大幅に削減します。OMLITはメソスケールイメージングレベルで独自の利点を持ち、異なる空間スケールの神経構造マップをつなぐ重要な橋渡し役を果たします。その非破壊性により、将来の特定の標識戦略との統合、例えばオスミウム耐性蛍光タンパク質¹⁹ を用いたサンプル調製やイメージングの可能性があります。この手法により、選択した脳領域のメソスケールイメージングが可能となり、神経の形態、量、分布、密度を迅速に把握できます。また、異なる脳領域のニューロン間の軸索投射や樹状突起の定量的特徴付けも促進します。画像結果で関心のある特定の領域 については、現場 超微細構造の詳細を電子顕微鏡でさらに調査できます。

OMLITのイメージング原理は、Hao Fan²⁰の研究で説明されています。簡単に言えば、イメージング中に超薄片、被覆層、集熱テープ、導電テープ、ウェハーが多層薄膜構造を形成します。平面波がこの構造と相互作用すると、反射波がさまざまな界面で生成され、検出空間内で重なり合い、反射率、屈折率、吸収の違いによる光学干渉が生じます。この原理に基づいて開発されたMATLABベースのシミュレーションプログラムは、実験結果とかなり一致していることを示しました。

OMLITイメージング方式は、テープ処理戦略に基づいて2つのタイプに分類できます。1つ目は高反射率戦略で、Cr、Cu、Al、Agなどの金属をテープ表面にコーティングし、細胞質領域や樹脂充填の血管腔で周囲よりも高い光学強度を実現します。2つ目は低反射率戦略で、無被覆カプトンテープ、D-50テープ、またはCNTコーティングPETテープを使用します。この場合、光学イメージングの結果は前者とは逆で、樹脂豊富な膜のない領域(例:細胞質や血管腔)が強度が低い状態で現れます。

私たちは体系的に要約し、2つの異なる画像診断戦略に合わせた標準化されたプロトコルを確立します。ここで紹介するプロトコルは、包括的かつ詳細な実験的手順を提供します。さらに、実験中に遭遇する一般的な問題点と提案された解決策もまとめられています。本研究では、低反射率戦略(805 × 857.5 × 11.66 μm³)で獲得したマウス皮質のデータセットを紹介し、OMLITイメージング手法の特徴と利点を示しています。

Protocol

すべての動物処置は、中国科学技術大学の機関ガイドラインおよび関連する国家規則に従って実施されました。OMLIT画像診断のサンプル調製は従来のEMと同じプロトコルに従い、我々が用いた具体的な手順は^{他の部分で}説明されています。簡単に言えば、麻酔後、マウスはカコジル酸ナトリウム緩衝液、人工脳脊髄液(ACSF)、最後にグルターアルデヒドおよびパラホルムアルデヒドを含む固定剤を順次心裏灌流しました。脳は慎重に取り出され、約1 × 1 × 1 mm³の脳組織ブロックが切開されました。その後、試料は化学的に定着され、連続的な重金属染色を受け、脱水され、樹脂に埋め込まれました。プロトコルの一般的なワークフローは 図1に示されています。

図1:ワークフローの概要。 (A) プロトコルで言及されている収集テープ(左から右へ:ポリイミド、D-50、CNTコーティングPET)。(B) トリミングサンプルの連続断片および採取。(C)収集した断片を含むリボンを円形のシリコンウェハーに取り付けること。(D)光学顕微鏡イメージング、スケールバー100μm。(E)カーボンコーティング。(F) 電子顕微鏡イメージングは 図1Dに示された領域に対応し、スケールバー:10μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

1. テープの準備

注意:以下の手順は、粉塵によるテープ汚染を防ぐためにクリーンルームで行うべきです。

1. 高反射率戦略
   1. Kapton(以下ポリイミドテープ、厚さ50μm)またはPanliteフィルム(以下D-50、厚さ50μm)を選び、モーター式巻線システムに取り付けます。ここでは、ポリイミドテープを例として用いています。
      注:本研究では、Arduinoボードを介して制御されるステッパーモーターで駆動され、テープをスパッタープラズマコーンを通してリールからリールへと走らせるモーター式巻線装置が使用されました。駆動リールにテープが蓄積し、巻き取り巻きの直径が増すことでテープの並行速度が増加するのを補うため、360°回転ごとに巻き取り巻き巻きの角速度を連続的に調整するプログラムが作成されました。
   2. マグネトロンスパッタリングシステム(ダブルヘッドスパッター)を用いて、均一な薄膜(またはアル、アス、銅などの他の金属)をテープ表面に堆積させます。最適な堆積のために、テープはスパッタリングターゲットから80mmの距離に位置します。直流電源で、99.99%アルゴンガスで調整された1.0 Paの圧力でプロセスを行います。
   3. テープ巻き速度を0.6 mm/sに設定すると、金属コーティングの厚さは50 nmにします。堆積後は、コーティング応力を最小限に抑えるため、チャンバーを高真空の室温(RT)までゆっくり冷却します。
      注意:同じテープの最適なコーティング厚さは使用される金属の種類によって異なります。テープの翻訳速度を調整し、50、70、100、150、200 nmなどの様々なコーティング厚さを実現します。
   4. スタイラスプロファイラー、原子間力顕微鏡、走査型電子顕微鏡を用いてコーティングの厚さと均一性を評価します。
   5. 80Wの出力でプラズマクリーナーを使い、テープの移動速度は7 mm/sで清浄し、親水性に仕上げます。処理後、テープ表面に付着した水滴は急速に薄膜に広がります(図2A)。
2. 低反射率戦略
   注:このプロトコルでは、D-50テープまたは市販のカーボンナノチューブ(CNT)コーティングされたポリエチレンテレフタレート(PET)テープの使用が可能です。後者は電子顕微鏡イメージング中に多少の背景ノイズをもたらす可能性がありますが、強くはありませんが、電磁図画像のセグメンテーションに影響を与える可能性があります。したがって、以下の説明ではD-50テープを例として使用します。
   1. D-50フィルムを準備し、シート全体を約7mm幅のテープにカットします。テープの露出した片側は部分を採取し、もう片面は擦り傷や汚染を防ぐためにマットフィルムで保護します。その後のシリコンウェハー取り付け工程でマットフィルムを取り外します。
   2. 多くのセクションを設置する場合は、D-50テープの異なるセクションをつなぎ合わせます。テープのセグメント間の継ぎ目は両面接着テープで固定します。
      注意:テープのセグメントを貼る際は、先頭のテープが両面テープを通じて上から下まで下に続くテープと重なるようにしてください。テープの巻く際に接着剤が押し出されるのを防ぐため、接着面積を最小限にし、テープの縁に余裕を残してテープを汚染する恐れがあります(図2B参照)。
   3. プラズマクリーナーを使ってテープを親水性に仕上げ、同じ手順で前述の効果を得ます。
      注意:金属コーティングとカーボンスパッタリングの工程を除き、他の工程は両戦略で同じです。

2. 連続超薄切断およびテープベースの収集

1. 小型グラインダーや類似の切断工具を使い、サンプルのある側の樹脂を粗くトリミングし、周囲の空白樹脂を取り除いてサンプル部分を露出させます。
2. 樹脂埋め込みブロックをサンプルホルダーに入れ、ホルダーのノブを締めてブロックをしっかり固定します。
3. サンプルホルダーをマイクロトームの可動アームに取り付けてください。ガラスナイフまたはダイヤモンドトリミングナイフ(45°角度)をナイフホルダーに取り付けます。顕微鏡の下で試料表面をピラミッド型に切り取り、表面を滑らかにします。
   注意:トリムされたサンプルブロックの前後の端はできるだけ平行であるべきです( 図2C参照)。
4. サンプルブロックの四辺をトリミングし滑らかにして、エッジ周辺の余分な樹脂を取り除き、ダイヤモンドナイフとの衝突を防ぎます。トリムブロックの前後の端が水平に揃っているか確認するためにノブを回してください。
5. トリミングナイフを外し、45度の角度でセットしたダイヤモンドナイフに交換します。ミクロトーム基部の傾き角度を6°に設定してください。ナイフホルダーをノブでゆっくり動かし、ダイヤモンドナイフの前端が試料表面から1〜2mm離れるまで動かします。
6. サンプル表面とナイフの刃の間の明るい帯を観察し、傾斜角度を調整してバンドが上下および左右に均等になるようにします。これにより、最初のセクションが単なるコーナーではなく、サンプル全体の表面を含むようにできます。
7. ダイヤモンドナイフの溝に蒸留水を注入し、液体のレベルを上げて刃が濡れていることを確実にします。その後、注射器で水を少し取り除き、液体のレベルが下がると反射が銀色に見えます。
8. 制御ユニットで断面厚(送り)、切削速度、切削ウィンドウを設定します。切断速度を0.6 mm/sに調整し、切断厚さを60 nmに設定します(比速度と厚さは試料の品質によります)。
9. 区画整理を始めろ。ミクロトームが安定して動作し均一な切片が得られたら、切片作業を一時停止します。細いブラシで切り取った部分やゴミを落とします。
10. 自動超薄断面回収システムにコーティングされたテープリールと空のテイクアップリールの両方を取り付けます。ロック機構を固定し、テープが一定速度でスムーズに動き、空のリールに正しく回収されるかを試運転します。
11. テープ収集装置の頭部をダイヤモンドナイフの水浴に浸します。収集ヘッドの位置をナイフの刃に平行に調整し、サンプルスライス長の1.5倍の距離で、切断断片がテープに滑らかに集められるようにします。収集装置を安全にし、同時にテープ収集装置を稼働させながら区画整理を再開します。
12. 十分な数の連続断片を集めたら、断面処理を一時停止します。テープを回収されていないセクションエリアでカットし、残りのテープがスプールに集まるまでテープ回収装置を使い続けます。
13. 集めた部分を入れたスプールを取り出し、電子乾燥オーブンに入れます。テープ収集装置とミクロトームを清掃し、すべての付属品を元の場所に戻してください。

図2:区切前の準備。 (A) 親水性処理の前後にD-50テープ表面に残る水滴。(B) D-50テープの接合領域の上部および側面の回路図図。青:D-50テープ;オレンジ:両面接着剤;緑の矢印:テープの移動方向。(C) トリミング後の試料正面図で、上下の平行なエッジが見えます。(D) 自動テープ収集装置。a: D-50テープフィーディングアウト用のテープスプール;b: テープ回収用のテープスプール;赤い矢印:テープの動きの方向。(E) 自動テープ収集装置上の収集ヘッドの位置。右下の黄色いボックスは、デバイスが回収しようとしている新たに切り取った部分を示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

3. シリコンウェハへのマウント

注意:以下の作業では、作業スペースを清潔に保ち、テープがほこりによる汚染を防いでいます。

1. 4インチの丸いシリコンウェハを事前に洗浄し、80Wの出力でプラズマ処理システム(3分)で使用してください。
2. 清潔な手袋をはめ、シリコンウェハーを平らな面に置き、両面導電性カーボンテープを適切な長さ(両端に2〜3cmの張り出し)に切ります。両面導電テープの片側から白い保護層を剥がし、上から下へシリコンウェハーに貼り付けます。
   注意:導電テープの両面は約2mm間隔で配置し、テープの縁はシリコンウェハー上で見えるようにしています。幅25mmの両面導電テープの場合、4インチのシリコンウェハ1枚に3つのテープセグメントを貼ることができます。
3. 作業台に4インチシリコンウェハーの輪郭を描き、ウェハーに貼るテープの各セグメントのおおよその長さをマークします。セクションを集めたテープを、以前に示した長さに従ってカットします。
   注意:カットテープはシリコンウェハーの端を超えてはいけず、切断もできません。
4. 両面導電テープから透明な保護フィルムを剥がし、D-50テープの場合はこの時点でテープ裏側の保護フィルムを剥がします。テープを両面導電テープと平行に貼ります。両面導電テープの各枚に最大3セグメントのテープを貼ります。
   注意:D-50テープのずれやほこりによる汚染のリスクを減らすために、導電性テープの一部を以前剥がれていた透明膜で覆い、導電性テープのごく一部だけを露出させてD-50テープの端を取り付けてください。これによりテープの方向調整が容易になります。その後、残った透明膜をゆっくり剥がし、残りのD-50テープが優しく落ちて導電性テープに密着します。
5. テープが取り付けられた後、テープと導電テープの間に気泡が形成され、その後のイメージングプロセスに干渉する可能性があります。シリコンウェハを真空チャンバー(または他の真空機器)に入れて真空をかけます。真空処理が終わったら、気泡が消えていることを確認してください。

4. 後染色

1. 酢酸ウラニル4%とクエン酸鉛3%を準備し、水浴鍋で50°Cまで予熱します。
   注意:ウラニル酢酸は放射性で、肝臓や腎臓に重大な毒性があります。シトレート鉛は鉛中毒を引き起こし、神経系、腎臓、造血系に影響を及ぼします。これらの試薬の扱いは換気フード内で行うべきであり、実験用コート、ニトリル手袋、マスク、安全ゴーグルなどの適切な個人用防護具(PPE)を着用してください。皮膚や目が合った場合は、すぐに大量の水で洗い、検査室の安全担当者に報告し、医療機関を受診してください。
2. 真空処理され気泡のないシリコンウェハーをプラズマ親水化システムに入れ、加水親和と洗浄を行います。
3. 針を抜いた10mLシリンジを使い、0.22μmのシリンジフィルターを取り付け、4%アセテートウラニルをろ過します。溶液をそのセクションに落とし、シリコンウェハーの表面全体が覆われるまで続け、その後3分間待ちます。
4. 蒸留水で3分間洗浄し、これを3回繰り返した後、窒素で試料表面をブロー乾燥させます。
5. 針を抜いた10mLシリンジを使い、0.22μmのシリンジフィルターを取り付けて3%のクエン酸鉛をろ過します。シリコンウェハーの切断面全体が覆われるまで溶液をそのセクションに落とし、その後5分間待ちます。
6. 蒸留水で3分間洗浄し、これを3回繰り返した後、窒素で試料表面をブロー乾燥させます。

5. データ取得

1. 光学顕微鏡
   注:このセクションでは、リサーチスライドスキャナー(VS200、オリンパス)を光学顕微鏡の例として使用しています。Axio Imager.A2 Vario(ドイツ・ツァイス)などの他の顕微鏡も、ここで説明する光学イメージングに適しています。他の光学顕微鏡の手順は概ね同じです。
   1. シリコンウェハを光学顕微鏡のステージに置き、残留物のない接着テープで固定します。
   2. 5倍対物レンズを使って、シリコンウェハー、テープ、サンプルの概要画像を取得します。
   3. 概要画像では、各セクションの輪郭を描き、ソートし、フォーカスポイントと露光ポイントを追加して、シリコンウェハ全体で20倍または50倍の倍率で全セクションで自動イメージングを行います。
   4. 撮影が完了したら、画像を保存し、画質をチェックします。ピントが合っていなかったり画質が悪い画像があれば、再度ピントを合わせて再イメージしてください。
2. 電子顕微鏡
   注:複数の種類の電子顕微鏡は、シリコンウェハ上に置かれた超薄片の連続イメージングを行うことができます。ここでは、マルチビーム505(ツァイス)を例として用いています。
   1. 炭素厚さ5.7nmの高真空スパッタコーティングを用いて試料表面にカーボンコーティングを行います。
      注:高反射率戦略で金属コーティングされたテープや、低反射率戦略でカーボンナノチューブ(CNT)コーティングされたテープでは、このステップを省略できます。
   2. 光学顕微鏡(Axio Imager.A2 Vario, Zeiss)を使ってシリコンウェハの光学ナビゲーションマップをキャプチャします。
   3. シリコンウェハをSEMのサンプルチャンバーに置きます。試料段上に入れ子状のL字型マーカーを順次識別することで、光学ナビゲーションマップを電子顕微鏡画像と関連付けます。
   4. 顕微鏡ソフトウェア(v3.2、64ビット)のSATモジュールを使い、光学ナビゲーションマップから断面位置と画像領域を半自動的に特定します。
   5. 画像のピクセルサイズを4nm、滞留時間を0.8μsに設定し、フォーカスポイントと位置、記憶場所を設定します。
   6. 連続画像検査を開始してください。

6. データ処理

注:OMLIT画像の2Dステッチはソフトウェアによって自動的に行われます。大規模な3DレジストレーションやOMLIT画像のセグメント化には、他にもより強力なAIアルゴリズムが利用可能です。ここでは、ほとんどの研究所がプロセスを検証しやすくするために、Fiji(v1.54p、64ビット)およびVAST(v1.5.0、64ビット)を用いたステッチング、レジストレーション、セグメンテーションを実演します。

1. フィジーの画像データセットをすべての画像ファイルを含むフォルダをフィジーのインターフェースにドラッグして開き、表示されたら Virtual Stack を選択します。
2. Rectangle Toolを使って関心領域(ROI)を選択し、画像>トリミングでデータセットをトリミングします。
3. Register Virtual Stack Slicesプラグイン(Plugins > Registration > Register Virtual Stack Slices)を使って画像スタックを整列させます。
4. アラインされたデータセットをTIFF形式で保存します(ファイル > Save As > TIFF)。
5. TIFF画像スタックをVAST²² にインポートします。インポート>画像ボリュームを 画像からからにインポートします。VSVファイル。
   注:より詳細なチュートリアルについてはウェブサイトをご覧ください:https://lichtman.rc.fas.harvard.edu/vast/
6. 外部タブレットを接続し、 Draw Segmentモード のブラシツールを使って手動のセグメント化とトレースを開始します(ショート カットキーA と Z を使って画像スライス間を素早く移動してください)。
7. ウィンドウ >3Dビューア>表示>更新を用いて分割構造を3Dで可視化します。
8. 分割結果をファイルから保存>分割を 保存します。

Results

プロトコル全体のワークフロー(図1)は、異なる収集テープの準備から始まります。図1は、プロトコルで言及されている3種類のテープ(左から右へ:Kapton、D-50、CNTコーティングPET)を示しており、同じ背景基板に置くと異なる光学特性を示します。試料準備とブロックトリミングの後、まず数個のセクションを電子顕微鏡撮影のために採取し、調製が期待通りであることを確認します。自動テープ収集システムを用いることで、数千のセクションを金属コーティングテープまたは未コーティングテープのいずれかに収集・接着することができます。これらのテープは特定の方法で配置され、4インチのシリコンウェハー上でセクションアレイを形成します(図1B,C)。染色後、試料は光学顕微鏡撮影に使用できます。次に、未被覆テープにカーボンスパッタリングのステップを加えることで、同じ試料バッチでマルチビー...

Discussion

ここで、OMLITと呼ばれる光学イメージング手法を開発し、これはメソスコープイメージングを可能にし、テープベースのシリアル走査型電子顕微鏡ワークフローと互換性があります。OMLIT法を用いることで、脳サンプルから血管、細胞体、核、主要な樹状枝、そして一部の大きな髄鞘軸索などの中間的な構造特徴を検出するために光学顕微鏡を用いることができます。さらに、OMLITはシリアルSEMパイプラインにシームレスに統合でき、電子顕微鏡撮影前の構造情報を提供し、後のEM取得のための関心領域の指針となります。OMLITイメージングプロセスの具体的な手順を示し、マウス皮質サンプルでその有効性を検証しました。

OMLITイメージングスキームは高反射率戦略と低反射率戦略に分類できます。どちらもテープの慎重な選択と取り扱いが必要です。高反射率戦略では、OMLITイメージング効果は主に多層膜構造からの干渉によって決まるため、ポリイミドテープやD-50テープの金属層の傷や剥がれは画像品質に影響を与え、関心のある領域がランダムに隠れ、

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
粘着テープ	3歳	B5005094008	両面接着剤
原子間力顕微鏡	ブルーカー	ディメンションアイコン
自動超薄片収集システム	レフア	オートカット II
導電性接着テープ	テッド・ペラ	FP16084-8
Dektak Stylus Profilers	ブルーカー	DektakXT
切断用のダイヤモンドナイフ	珪藻	DUJ3530	珪葉石ジャンボナイフ
トリミング用のダイヤモンドナイフ	珪藻	DTB90	ガラスナイフ
電子顕微鏡	ツァイス	マルチSEM505	代替:GeminiSEM 300、ツァイス
FIJI(v1.54p、64ビット)およびnbsp;	オープンソース	https://fiji.sc
ガラストリミングナイフ	自力で作った
シトレート鉛	ライカ	T534/2
光顕微鏡	オリンパス	VS200	代替手段:Axio Imager。A2 ヴァリオ、ツァイス
光学顕微鏡	ツァイス	Axio Imager.A2 Vario
プラズマクリーナー	イードン・テクノロジーズ	ハイドロS4	代替品:Ted Pella Pelcoや他のベンチトッププラズマクリーナー
ポリマーテープ	メルトン	カプトン	同社のウェブサイトは現在アクセスできません。研究者には地元で入手可能なKAPTONテープを試すことを推奨します。
ポリマーテープ	帝人	ペット	https://www.teijin.com/
ポリマーテープ	帝人	D-50	https://www.teijin.com/
シリコンウェハー	最一	912303	ウェハースの片面は研磨されています。
スパッターコーター	ライカ	ACE600	代替案:ダブルヘッドスパッター、ユジエ
ウルトラミクロトーム	ライカ	UC7	代替案:RMC PT-PC
ウラニラセテート	EMS	22400
VAST(バージョン1.5.0、64ビット)	ハワード・ヒューズ医療研究所	https://software.dvid.io/vast/	VAST A1:D32Liteは、大規模な3D顕微鏡データセットの手動注釈およびセグメント化のための無料ツールです。
ZENソフトウェア(v3.2、64ビット)	ツァイス	https://www.zeiss.com/microscopy/zh/products/software/zeiss-zen.html