方法論記事

PCR蛍光プローブを用いたアスペルギルス属、クリプトコッカス・ネオフォールマン、ニューモシスチス・ジロヴェチの検出

DOI：

10.3791/68819

⸱

2026年5月8日

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1Clinical Laboratory, Foshan Sanshui District People's Hospital, 2Organization and Personnel Department and Neurology Department, Foshan Sanshui District People's Hospital

この記事について

サマリー

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ここでは、 アスペルギルス 属、 クリプトコッカス・ネオフォーマン、ニュー モシスチス・ジロベチイの同時検出のためのPCR蛍光プローブ法に基づく臨床試験プロトコルを提示します。

要約

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このプロトコルは、PCR蛍光プローブを用いた核酸検出キットを用いて、臨床喀痰サンプル中の Aspergillus 属、 Cryptococcus neoformans、 Pneumocystis jirovecii の定性検出のための標準化手順を記述しています。この手技は臨床サンプル採取、アルカリ液化前処理、自動核酸抽出、多重リアルタイムPCR検出を含みます。 Aspergillus属、 C. neoformans、 P. jirovecii は、ターゲット特異的蛍光プローブ(それぞれFAM、VIC、CY5チャネル)を用いて検出され、品質保証のために内部制御(ROXチャネル)が統合されています。アッセイの有効性およびサンプル結果の解釈は、定義されたサイクル閾値(Ct)カットオフ値に基づいています。正の対照群は全チャンネルでCt≤ 33.7のS字型増幅曲線を示し、負の対照群は増幅が見られていなければなりません。臨床サンプルでは、FAMチャネルでCt値が33.7≤ Aspergillus 属の陽性を示し、VICチャネルでCt値が36≤、C . neoformans または P. jiroveciiの陽性を示します。

概要

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Aspergillus属、Cryptococcus neoformans、Pneumocystis jiroveciiによる侵襲性真菌感染症は、免疫不全患者にとって重大な脅威となり、高い罹患率と死亡率を引き起こします。適切な抗真菌療法を開始し臨床アウトカムを改善するためには、適時かつ正確な診断が極めて重要です。1.培養、顕微鏡検査、抗原検出などの従来の診断方法には顕著な限界があります。培養は時間がかかり感度が低く、顕微鏡は種レベルの同定ができずオペレーターに依存します。一方、抗原アッセイ(例:ガラクトマンナン、β-D-グルカン)は交差反応性や性能の不一致を示すことがあります。分子診断、特にリアルタイムPCRは、迅速な処理時間や高い感度・特異性の可能性を提供することで、これらのギャップを補うことができます。マルチプレックスPCRの進歩により、単一のサンプルから複数の病原体を同時に検出できるようになり、診断効率が向上します。

本プロトコルは、18S rRNA遺伝子(Aspergillus spp.)、ITS遺伝子(C. neoformans)、mtLSU rRNA遺伝子(P. jirovecii)の保存領域を標的にすることで、ヒトの痰サンプルにおけるAspergillus属、C. neoformans、P. jiroveciiのDNAを定性的検出するための多重蛍光プローブPCRアッセイを記述します。この方法の主な特徴には、定義された分析感度が含まれます:Aspergillus属、C. neoformans、P. jiroveciiの検出限界は1,500コピー/mLです。プライマー/プローブ特異性:標的特異的プライマーやプローブは、ヒトDNAや他の一般的な菌叢との交差反応を最小限に抑えます。堅牢な汚染制御:dUTP-UDG(ウラシルDNAグリコシラーゼ)システムを導入することで、従来のPCRアンプリコンからのキャリーオーバー汚染を効果的に防ぎ、臨床実験室でのアッセイ信頼性維持に不可欠な特徴です。統合プロセス制御:ヒトRP(リボソームタンパク質)遺伝子を標的とした内因性内部対照菌をROX蛍光色素で標識し、核酸抽出の完全性を監視し、PCR阻害の可能性を特定し、偽陰性結果を低減します。3。このアプローチは分子診断における品質保証の確立されたガイドラインによって支持されています 4,5。このプロトコルは主に血液腫瘍患者や移植受容者などの高リスク集団からの呼吸器検体(痰/BALF)に適用されます。環境汚染による偽陽性や過剰なサンプル希釈による感度低下などの潜在的な制限や緩和策についても議論されています。

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プロトコル

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臨床サンプルの使用は、適切な倫理委員会(承認番号:ZYS-GCP-2025006)によって承認されました。すべての参加者は、自身のデータと標本の研究利用に関して広範なインフォームド・コンセントを提供しました。このプロトコルで使用されるすべての試薬および消耗品は、T-ableの材料に記載されています。

1. サンプル採取

  1. 滅菌容器に3〜5mLの痰液または気管支肺泡洗浄液を採取し、速やかに検査に提出してください。

2. 試薬の調製

注:これらの工程は試薬準備室で実施されました。

  1. 検出キットを-28°Cの冷凍庫から取り出し、室温(25〜30°C)で30分間完全に解凍します。
  2. 反応の総数(N)を計算します:N = 試験サンプル数(n) + 陽性・陰性対照群(2) + 1
  3. 反応混合物を無菌のマイクロ遠心分離機チューブで準備します。単一反応の場合:核酸増幅ミックス35μL+プライマープローブミックス5μL、徹底的に渦を巻き、短時間遠心分離機を使います。
  4. 各PCRチューブに40μLの反応混合物をアリコート(キットメーカーのプロトコルに従い)投与し、サンプル処理室のパススルーウィンドウに移します。

3. サンプル処理

注:これらの工程はサンプル処理室で実施されました。廃棄物処理:ステップ3.2.2の上澄液およびNaOHを含む他の液体廃棄物を指定された化学廃棄物容器に捨てます。

  1. 液状化
    1. 50 mLのスクリューキャップチューブに痰液/気管支肺泡洗浄液(BALF)を加えます。
    2. 4%のNaOH消化液を1〜2巻(痰の粘度に対して)加えます。
      注意:NaOHは腐食性があります。皮膚や目への接触は避けてください。
    3. キャップを締めて1分間渦巻き、室温のバイオセーフティキャビネットで15〜20分間孵育します。
  2. エンリッチメント
    1. 遠心分離機は3,000rpmで5分間液化サンプルを行いました。
    2. ピペットで上清液を廃棄し、1,000μLの沈殿物を保持します。
    3. 沈殿物を完全に渦巻け。
  3. 溶解
    1. 500μLの堆積物を溶解管に移します。10分間渦を流し、短時間遠心分離機を使いました。
  4. 抽出
    注意:廃棄物処理:生物サンプルに接触した使用済みの抽出プレート、チップ、チューブは、承認された生物有害廃棄物容器に廃棄されなければなりません。
    1. すべての溶解液上清液と100μLの陰性/陽性対照を抽出プレートのカラム2に移します。
    2. 指定プログラム6の自動核酸抽出システムを使用して核酸抽出を行います。
  5. サンプルローディング
    1. 抽出した核酸(カラム6)とコントロール剤10 μLをPCRチューブに移します。短時間遠心分離機をかけて増幅室のパススルー窓に移す。

4. 核酸増幅

注:これらのステップは増幅室で実施されました。

  1. PCRチューブを自動核増幅装置に読み込み、適切な増幅テンプレートを選択します。
  2. 検出チャネルを割り当てる: Aspergillus 属:FAMチャネル; C. neoformans:VICチャネル; P. jirovecii:CY5チャネル;内部制御:ROXチャンネル7、8、9。
  3. サンプル名を設定してプログラムを実行してください。

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結果

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この多重蛍光プローブPCRアッセイで得られた代表的な増幅曲線は 図1 および 図2に示されています。アッセイの妥当性は、あらかじめ定められた対照基準に基づいて決定されました。有効な試験では、FAM、VIC、CY5、ROXチャネルで特徴的なS字型増幅曲線が現れ、すべての検出チャネルでサイクル閾値(Ct)値≤33.7に達しました(図1A)。陰の対照では、どのチャンネルにもS字型の増幅曲線は見られず、Ct値は「未定」と報告されました(図1B)。実験ランが有効とみなされるためには、両方のコントロール条件を満たす必要がありました。

臨床サンプル解釈のために、病原体特異的蛍光シグナルを評価しました(図2)。FAMチャネルでCt≤値3...

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ディスカッション

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本研究で確立されたマルチプレックスリアルタイムPCRプロトコルは、臨床用喀痰サンプルにおいて3つの主要な侵襲性真菌病原体(Aspergillus spp.、Cryptococcus neoformans、Pneumocystis jirovecii)を同時かつ迅速に検出するための標準化された手順を提供します。この方法は臨床検体から病原体DNAを直接検出することを可能にします。培養、顕微鏡、血清学的抗原検査などの従来の診断手法とは異なり、この分子法は培養処理にかかる処理時間の延長、顕微鏡検査の感度や操作者依存性の変動、抗原アッセイにおける交差反応の可能性など、これらの技術の本質的な制約を受けません。

このプロトコルの成功した実装は、複数の重要な段階での厳格な品質管理に依存しています。高品質な真菌DNAを得るためには、アルカリ液化や遠心分離を含む適切なサンプル前処理が不可欠です。不完全な液化は細胞壁の破壊を妨げ、核酸放出の効率を低下させる可能性があります。自動抽出システムを使った核酸精製工程も同様に重要で、粘液や血液成...

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開示事項

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著者には利益相反を主張するものはありません。

謝辞

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佛山の汕水区人民病院臨床検査科に、機器と技術支援を提供していただき感謝申し上げます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10 & mu;L型フィルターチップ無菌拡張ピペットチップ(ラック付き)シャオルイ・バイオテクノロジーS20221126
1000 & mu;L型滅菌ピペットチップ江蘇新康医療機器有限公司241101
200 & mu;L拡張フィルター滅菌ピペットチップシャオルイ・バイオテクノロジー241001
リシスチューブ北京ZC生物科学・テクノロジー社F1040
Aspergillus spp、Cryptococcus neoformans、およびPneumocystis jirovecii の核酸検出キット北京ZC生物科学・テクノロジー社CT8143-48T
核酸抽出試薬北京ZC生物科学・テクノロジー社CN8053-B40T
サンプル希釈バッファー北京ZC生物科学・テクノロジー社SP7065

参考文献

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  1. Morrissey, C. O., et al. Aspergillus fumigatus—a systematic review to inform the World Health Organization priority list of fungal pathogens. Med Mycol. 62 (6), 6(2024).
  2. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., Watson, R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y). 11 (9), 1026-1030 (1993).
  3. Longo, M. C., Berninger, M. S., Hartley, J. L. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in PCR. Gene. 93 (1), 125-128 (1990).
  4. Vandesompele, J., et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 3 (7), research0034.1-research0034.12 (2002).
  5. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  6. Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).
  7. Loeffler, J., et al. Quantification of fungal DNA by using fluorescence resonance energy transfer and the LightCycler system. J Clin Microbiol. 38 (10), 3463-3466 (2000).
  8. Bovers, M., et al. Six monophyletic lineages identified within Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii by multi-locus sequence typing. Fungal Genet Biol. 43 (5), 353-359 (2008).
  9. Wakefield, A. E., et al. Detection of Pneumocystis carinii with DNA amplification. Lancet. 336 (8726), 751-753 (1990).
  10. Schrader, C., et al. PCR inhibitors—occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
  11. White, T. J., et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, J. J. , Academic Press. 315-322 (1990).

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