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PCR蛍光プローブを用いたアスペルギルス属、クリプトコッカス・ネオフォールマン、ニューモシスチス・ジロヴェチの検出

DOI:

10.3791/68819

⸱

May 8th, 2026

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1Clinical Laboratory, Foshan Sanshui District People's Hospital, 2Organization and Personnel Department and Neurology Department, Foshan Sanshui District People's Hospital

In This Article

Summary

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ここでは、 アスペルギルス 属、 クリプトコッカス・ネオフォーマン、ニュー モシスチス・ジロベチイの同時検出のためのPCR蛍光プローブ法に基づく臨床試験プロトコルを提示します。

Abstract

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このプロトコルは、PCR蛍光プローブを用いた核酸検出キットを用いて、臨床喀痰サンプル中の Aspergillus 属、 Cryptococcus neoformans、 Pneumocystis jirovecii の定性検出のための標準化手順を記述しています。この手技は臨床サンプル採取、アルカリ液化前処理、自動核酸抽出、多重リアルタイムPCR検出を含みます。 Aspergillus属、 C. neoformans、 P. jirovecii は、ターゲット特異的蛍光プローブ(それぞれFAM、VIC、CY5チャネル)を用いて検出され、品質保証のために内部制御(ROXチャネル)が統合されています。アッセイの有効性およびサンプル結果の解釈は、定義されたサイクル閾値(Ct)カットオフ値に基づいています。正の対照群は全チャンネルでCt≤ 33.7のS字型増幅曲線を示し、負の対照群は増幅が見られていなければなりません。臨床サンプルでは、FAMチャネルでCt値が33.7≤ Aspergillus 属の陽性を示し、VICチャネルでCt値が36≤、C . neoformans または P. jiroveciiの陽性を示します。

Introduction

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Aspergillus属、Cryptococcus neoformans、Pneumocystis jiroveciiによる侵襲性真菌感染症は、免疫不全患者にとって重大な脅威となり、高い罹患率と死亡率を引き起こします。適切な抗真菌療法を開始し臨床アウトカムを改善するためには、適時かつ正確な診断が極めて重要です。1.培養、顕微鏡検査、抗原検出などの従来の診断方法には顕著な限界があります。培養は時間がかかり感度が低く、顕微鏡は種レベルの同定ができずオペレーターに依存します。一方、抗原アッセイ(例:ガラクトマンナン、β-D-グルカン)は交差反応性や性能の不一致を示すことがあります。分子診断、特にリアルタイムPCRは、迅速な処理時間や高い感度・特異性の可能性を提供することで、これらのギャップを補うことができます。マルチプレックスPCRの進歩により、単一のサンプルから複数の病原体を同時に検出できるようになり、診断効率が向上します。

本プロトコルは、18S rRNA遺伝子(Aspergillus spp.)、ITS遺伝子(C. neoformans)、mtLSU rRNA遺伝子(P. jirovecii)の保存領域を標的にすることで、ヒトの痰サンプルにおけるA....

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Protocol

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臨床サンプルの使用は、適切な倫理委員会(承認番号:ZYS-GCP-2025006)によって承認されました。すべての参加者は、自身のデータと標本の研究利用に関して広範なインフォームド・コンセントを提供しました。このプロトコルで使用されるすべての試薬および消耗品は、T-ableの材料に記載されています。

1. サンプル採取

  1. 滅菌容器に3〜5mLの痰液または気管支肺泡洗浄液を採取し、速やかに検査に提出してください。

2. 試薬の調製

注:これらの工程は試薬準備室で実施されました。

  1. 検出キットを-28°Cの冷凍庫から取り出し、室温(25〜30°C)で30分間完全に解凍します。
  2. 反応の総数(N)を計算します:N = 試験サンプル数(n) + 陽性・陰性対照群(2) + 1
  3. 反応混合物を無菌のマイクロ遠心分離機チューブで準備します。単一反応の場合:核酸増幅ミックス35μL+プライマープローブミックス5μL、徹底的に渦を巻き、短時間遠心分離機を使います。
  4. 各PCRチューブに40μLの反応混合物....

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Results

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この多重蛍光プローブPCRアッセイで得られた代表的な増幅曲線は 図1 および 図2に示されています。アッセイの妥当性は、あらかじめ定められた対照基準に基づいて決定されました。有効な試験では、FAM、VIC、CY5、ROXチャネルで特徴的なS字型増幅曲線が現れ、すべての検出チャネルでサイクル閾値(Ct)値≤33.7に達しました(図1A)。陰の対照では、どのチャンネルにもS字型の増幅曲線は見られず、Ct値は「未定」と報告されました(図1B)。実験ランが有効とみなされるためには、両方のコントロール条件を満たす必要がありました。

臨床サンプル解釈のために、病原体特異的蛍光シグナルを評価しました(図2)。FAMチャネルでCt≤値3.......

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Discussion

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本研究で確立されたマルチプレックスリアルタイムPCRプロトコルは、臨床用喀痰サンプルにおいて3つの主要な侵襲性真菌病原体(Aspergillus spp.、Cryptococcus neoformans、Pneumocystis jirovecii)を同時かつ迅速に検出するための標準化された手順を提供します。この方法は臨床検体から病原体DNAを直接検出することを可能にします。培養、顕微鏡、血清学的抗原検査などの従来の診断手法とは異なり、この分子法は培養処理にかかる処理時間の延長、顕微鏡検査の感度や操作者依存性の変動、抗原アッセイにおける交差反応の可能性など、これらの技術の本質的な制約を受けません。

このプロトコルの成功した実装は、複数の重要な段階での厳格な品質管理に依存しています。高品質な真菌DNAを得るためには、アルカリ液化や遠心分離を含む適切なサンプル前処理が不可欠です。不完全な液化は細胞壁の破壊を妨げ、核酸放出の効率を低下させる可能性があります。自動抽出システムを使った核酸精製工程も同様に重要で、粘液や血液成.......

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Disclosures

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著者には利益相反を主張するものはありません。

Acknowledgements

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佛山の汕水区人民病院臨床検査科に、機器と技術支援を提供していただき感謝申し上げます。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 & mu;L型フィルターチップ無菌拡張ピペットチップ(ラック付き)シャオルイ・バイオテクノロジーS20221126
1000 & mu;L型滅菌ピペットチップ江蘇新康医療機器有限公司241101
200 & mu;L拡張フィルター滅菌ピペットチップシャオルイ・バイオテクノロジー241001
リシスチューブ北京ZC生物科学・テクノロジー社F1040
Aspergillus spp、Cryptococcus neoformans、およびPneumocystis jirovecii の核酸検出キット北京ZC生物科学・テクノロジー社CT8143-48T
核酸抽出試薬北京ZC生物科学・テクノロジー社CN8053-B40T
サンプル希釈バッファー北京ZC生物科学・テクノロジー社SP7065

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morrissey, C. O., et al. Aspergillus fumigatus—a systematic review to inform the World Health Organization priority list of fungal pathogens. Med Mycol. 62 (6), 6(2024).
  2. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., Watson, R.

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PCR DetectionFluorescent ProbeAspergillus SppCryptococcus NeoformansPneumocystis JiroveciiMultiplex Real Time PCRNucleic Acid ExtractionClinical Sputum SamplesCycle ThresholdInternal Control

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