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方法論記事

硝子体コラーゲン線維ネットワークを視覚化するための共焦点反射顕微鏡用のブタの目の準備

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DOI:

10.3791/68823

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2025年10月17日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Utah, 2Department of Biomedical Engineering, University of Utah, 3Department of Chemistry, University of Utah, 4Department of Mechanical Engineering, University of Utah

この記事について

サマリー

この方法は、共焦点反射顕微鏡を使用して硝子体内のコラーゲン線維の本来の構造を視覚化します。

要約

硝子体は、水晶体と網膜の間の空間を埋める透明なゲルです。その構造はコラーゲン線維のネットワークによって支えられており、粘弾性特性に影響を与え、網膜疾患の一因となる可能性があります。しかし、硝子体を本来の状態でイメージングすることは困難であるため、このコラーゲンネットワークの構成は依然として特徴付けられていません。硝子体に適用される多くのイメージング技術は脱水や歪みを引き起こし、色素ベースの方法ではアーティファクトや非特異的標識が導入される可能性があり、コラーゲンネットワークの研究が困難になります。このプロトコルでは、1)イメージングのためにブタの目を解剖する方法を概説します。2)倒立顕微鏡に目を取り付けるための戦略。3)共焦点反射顕微鏡を使用して硝子体コラーゲンネットワークをネイティブ状態でイメージングするためのガイドライン。4)ネットワーク特徴の定量的画像解析の指示。よくある落とし穴を強調し、重要な技術的なポイントを強調します。硝子体への共焦点反射顕微鏡の適用を報告します。以前の硝子体イメージング戦略と比較して、このアプローチは、外因性色素や脱水アーティファクトなしに、硝子体コラーゲン線維の天然構造、配向、および分布を保持します。共焦点反射顕微鏡は、健康と病気における硝子体ゲルの硬さの構造的基盤を調べることができます。

概要

硝子体は、目の水晶体と網膜の間の細胞外マトリックスです。網膜上の硝子体からの牽引は、網膜剥離、黄斑円孔、硝子体黄斑牽引などの疾患における視力喪失に大きな役割を果たします 1,2,3,4。網膜に牽引力を伝達する硝子体の能力は、そのゲルの剛性によって決定され、それはその主成分であるコラーゲンとヒアルロン酸の特性に依存します5。人工コラーゲンゲルの剛性は密度、アライメント、繊維幅などのネットワーク特性によって決定されるため、硝子体のゲル剛性はコラーゲン線維のネットワークの特徴の影響を受ける可能性があります6。

硝子体コラーゲン線維ネットワークは、水分含有量が高く、コラーゲン濃度が低いため画像化が困難であり7、顕微鏡または透過型電子顕微鏡の処理中に人工的な歪みが生じます。従来の組織学および透過型電子顕微鏡では、薄い切片化のために硝子体を硬化させるための処理が必要です。組織学的包埋に必要な脱水により、硝子体線維がハニカム状に凝集し8、凍結中の氷結晶形成により細胞外マトリックス9の細孔サイズが増加します。アーティファクトを最小限に抑えるためにプラスチック包埋8 および急速凍結10 が硝子体に適用されていますが、いくつかの残留アーティファクトが残っている可能性があります。位相差顕微鏡は、切片を必要とせず硝子体に適用されている方法ですが、目から硝子体の小片を除去する必要があるため、ネットワーク11の元の位置と向きが失われます。最近では、定量偏光顕微鏡を使用して、肉眼的に切片化されたブタの目全体の繊維の平均配向をマッピングしていますが、個々の繊維は解決できませんでした12。さらに、色素ベースの標識アプローチ(トリパンブルー、ピクロシリウスレッド、5-(4,6-ジクロロトリアジニル)アミノフルオレセインなど)は、アーティファクトや非特異的標識を導入する可能性があるため、天然のコラーゲンネットワークを維持するために回避されました。

Filasらが偏光顕微鏡研究に使用したサンプル調製法、すなわちアガロースブロック12の肉眼的解剖を採用し、これまで硝子体に適用されていなかった共焦点反射顕微鏡を使用して標本を画像化しました。この方法を用いて、水和された生理学的に近い状態の硝子体コラーゲン線維ネットワークの画像を取得しました。これにより、凍結破壊または脱水ベースのアプローチと比較してアーティファクトが減少するなど、以前の方法に比べていくつかの利点があります10,13。このプロトコルには、少なくとも30倍の倍率の浸漬対物レンズ、0.9を超える開口数、および200μmを超える作動距離を備えた倒立共焦点顕微鏡が必要です。ファイバーの鮮明な解像度を促進するために、サンプル調製と画像取得に関する重要なガイダンスが含まれています。このアプローチにより、硝子体コラーゲンマトリックスのネイティブに近い状態を維持することで、研究者は硝子体の硬さとその病理学的変化を理解するために重要であると考えられる繊維の配向、密度、および空間分布パラメータを定量的に分析できます。この技術は、硝子体コラーゲンネットワーク、その構造、および網膜硝子体疾患の病因に関心のある研究者に特に適しています。

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プロトコル

1.組織の準備と解剖

注: この研究は、機関のガイドラインに従って実施されました。当施設では、 ex vivo ブタの目で実験を行うために施設動物管理および使用委員会の承認は必要ありませんでした。

  1. 食肉加工工場から ex vivo ブタの目を入手します。死亡後48時間以内に目を使用してください。
    注:硝子体の外観は死後時間が長くても変化しませんが、網膜と脈絡膜は劣化し、解剖中に細胞および色素沈着した破片が分散します。この破片は、ファイバーのイメージングと分析を妨げる可能性があります。
  2. 地球から余分な筋肉や結合組織を取り除きます。
  3. 3 極の台座を、特大のシリコン製氷型などの立方体型のベースに置きます (図 1A および 図 2)。
  4. 地球儀を3本爪の台座に置き、輪部が突起に乗るように配置します。
  5. 100 mLの蒸留水に3 gの汎用アガロースを加え、溶解するまで溶液を加熱することにより、3%アガロースゲルを作ります。溶液が約37°Cに冷めたら、目がアガロースに浸るまで型に注ぎます。
    注:これにより、解剖のために眼を安定させるために、アガロースゲルに眼が埋め込まれます。
  6. アガロースキューブを少なくとも4時間冷やします。
    注:これにより、ゲルの眼への接着性が高まり、解剖中に目が動かないようにします
  7. 冷やした後、アガロースキューブを型から取り出します。次に、キューブから台座を取り外します(図1B)。
  8. 1 x 8 のレゴ ブロック、プレート、タイルを組み合わせて、アガロース キューブと同じ寸法の 3 面フレームを構築します (図 3)。
    注意: これにより、キューブが所定の位置に固定され、解剖中にブレードのガイドが提供されます。レゴフレームの高さによって、目がカットされる位置が決まります。これは、半透明のアガロースゲルを通して視覚化できます。
  9. 冷やしたアガロースキューブをレゴフレームに入れます。目立ったミクロトームの刃の鈍い端を持ち、刃をレゴフレームの上部に合わせます。キューブの上部に穏やかな下向きの圧力を加え、ミクロトームブレードをキューブ全体と埋め込まれた目を通して前後にゆっくりとドラッグします(図1C)。
    注:これにより、アガロースに埋め込まれた眼組織のセクションが作成され、「アイキャップ」と呼ばれます。

2. イメージング用サンプルの取り付け

  1. ミクロトームブレードを使用して、立方体の切断面全体から約1 mmのアガロースをトリミングします(図4A)。
    注:これにより、アガロースキューブの切断面の上に伸びるアイキャップの小さなセクションが残ります
  2. ティッシュワイプまたは小さな三角形のセルローススポンジを使用して、アガロースキューブの切断面、特にアイキャップの境界近くを乾燥させます。
  3. 小さなプラスチック製のサンドイッチバッグに小さじ約1杯の万能シリコンコーキング剤を加え、袋の下隅の1つに3mmの穴を開けて、コーキング用の絞り袋を作ります。
  4. 絞り袋を使用して、アイキャップの端に沿ってアガロースキューブの切断面にコーキングの薄いビーズを塗布し、サンプルの周囲に防水境界線を作成します(図4B)。これにより、硝子体ゲルがアイキャップから漏れるのを防ぎます。
  5. 大きなカバーガラスをアイキャップの上に置き、アイキャップの切断面がカバーガラスに接触するように押し下げ、空気や液体が閉じ込められないようにします(図4C)。シリコンビーズがカバーガラスと連続的にシールされていることを確認します。
    注: シリコンコーキングが連続的なシールを形成しない場合、硝子体液が漏れ出し、サンプルに空気が混入する可能性があります。空気にさらされると硝子体が収縮し、その結果、繊維が明るく密度が高くなり、繊維のない液体領域が形成されます。硝子体がカバーガラスと接触していないと、画像化が困難になります。
  6. アガロースキューブを持ちながら、サンプルを反転させ、倒立顕微鏡でイメージングするための大きなカバーガラスアダプターの上に置きます(図4D および 図5)。

3. 画像取得

  1. 回転ディスクタイプではない倒立共焦点顕微鏡を使用してください。水対物レンズ(カプラーとして水または眼用潤滑剤ジェルを使用)、または開口数が0.90以上、倍率が30倍から60倍、作動距離が200μm以上の油対物レンズを使用してください。
  2. 共焦点顕微鏡の光路設定を調整して、反射率画像を取得します。励起光の方向を変え、蛍光イメージングのために放出された光を透過するために使用されるダイクロイックミラーの代わりに、照明レーザーの一部を方向転換し、反射光の一部を透過するビーム分割ミラーがあることを確認します。
    注:硝子体コラーゲン線維からの反射率信号はやや弱いため、バックグラウンドノイズは線維を画像化する能力に影響を与える可能性があります。473nmの波長でS/N比の改善が観察されましたが、硝子体コラーゲン線維は405nmから635nmの範囲で画像化することができました。
  3. 照射レーザーの波長を含むように検出波長を設定します。
  4. サンプル内のZ位置の方向を定めるには、レーザー出力を可能な限り低い設定に下げ、カバーガラスからの反射光のフラッシュを特定します。これは、カバーガラスの下部と上部で発生します(図6)。
    注:カバーガラスの近くでは、背景にかなりの反射信号があります。カバーガラスから離れると、コラーゲン線維からの反射光からの信号が減少します。
  5. カバーガラスの上部より上、サンプル内に位置するようにz位置を調整します。
  6. レーザー出力を、蛍光アプリケーションに通常使用されるレベルよりも高いレベルまで上げます。
    注:イメージングフィールドの中央に反射リングアーティファクトがあります。イメージングフィールドのズームインと偏心化を組み合わせることで、このアーティファクトを除外できます(図7)。
  7. ライン平均化を使用し、共焦点顕微鏡で信号対雑音比を高めるための標準的な方法である画像取得設定でピクセル滞留時間を増やします。

4. CT-FIRE 14を用いた繊維幅の画像解析

  1. この Web サイトの指示に従って CT Fire をインストールします: https://github.com/uw-loci/curvelets/wiki/Downloads-and-Installation-(CTF)。
    注:ここで使用したバージョンは「CT-FIRE V3.0 BetaWindows64-2018b」とMATLABランタイム「MCR-2018b-win64」です。ソフトウェアを動作させるには、両方をダウンロードする必要があります。
  2. 画像を8ビットtifに変換し、8ビットtif画像をCT-FIREで開きます。
  3. ソフトウェアが右上隅の CT-Fire に設定されていることを確認し、[ 実行] を選択します。
  4. CT-FIREは、元の画像と同じフォルダにある「ctfireout」という名前のフォルダに解析結果を自動的にアップロードします。「OL_ctFIRE」という名前で始まるファイルを元の画像と比較して、抽出の品質を調べます。このプロトコルに従うには、画像セグメンテーション(つまり、ファイバーの識別)に次のデフォルト設定を使用します。thresh_im2:5;s_xlinkbox:8;thresh_ext:70;thresh_dang_L:15;thresh_short_L:15;s_fiberdir:4;thresh_linkd:15;thresh_linka:-150;thresh_flen:15
    1. 繊維が正確に識別されない場合は、右上隅のパラメータセクションの下にある[更新]ボタンをクリックしてパラメータを調整します。
      注意: パラメータの調整方法に関するガイダンスは、CTFIREアプリケーションフォルダにあるCT-FIREマニュアルのセクション「20ノート」の3ページにあります。追加のヒントは、セクション3.5.215のLiuらによる記事にあります。
  5. 必要に応じて出力設定を調整して、出力画像に表示されるファイバーを制限します。このプロトコルに従うには、次のデフォルト設定を使用します。最小ファイバー長 [ピクセル]: 30;画像解像度 [dpi]: 300;ファイバー線幅[0-2]:0.5;最大ファイバー幅 [ピクセル]: 15
  6. 幅の単位をピクセルからμmに変換するには、フィジーで元の画像を開きます。表示ウィンドウの左上隅にあるピクセルとμmの両方で表示される画像の寸法を使用して、比率を計算します。

5. TWOMBLI16を使用した繊維密度、曲率、アライメント、ラクナリティ、菌糸成長単位、フラクタル次元の画像解析

  1. https://github.com/wershofe/TWOMBLI からTWOMBLIをダウンロードします。
  2. ファイルの指示に従ってください: 「インストールと依存関係」の TwombliDocumentation。
  3. TWOMBLI_v1/programsフォルダを開き、AnamorfProperties.xmlファイルをAnamorfPropertiesEH.xmlファイル(補足ファイル1)に置き換えます。
  4. TWOMBLI_v1/programsフォルダで、Twombli_v1.ijmファイルをTwombli_v2.ijmファイル(補足ファイル2)に置き換えます。
  5. 「test HDM」、「test masks」、「HDM」、「masks」という空のフォルダを作成します。
  6. 画像を 8 ビット tif に変換します。
  7. 「テストセット入力」フォルダに3〜5枚の画像を入れます。
  8. 分析するすべての画像を「適格」と呼ばれるサブフォルダーなしで1つのフォルダーに入れます。
  9. フィジーでは、[ プラグイン] |マクロ |実行 |twombli /Programs で Twombli_v2.ijm を選択します。
  10. プロンプトに従ってTWOMBLIを実行します。このプロトコルに従うには、次のパラメーターを使用します。コントラスト彩度、0.35;最小線幅、3;最大線幅、3;最小曲率ウィンドウ、40;最大曲率ウィンドウ、40;最小枝長、10;最大ディスプレイHDM、100;最小ギャップ直径、0
    注意: 画像のパラメータを調整する必要がある場合があります。ソフトウェアはユーザーにパラメータの選択をガイドし、追加の手順はプログラムに付属のファイルTwombliDocumentation.docxにあります。

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結果

3頭の若年成豚(生後4か月の雌、生後5か月の雄、生後6か月の雌)のそれぞれ1つの目を、下輪部を通して軸面で眼を切断した後、画像化されました。6つのイメージング位置は、X-Yセクショニング面で4mm間隔で取得されました。各イメージング位置で、70 μm x 70 μmの画像の連続した4 x 4グリッドが得られました(図8)。ブタごとに、各画像をいくつかのパラメーターについて個別に分析しました(表1)。

繊維の密度は、2つの方法で測定されました:1)線状構造のセグメンテーション後の繊維の全長。2)しきい値処理後に信号が占めるピクセルの割合。繊維の全長は3匹のブタすべてで同様でした(一元配置分散分析によるp = 0.19)(図9A)が、信号が占めるピクセルの割合は3匹のブタ間で異なりました(p < 0.0001)(図9B)。これは、ブタ3の繊維密度が低いことに反映されてい...

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ディスカッション

以前の硝子体イメージング法では、人工的な繊維凝集13、繊維組織、配向、および位置の喪失17、またはより小さな視野ではるかに高い解像度に依存していたため、繊維分布10に関する洞察が制限されていました。ex vivo、肉眼的に切片化された新鮮な組織の共焦点反射顕微鏡は、自然な繊維の組織、配向、および位置を維持しながら、硝子体コラーゲン線維のミクロンスケールの画像を提供します。私たちの手では、色素ベースの染色アプローチ(トリパンブルー、ピクロシリウスレッド、5-(4,6-ジクロロトリアジニル)アミノフルオレセインなど)はアーティファクトまたは非特異的標識を導入したため、天然のコラーゲンネットワークを維持するために使用されませんでした。

このプロトコルの実装を確実に成功させるには、いくつかの重要な手順があります。サンプルの調製中は、硝子体がカバーガラスに接触することが重要です。硝子...

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開示事項

すべての著者は、関連する利益相反を報告していません。

謝辞

国立衛生研究所コア助成金EY014800;ニューヨーク州ニューヨークの失明予防研究からユタ大学眼科および視覚科学科への無制限の助成金。NIH NEI K08 EY034549;プライマリー小児病院財団;E. マチルダ ジーグラー財団;豚の目をくれたギヨーム・L・ホアロー博士とM・オースティン・ジョンソン博士に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アガローズI型VWR0710-500G
オールパーパスシリコン1コーキング、クリアGE2795576
セルローススポンジ(ウェックセルアイスピア)ビーバー - ビジテック000865
カスタム3つ穴台座 NANA
大型カバースリップガラスの取り付け用カスタムアダプターNANA
大きなカバースリップグラス、1.42インチx 2.36インチNo.1テッド・ペラ260460-100
レゴ(クラシックベースプレート、8タイル1枚、ブロック1枚、6枚プレート1枚)レゴ11023, 3008, 3666, 4162
マイクロトームブレード(高プロファイル) リーカ・バイオシステムズ14035838926
オリンパスUPlanSApo 30倍シリコン対物レンズオリンポスUPLSAPO30XS
シリコン製大型氷トレイ(Samuelworld)アマゾン713243280060
ティッシュワイプ(Kimwipes) キンバリー・クラーク34120

参考文献

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