このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

再現性のある無細胞タンパク質合成のためのOnePot PUREおよび粗リボソーム生産の精製

1.6K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/68826

⸱

2025年8月22日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Engineering Biology, Institute of Quantitative Biology, Biochemistry and Biotechnology, School of Biological Sciences, University of Edinburgh, 2Biophoundry Inc.

この記事について

サマリー

我々は、バッチ間のばらつきを最小限に抑えるために細胞増殖を制御することに焦点を当て、OnePot「組換え要素を使用したタンパク質合成」(PURE)システムおよび無細胞タンパク質合成用の粗リボソームを生産するための最新のプロトコルを提示します。

要約

最近の進歩により、組換え要素を使用したタンパク質合成(PURE)無細胞システムを個々の研究室で経済的に生産し、労働負担を軽減することが可能になりました。しかし、PUREを構成する36種類のタンパク質成分とリボソームの調製は、依然として複雑な作業であり、ばらつきやエラーの余地が大きいです。最近発表されたOnePotプロトコルに基づいてPUREを製造するための詳細かつ最新の手順を提示し、これには、特に光学密度(OD)正規化グリセロールストックを使用した培養物の接種、細胞増殖の慎重なモニタリング、および最終グリセロール濃度の制御。このアプローチを使用して、複数の生物学的複製およびユーザーからのPUREの再現性のある調製を報告します。このプロトコルは、他のラボが独自のPUREシステムを製造およびトラブルシューティングするための参照および出発点として機能し、生体分子システムのボトムアップ構築や合成細胞の開発など、PUREが可能にする多くのアプリケーションの民主化を促進します。

概要

無細胞タンパク質合成(CFPS)は、バイオ製造、バイオセンシングと診断、遺伝的および代謝的部分と経路のプロトタイピング、迅速なタンパク質工学、教育など、さまざまな用途の技術として成熟しています1,2。精製成分を使用したCFPSシステムは、もともと「組換え要素を使用したタンパク質合成」(PURE)システム3として開発され、ライセートベースの代替品に比べて多くの利点があります。PUREシステムは、36のタンパク質因子、70S大腸菌リボソーム、およびヌクレオシド三リン酸(NTP)、アミノ酸、tRNAなどの化学基質の定義された混合物で構成される定義された組成を持ち、必要な用途に合わせて自由に調整できます。したがって、それらは、非標準アミノ酸の取り込み、機構モデリング、生体分子系および合成細胞のボトムアップ構築などの研究に非常に適しています1。PUREは商業サプライヤーから入手できますが、そのコスト(1μL反応あたり0.34ドルから1.63ドル)は、大規模な実験には法外です。また、PUREを社内で製造する代替戦略は、これまでのところ、36種類のタンパク質とリボソーム4の並行精製を含む労働集約的なプロトコルによって妨げられており、特に経験の浅いユーザーにとって、堅牢かつ再現性のある方法で実行することが困難です。

最近の開発により、PURE の自家製生産が促進されました。例えば、Wangらは、翻訳機構にゲノム的に組み込まれたヘキサヒスチジンタグを含むように大腸菌株を操作し、単一ステップの精製を容易にしました5。すべてのPUREタンパク質をコードする遺伝子は、少数のプラスミドに組み立てられており、同様に精製労働を削減するために使用されています6。Villarealらは、正しい比率でタンパク質を生産するために発現のバランスをとると同時に、シングルステップの精製を可能にするPURE株のエレガントなコンソーシアムを設計しました7。

Lavickovaらによって開発された革新的なOnePot PUREシステムは、使いやすさに大きな期待を寄せています8,9。このシステムでは、オリジナルのPURE株を1回のクロマトグラフィーステップで共培養および精製します。得られたPUREシステムの組成を正確に定義することは不可能ですが、著者らは、システムの複数のバッチがほぼ再現可能であり、各株の接種量を変えることで大まかなレベルの制御を達成できることを実証しました。OnePotシステムからの全体的なタンパク質合成収量が商業的に得られた収量と同様であることを考えると、正確な組成制御と生産の容易さのトレードオフは、多くのユーザーに受け入れられるものです。ただし、OnePot システムには詳細なプロトコルが存在しますが、Lavickova らの結果を他の研究室で完全に再現することは困難でした。例えば、発現ベクターの不安定性、成長の遅い株、およびタンパク質分解が観察されています10。

この研究では、標準化されたグリセロールストックと培地調整を使用して細胞増殖を制御し、増殖と収穫ODのモニタリングに関するガイダンスを提供し、最終精製におけるグリセロールの量を正規化する、詳細で洗練されたOnePot PUREプロトコルを提示します。第二に、リボソーム活性と、より高度な方法のコストと複雑さの間のトレードオフのバランスをとる、分画超遠心分離のみを使用した最適化された粗リボソーム精製手順を提示します。

これにより、OnePot プロトコルにより多くの手順が導入されますが、ユーザーは必要に応じて手順をより徹底的にトラブルシューティングしたり、必要に応じて変更したりする機会が増えます。同じラボで複数のユーザーによって実行された複数の生物学的複製を示すことにより、プロセスの再現性を実証します。PURE成分とリボソーム調製の両方の制御は、システムの高いCFPS性能を確保するために重要であることがわかりました。

PUREとリボソームの調製にはそれぞれ4日または5日かかり、1人のユーザーが順次実行することも、2人のユーザーが同時に実行することもできます。PURE調製には4x500 mLの液体培養が含まれ、それぞれ~15 mg / mLの濃度で~2 gの細胞ペレットと~1 mLのPUREタンパク質が得られます。リボソーム調製には、4 × 500 mL = 2 Lの液体培養が含まれ、合計~3 gの細胞ペレットが得られ、~17 μMの濃度で~1 mLの粗リボソームが得られます。現在のプロトコルは、2時間のバッチ反応11で最大~100 μg/mL GFPまたは~130 μg/mLのmCherryの合成収率を持つPUREシステムを生成し、これは元のOnePotおよび市販のシステム(~140-160 μg/mL)と比較して有利です8,12。したがって、塩、クラウディング剤、個々のタンパク質因子などの敏感な成分の補給または調節を通じて、さらなる最適化を行うための適切な出発点となります。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

プロトコルは 3 つの部分に分かれています。簡潔かつ明確にするために、この作品に特有の重要な変更点を強調し、したがって、他の出版物に存在するものと同じ詳細が参照されています。

予備作業は一度だけ実行する必要があります。4つのセクションには、PUREタンパク質用のグリセロールストックとスタータープレートの調製、および株の発現時間の検証と測定が含まれます。スタータープレートを使用すると、削り取られたグリセロールストックからの直接接種に関連するばらつきが排除されます。製造段階に進む前に、この作業が徹底的に行われていることを確認することが重要です。PUREの調製には多数の異なるグリセロールストックが関与するため、システムの製造を試みる前に、プラスミドの完全性とすべての株の発現を検証することが不可欠です。

ワークフローの概略図を 図 1 に示し、推奨スケジュールを 表 1 に示します。必要な材料、およびそれらが使用される手順は 材料表に示されており、各段階で必要なバッファーと培地の概要は補 足図S1にまとめられています。

1. 事前作業

  1. グリセロールストックの生成
    注:すべてのプラスミドはAddgeneから入手できます。
    1. 標準手順9に従って、表2にリストされているすべての株の25%w / vグリセロールストックを生成し、-80°Cのクライオバイアルに保存します。
  2. PUREスタータープレートの準備(一晩)
    1. 100 μg/mLのアンピシリン(LB+AMP)を添加した20 mLのLB培地を調製します。
    2. #1-#36の36x滅菌1.5 mLマイクロ遠心チューブにラベルを付けます。
    3. 各チューブに500 μLのLB+AMPを加えます。ピペットチップを使用して元のグリセロールストックから少量をこすり落とし、対応する株を各チューブに接種します。グリセロールストックが解凍しないようにしてください。ボルテックスをしっかり混ぜます。
    4. 図2に示すレイアウトに従って、接種された各チューブから300 μLを滅菌1 mL 96ディープウェルプレートの対応するウェルに分注します。
      注:プレートを含む後続のすべてのステップでは、全体を通して同じプレートレイアウトを維持します。
    5. プレートをプレートシェーカーで37°C、1,000 RPMで15時間一晩インキュベートします。
    6. 翌日、100 μg/mLのアンピシリン(LB+AMP)と15 mLの滅菌50%(v/v)グリセロールを添加した25 mLのLB培地を調製します。
    7. マルチチャンネルピペットを使用して、各培養物30 μLをディープウェルプレートから光学式96ウェルプレートの底に移します。培養物を含む各ウェルに270 μLのLB+AMP培地を加え、各培養物の10倍の希釈を達成します。
    8. プレートリーダーを使用して、各培養物のOD600 を測定します。650 μLの新鮮なLB+AMPを開始OD600 0.2に接種するために必要な各培養物の量を計算します。計算に役立つスプレッドシートは、 補足表S1として提供されています。
    9. 3つの新しい滅菌1 mL 96ディープウェルプレートを準備します。1つのプレートに、650 μLのLB+AMPを36ウェルに加え、計算された量の一晩培養を各ウェルに接種して、OD600 = 0.2を取得します。
    10. 接種した培養物300 μLを他の2つのプレートのそれぞれに移します。1 つのプレートは培養物であり、もう 1 つのプレートは OD の監視に使用されます。培養物がOD600 ~1(~1.5〜2時間)に達するまで、プレートシェーカーで37°C、1000RPMで2つのプレートをインキュベートします。ODを1時間で監視し、必要に応じて、2番目のプレートから30 μLのサンプルを取り出し、270 μLのLB + AMPに加えて10倍に希釈することにより、もう一度監視します。
    11. 個々のウェルがOD600 ~1に達したら、シェーカーから取り出します。各培養物に等量の滅菌50%(v / v)グリセロールを添加して、25%グリセロールでOD600 = 0.5の最終濃度を達成します。よく混ぜて、これらのチューブを氷の上に保管します。これらは マスター作業ストックです。
    12. 元のウェルパターンを維持しながら、最大40 μLの各マスターストックを96ウェルPCRプレートに分注します。ストレージ容量に基づいて、できるだけ多くのプレートに分配します。ホイルプレートシールでシールし、これらのPUREスタータープレートを-80°Cで保管してください。
      注意: これらのスタータープレートは、最大3回解凍する必要があります。ひずみの完全性と再現性を維持するために、この制限を超える場合は新しいプレートと交換してください。
  3. スターター培養物の生育時間の決定(一晩)
    1. PUREスタータープレートを氷の上で解凍します。
    2. 50 μLの100 mg/mLアンピシリンを、滅菌コニカルチューブ(LB+AMP)内の50 mLの滅菌LB培地に加えます。
    3. #1-#36 の 36 x 1.5 mL 滅菌マイクロ遠心チューブにラベルを付け、各チューブに 1 mL の LB+AMP を加えます。
    4. 各グリセロールストックをそれぞれ10 μLを対応する標識チューブに加え、ボルテックスしてよく混合します。
    5. 各チューブから接種した培養物300 μLを、滅菌1 mL 96ディープウェルプレートの対応するウェルに加えます。プレートを通気性のあるプレートシールで密封し、培養プレートをプレートシェーカーで1000 RPM、37°Cでインキュベートします。 OD600 = 3を超えずに培養物がOD600~2-3に達するまでにかかる時間を決定して記録します。続行する前に、このパラメータを設定してください。
      注:私たちの研究室では、これには15時間かかります。
  4. PURE株の発現試験
    1. 100 μg/mLのアンピシリン(LB+AMP)、10 mM IPTGストック、および1xタンパク質抽出試薬を添加した38 mLのLB培地を調製します。
    2. PUREスタータープレートを氷の上で解凍します。
    3. 滅菌2 mL 96ディープウェルプレートの36ウェルのそれぞれに1 mLのLB+AMPを加えます。各ウェルに20 μLの対応するスターター培養物を接種します。プレートをプレートシェーカーで1000 RPM、37°Cで約1時間、またはOD600 = 2に達するまでインキュベートします。
    4. 各ウェルに10 μLの10 mM IPTGを添加してタンパク質発現を誘導し、最終的なIPTG濃度を0.1 mMにします。1000 RPM、37°Cで3時間インキュベーションを続けます。
    5. 3時間の発現期間の終わりに、各培養物700 μLを36 x 1.5 mL滅菌微量遠心チューブに移します。20,000 × g で 4 °C で 10 分間遠心分離します。 上清を慎重に捨てます。
    6. 各ペレットを70 μLの1xタンパク質抽出試薬に再懸濁します。細胞溶解を可能にするために、穏やかに攪拌しながら室温で30分間インキュベートします。
    7. 遠心分離機で20,000 × g で4°Cで10分間ライセートし、不溶性画分をペレット化します。
    8. 製造元の指示に従って、Ni-NTA磁気ビーズを使用して各タンパク質の小規模なHisタグ精製を実行します。
    9. SDS-PAGEを使用して精製されたタンパク質を分析し、各タンパク質の発現および/または株間の相互汚染を確認します9。
      注:タンパク質を発現する株は、標的タンパク質の予想される分子量に対応するSDS-PAGE上に明確なバンドを示します。バンドが検出されない場合は、株がタンパク質を発現していない可能性があります。このような場合は、プラスミドを単離して配列決定して配列の同一性と完全性を確認し、必要に応じてプラスミドを交換します。

2. OnePot PUREタンパク質精製(4日間)

注:1回のPUREシステム調製には、500 mLの液体培養を処理する必要があります。4 x 500 mL 調製を同時に生産して、1 回の実行で 4 つの独立した PURE バッチを生産することをお勧めします。これらのバッチは、個別に定量することも、必要に応じて組み合わせることもできます。4日間のプロトコルは、樹脂のインキュベーションステップを一晩実行することで3日間に短縮できますが、これには長い3日目が含まれます。どちらのオプションも以下で詳しく説明します。

  1. 1日目:材料の調製とスターター培養の増殖
    1. 補足表S2および補足図S1に記載されているように、PURE調製用のストック溶液およびバッファーを調製します。
      注:プロトコルの各部分を実行する直前に必要な関連する培地とバッファーを準備し、指示に従って使用前の最大日数だけ保管してください。
    2. PUREスタータープレートを氷の上で解凍します。
    3. 50 μLの100 mg/mLアンピシリンを、滅菌50 mLコニカルチューブ(LB+AMP)内の50 mLの滅菌LB培地に加えます。
    4. #1-#36 の滅菌マイクロ遠心チューブ 36 x 1.5 mL にラベルを付け、各チューブに 1 mL LB+AMP を加えます。
    5. 各グリセロールストックをそれぞれ10 μLを対応する標識チューブに加え、ボルテックスしてよく混合します。
      注:各株の接種を簡単に追跡するために、各チューブに株を追加した後、ピペットチップをPUREスタータープレートの対応するウェルに排出します。すべての株に対してこのプロセスを繰り返します。完了したら、ピペットチップをプレートから慎重に取り外してから、ホイルとオートクレーブテープで再密封し、-80°Cで保管します。
    6. 各チューブから接種した培養物300 μLを、株#25(EF-Tu)を除く滅菌1 mL 96ディープウェルプレートの対応するウェルに加えます。通気性のあるプレートシールを備えたシールプレート。培養プレートをプレートシェーカーで1,000 RPM、37°Cで14時間インキュベートします。
    7. チューブ#25から1 mLの接種培養物を50 mLのコニカルチューブ内の10 mLのLBに加えて、EF-Tuスターター培養物を調製します。チューブをインキュベーター内で260 RPM、37°Cで14時間インキュベートします。
      注:株#25、EF-Tuは、他の成分よりもはるかに高い濃度で必要であるため、元のプロトコル8に記載されているように、個別に処理されます。
    8. 2 Lの滅菌2x YTP培地を2 Lのガラス瓶に入れ、37°Cの静的インキュベーターに入れて一晩予熱します。
  2. 2日目:成長とペレット化
    1. 必要な試薬を準備します。
      1. 2 L の滅菌予熱済み 2x YTP 培地 (1 日目から)
      2. 100 mg/mL アンピシリン 2 mL
      3. 100 mM IPTG、滅菌
      4. 100 mL PBS、滅菌、氷冷
      5. 10 mL LB培地
    2. マルチチャンネルピペットを使用して、スターターディープウェルプレートとEF-Tuスターターチューブから光学式96ウェルプレートの底に各スターター培養物30 μLを移します。
    3. 培養物を含む各ウェルに270 μLのLB培地を加え、各培養物を10倍に希釈します。
    4. プレートリーダーを使用して、各培養物のOD600 を測定します。すべてのひずみはOD600 = 2-3である必要があります。
      注:培養物がOD600 = 3を超えて増殖している場合は、2x YTP + AMPを使用してOD600 = 3に希釈します(補足表S1)。生い茂ったスターターの希釈は時間がかかり、エラーが発生しやすい場合があります。そのため、予備作業セクション1.3で説明されているように、OD600 2-3に到達するために必要な正確なインキュベーション時間を確立することをお勧めします。
    5. 500 mLの予熱した2x YTP培地と500 μLの100 mg/mLアンピシリンを滅菌2.5 Lバッフルフラスコ(2x YTP+AMP)に移します。
    6. 単一の滅菌15 mLコニカルチューブに、スターター培養プレートから55 μLの各培養物と1675 μLのEF-Tu培養物を加えます。ボルテックスでよく混ぜます。
      注:これは、すべてのPURE株を組み合わせたOnePotカルチャーです。この段階で、一部の菌株を省略してノックアウト(ΔPURE)システムを作成するか、共精製を必要とする他の成分を追加することができます。
    7. このチューブの内容物を、500 mLの2x YTP+AMPを含む2.5 Lバッフルフラスコに加えます。ステップ5〜7を繰り返して、4xの独立培養物を取得します。
    8. フラスコを260 RPM、37°Cで1.5〜2時間、OD600 = 0.2〜0.3になるまでインキュベートします。
    9. OD600 = 0.2-0.3に達したら、各フラスコに500 μLの100 mM IPTGを接種し、最終誘導濃度を0.1 mM IPTGにします。
    10. 培養物を260 RPM、37°Cでさらに3時間インキュベートします。
    11. インキュベーション中に、4本の滅菌50 mLコニカルチューブを計量し、ラベルを付けます。
    12. 必要に応じて遠心分離機を4°Cに予冷し、4本のポリプロピレン共重合体遠心分離機ボトルにラベルを付けて予冷します。
    13. ラベル付きの500 mLガラス瓶4本を氷水浴に入れます。
    14. 3時間のインキュベーションの終わりに、各培養物を氷の上のガラス瓶に慎重にデカントして成長を終了します。
      注:培養物を冷却したボトルに移すことは、成長を迅速に阻止するために不可欠です:ホットフラスコを氷水浴に直接入れても、成長を効率的に終了させることはできません。特に明記されていない限り、その後のすべてのステップは氷上で行われます。
    15. 各培養物250 mLを対応する遠心分離機ボトルに加え、残りの250 mLを氷水浴に保ちながら、3,220 × g、4°Cで10分間遠心分離します。
    16. 上清を慎重にデカントし、ペーパータオルで吸い取って乾かします。
    17. 残りの250mLの各培養物を対応する遠心分離機ボトルに加え、3,220 × g、4°Cで10分間再度遠心分離します。
    18. 上清を慎重にデカントし、ペーパータオルで吸い取って乾かします。
    19. 20 mLの滅菌氷冷PBSを各遠心分離機ボトルに加え、細胞ペレットを完全に再懸濁します。
    20. 各再懸濁液を準備した50 mLコニカルチューブに移します。
    21. チューブを2,000 × g、4°Cで8分間遠心分離します。
    22. 慎重にデカントして上清を取り除きます。
    23. チューブを2,000 × g、4°Cで2分間再度遠心分離します。
    24. ピペッティングによって残留上清を除去し、細胞ペレットを氷上に保持します。
    25. 各チューブには、単一の500 mL培養物からの細胞ペレットが含まれています。各チューブの重量を量り、各チューブの空の重量を差し引いて細胞ペレットの質量(通常は~2 g)を計算し、記録します。
    26. 細胞ペレットをスナップ凍結し、溶解するまで-80°Cで保存します。
      注:オプションで、この時点で溶解ステップに直接進むことにより、プロトコルを3日で完了することができます。
  3. 3日目:溶解、精製、透析
    1. 必要な試薬を準備します。
      1. 50 mLの再懸濁バッファーを調製します。
      2. 0.5 M TCEPを調製します。
    2. 氷上で細胞ペレットを解凍します。
    3. 50 mLの再懸濁バッファーを50 mLのコニカルチューブにアリコートし、100 μLの0.5 M TCEPを加えます。ボルテックスでよく混ぜます。
    4. 細胞ペレットを再懸濁バッファー+ TCEPに、細胞ペレット1gあたり2 mLの比率で再懸濁します。ボルテックスして徹底的に再懸濁させます。
    5. 細胞再懸濁液を50 mLの円錐形チューブに分配し、各チューブに5 mLの懸濁液があるようにします。4つの独立した培養物を追跡するために、必要に応じてチューブにラベルを付けます。氷の上に保管してください。
    6. 冷却超音波処理プローブを使用して、氷水浴中で30%振幅、20秒オン、20秒オフで10サイクル、超音波処理を介して細胞を溶解します(図3A、B)。
      注:超音波処理中に約1000 Jのエネルギーを各チューブに伝達する必要があります。安全なスタンドを使用して、超音波処理中にチューブを所定の位置に保持し、エネルギー伝達の一貫性を確保します。
    7. ライセートを2 mLの滅菌マイクロ遠心チューブに分配し、各チューブに1 mLのライセートが含まれるようにします。手順2.3.6と2.3.7を繰り返して、4つの培養物すべてを溶解します。次の手順は、4つのライセートに対して並行して実行されます。
    8. 15,923 × g、4°C、20分間遠心分離します。
    9. 遠心分離中に、5 mLのタンパク質精製樹脂を洗浄して平衡化します(4つの溶解物用に4つのカラムを準備します)。
      1. 2 mLの新鮮なタンパク質精製樹脂を重力フロークロマトグラフィーカラムに加えます。
      2. カラムを30 mLの滅菌蒸留水で2回洗浄し、保存エタノールを除去します。
      3. 30 mLの再懸濁バッファーに60 μLの0.5 M TCEPを最終濃度1 mMまで補充します。
      4. カラムの容量は 30 mL なので、バッファーをカラムに直接注いで充填します。バルブが閉じていることを確認し、30 mLの再懸濁バッファー+ TCEPを加えてカラムを平衡化します。
      5. バルブを開けて~25 mLのバッファーを流し、カラムバルブを閉じて、乾燥を防ぐためにレジンベッドの上に~5 mLのバッファーを残します。これで、列を使用する準備が整いました。
    10. 遠心分離後、各培養物からすべての清澄ペレットフリー上清を氷上の4x新鮮な50 mLコニカルチューブに結合します。
    11. 各カラム内の残りの5 mLのResuspension Buffer + TCEPに樹脂を再懸濁し、ライセート上清を含む各コニカルチューブにバッファーと樹脂を加えます。
    12. 蓋を閉めてパラフィルムで密封し、ロティサリーシェーカーで4°Cで5時間インキュベートします。
      注:溶解が成長直後に行われた場合、この溶解物は樹脂とともに一晩インキュベートできます。
    13. 必要な試薬を準備します。
      1. 最終濃度1 mMのTCEPを洗浄および溶出バッファーに添加し、使用するまで4°Cで保存します。
      2. 20%(v / v)のエタノールを準備しておいてください。
    14. インキュベーション後、チューブを遠心分離機で短時間パルスして、樹脂をチューブの底に集めます。
    15. ピペットを使用して樹脂を再懸濁し、タンパク質精製カラムに樹脂を戻します。
    16. 樹脂がカラムの底のベッドに落ち着いたら、バッファーを通します。
      注:オプションで、SDS-PAGEを介して分析するために、タンパク質精製中にフロースルーと洗浄を収集し、精製手順をトラブルシューティングします
    17. 1カラム容量のWash Buffer + TCEPでカラムを洗浄します。
    18. 5 mL溶出バッファー+TCEPをカラムに加え、ピペットで樹脂を数回再懸濁し、10分間インキュベートします。
    19. インキュベーション後、溶出液を標識された5 mLビジューチューブに集め、氷上に保存します。
    20. タンパク質精製樹脂を洗浄して保管します。
      1. 溶出が完了したら、30 mLの溶出バッファーでカラムを洗浄し、残りの結合タンパク質を除去します。
      2. 樹脂を30 mLの滅菌蒸留水ですすぎ、3回繰り返します。
      3. 30 mL の 20% (v/v) エタノールをカラムに 1 回通します。
      4. カラムに20%エタノールを充填し、蓋またはパラフィルムで密封します。次回使用まで4°Cで保管してください。
        注:洗浄のみが必要です-樹脂からニッケルを剥がそうとしないでください。洗浄された樹脂は、標準的なPUREシステム調製物での再利用に適しています。ただし、ΔPUREシステムバリアントの場合は、相互汚染を避けるために常に新しい樹脂を使用してください。
    21. 15 mL の 2 kDa 透析カセットをバッファー HT(TCEP なし)に 10 分間浸します。
    22. 溶出したタンパク質溶液5 mLを透析カセットに加えます。
    23. 蓋を元に戻す前に、カセットからできるだけ多くの空気を取り除きます。
    24. 溶出したタンパク質5 mLを1 LのバッファーHT(TCEPなし)に対して2時間透析し、続いてさらに1 Lの新鮮なバッファーHTを4°Cで穏やかに攪拌しながら一晩透析します。
      注:複数の精製からの溶出液を組み合わせる場合、最大10 mLの溶出液を2 LのバッファーHTに対して2時間透析し、続いてさらに2 LのバッファーHTを4°Cで一晩透析できます。 樹脂インキュベーションを一晩行った場合、透析は、2時間続いて4時間、その後すぐに以下のタンパク質濃度ステップのプロトコルを使用して日中に実行できます。
  4. 4日目:濃縮と保管
    1. 必要な試薬の準備:
      1. バッファーHTリフレッシュ+TCEPを調製します。
      2. ストック-60 + TCEPを準備します。
    2. 透析の完了後、カセットから透析サンプル5 mLを取り出し、500 μLのアリコートを5 x 2 mL滅菌微量遠心チューブに分配します。
    3. 沈殿したタンパク質を14,000 × g、4°Cで10分間回転させてペレット化します。
    4. ペレットフリーの上清を再結合し、3 kDa MWCO遠心フィルターユニットに加え、10 mLのバッファーHTリフレッシュ+ TCEPで容量を補充します。
    5. 3,220 × g、4°Cで30分間、またはサンプル量が1.5 mLに減少するまで遠心分離します。
      注:濃縮ステップ中のタンパク質沈殿は、CFPS全体の性能を大幅に低下させる可能性があります。30分の遠心分離サイクルごとに、1 mLピペットを使用してサンプルを遠心フィルターチューブに再懸濁し、フィルターの底から沈殿したタンパク質を取り除きます。
    6. 遠心ユニットからサンプルを取り出し、500 μLのアリコートを3 x 2 mL滅菌マイクロ遠心チューブに分配します。
    7. 沈殿したタンパク質を14,000 × g、4°C、10分間スピンしてペレット化します。
    8. ペレットフリーの上清を氷上の新鮮な滅菌微量遠心チューブに再結合します。
    9. 製造元の指示に従って、ブラッドフォードアッセイを使用して溶液中のタンパク質の濃度を測定します。
    10. 新鮮な3 kDa MWCOフィルターに加え、14,862 × g、4°Cで15分間遠心分離するか、サンプル量に達するまで遠心分離して25〜30 mg/mLの最終濃度を得ることにより、タンパク質溶液を濃縮します。
    11. 遠心ユニットからサンプルを取り出し、500 μLのアリコートを2 mLの滅菌マイクロ遠心チューブに分配します。
    12. 回転させて沈殿したタンパク質を14,000 × g、4°Cで10分間ペレット化します。
    13. Bradford Assayを使用してタンパク質濃度を測定します。濃度が25〜30 mg / mLの場合にのみ、次のステップに進みます。
    14. ペレットフリーの上清を氷上の新鮮な微量遠心チューブに再結合します。
    15. 濃縮タンパク質溶液に等量のストック-60 + TCEPを加え、穏やかなピペッティングで混合します。
    16. Bradford Assayを使用して最終的なタンパク質濃度を測定します。
      注:タンパク質は現在、バッファーHT + 30%グリセロール中にあり、ストック-30でさらに希釈してもグリセロール濃度は変化しません。
    17. 必要に応じて、サンプルをストック-30 + TCEPで希釈して、最終濃度約12.5 mg/mLにします。
    18. PUREタンパク質溶液を20 μLのアリコートでPCRチューブにアリコートし、液体窒素でスナップフリーズし、-80°Cで保存します。
      注:グリセロールを含むタンパク質溶液を濃縮すると、最終CFPS反応におけるグリセロールの量が変動するため、CFPS性能が一貫しない可能性があるため、ストック-60を添加する前にタンパク質濃度を正確に測定することが重要です。したがって、ストック-60は、タンパク質濃度が25〜30 mg/mLの最適範囲内にあることを確認した後にのみ添加する必要があります。

3.粗リボソーム調製(5日間)

注:リボソーム精製プロトコルは、2 L(4 x 500 mLフラスコ)の液体培養の処理に最適化されており、合計~3 gの細胞ペレットが得られ、15〜24 μMの濃度で~1 mLの粗リボソームが得られます。

  1. 1日目:スターター培養物の調製と増殖
    1. 補足表S2および補足図S1に記載されているように、リボソーム調製用のストック溶液および緩衝液を調製する。
      注:プロトコルの各部分を実行する直前に必要な関連する培地とバッファーを準備し、示されているように使用前の最大日数だけ保管してください。
    2. 2本の50 mLコニカルチューブを準備します:1つのチューブに10 mLのLB培地を加え、もう1つのチューブに5 mLのLB培地を追加します。
    3. BL21(DE3)のグリセロールストックを-80°Cの冷凍庫から取り出し、氷の上に置き、ストックが解凍される前に次のステップが完了していることを確認します。
    4. 10 mLのLB培地にグリセロールストックから細胞を掻き取り、LBの「ミニ培養」を作成します。37°C、220RPMで、他の(非接種)チューブと一緒にインキュベートし、すべての増殖が抗生物質なしで行われるため、培地の汚染をチェックします。
    5. -80°Cの冷凍庫でグリセロールストックを交換します。
    6. 2.2 Lの滅菌Terrific Broth(TB)を滅菌ガラス瓶に入れ、37°Cの静的インキュベーターに保存して一晩予熱します。
  2. 2日目:成長とペレット化
    1. インキュベーターから培養物を取り出し、続行する前に、接種されていないチューブまたは予熱された培地ボトルに汚染がないことを確認してください。
    2. 1 cmのキュベットで900 μLのLBに100 μLのミニ培養培養物を加えて10倍希釈液を調製し、分光光度計を使用してOD600 を測定します(~4-6であることを確認します)。
    3. 200 mLの予熱した結核を滅菌500 mLコニカルフラスコに加え、適切な量のミニ培養を接種して、開始OD600 = 0.05を得る(補足表S1)。これが「ミディカルチャー」です。
    4. 中培養物を37°C、220 RPMでOD600 = 1までインキュベートし、約1.5〜2時間かかります。
    5. 4つの滅菌2.5 Lバッフルフラスコのそれぞれに500 mLのTBを加えます。それぞれに適切な量のミディ培養物を接種して、開始OD600 = 0.05(補足表S1)を取得します。これらが4つの「マキシカルチャー」です。
    6. 最大培養物を37°C、220 RPMでOD600 = 0.7〜0.8になるまでインキュベートし、約1.5〜2時間かかります。
    7. その間に、4本の清潔なポリプロピレン共重合体遠心分離機ボトルと4本の清潔な500 mLガラスボトルにラベルを付けて氷の上に置き、冷却します。
      注:OD600 = 0.7のオーバーシュートを避けるために、成長1時間後15分ごとに最大培養密度を測定します。
    8. OD600 = 0.7に達したら、培養物を冷却したガラス瓶にすばやく移し、氷水浴に20分間入れて増殖を終了します。
      注:培養物を冷却したボトルに移すことは、成長を迅速に阻止するために不可欠です:フラスコを氷水浴に直接入れても、成長が効率的に終了することはありません。特に明記されていない限り、その後のすべてのステップは氷上で行われます。
    9. 培養物が氷水浴で冷却されている間に、細胞ペレット化のために遠心分離機を予冷し、500 mLのPBS溶液を氷の上に置いて冷却します。
    10. 20分後、各培養物250 mLを対応する予冷遠心分離機ボトルに移し、残りの250 mLを氷上に保ちながら、3,220 × g、4°Cで10分間遠心分離します。
    11. 上清を慎重にデカントし、ペーパータオルで吸い取って乾かします。
    12. 各培養物の残りの250 mLを対応する遠心分離機ボトルに加え、3,220 × g、4°Cで10分間再度遠心分離します。
    13. デカントして上清を取り除き、ペーパータオルでボトルを吸い取って乾かしてから、細胞ペレットを氷の上に戻します。
    14. 30 mLの滅菌氷冷PBSを各遠心分離機ボトルに加え、細胞ペレットを完全に再懸濁します。
    15. 4x クリーンな 50 mL コニカルチューブを計量し、ラベルを貼ります。
    16. 細胞懸濁液を4 x 50 mLのコニカルチューブに移します。
    17. 3,220 × g、4°Cで10分間遠心分離します。
    18. デカントして上清を取り除き、細胞ペレットを氷の上に戻す前に、ペーパータオルでチューブを吸い取って乾かします。
    19. 30 mLの滅菌氷冷PBSを各コニカルチューブに加え、ボルテックスによって細胞ペレットを完全に再懸濁します。
    20. 3,220 × g、4°Cで10分間再度遠心分離します。
    21. デカントして上清を取り除き、細胞ペレットを氷の上に戻す前に、ペーパータオルでチューブを吸い取って乾かします。
    22. 30 mLの滅菌氷冷PBSを各コニカルチューブに加え、ボルテックスによって細胞ペレットを完全に再懸濁します。
    23. 3,220 × g、4°Cで10分間遠心分離します。
    24. デカントして上清を取り除き、細胞ペレットを氷の上に戻す前に、ペーパータオルでボトルを拭き取り乾かします。
    25. 最後に3,220 × g、4°Cで2分間遠心分離します。
    26. ピペッティングによって余分な上清を除去します。
    27. 各円錐管の質量を計量し、記録します。細胞ペレット質量は、これらの値とチューブの空の重量(~1 g)との差です。
    28. 液体窒素を使用して細胞ペレットをスナップフリーズし、-80°Cで保存します。
  3. 3日目:溶解、超遠心分離、バッファーBソーク
    1. 氷上で細胞ペレットを解凍します。
    2. 50 mLのリボソームバッファーAを清潔な円錐形のチューブに加えます。
    3. コニカルチューブから100 μLのリボソームバッファーAを取り出し、No-Weigh DTTバイアルに加えます。DTTペレットを完全に溶解して、0.5 M DTTストックを得る。
      注:ここで説明されているように、後続の0.5 M DTTストックを調製しますが、各ステップに適切なバッファーを使用します。
    4. 100 μLの0.5 M DTTを50 mLコニカルチューブに戻して、50 mLリボソームバッファーA中の1 mM DTTの最終濃度を得る。溶液を氷上に置いたままにします。
    5. 各細胞ペレットをリボソームバッファーA + DTTに、細胞ペレット1gあたり2mLの比率で、完全にボルテックスして再懸濁します。再懸濁したすべての細胞を1つの円錐形のチューブに結合して、再懸濁したスラリーの総量(2 Lの培養物から10 mL)を確認します。必要に応じて、追加のリボソームバッファーA + DTTで容量を10mLまで補充します。
    6. スラリーを別々の円錐形チューブで2 x 5 mLのサンプルに分割します。
    7. 冷却超音波処理プローブを使用して、氷水浴中で30%振幅、20秒オン、20秒オフで10サイクル(合計プログラム長3分20秒)の超音波処理により、各チューブ内の細胞を溶解します(図3A、 3C)。
      注:超音波処理中にチューブあたり約1,000 Jのエネルギーを伝達する必要があります。安全なスタンドを使用して、超音波処理中にチューブを所定の位置に保持し、エネルギー伝達の一貫性を確保します。
    8. 溶解した各サンプルの容量をリボソームバッファーA + DTTで25 mLに補充し、短時間ボルテックスして混合します。
    9. 内容物を2x冷却されたS30遠心分離チューブに移します。
    10. 30,000 × g で 4 °C で 1 時間遠心分離します (図 3E)。
    11. ペレットフリーの上清を最大75%(ペレットからの膜汚染を避けるため)を各S30チューブから2本のクリーンな予冷S30チューブに回収します。
    12. 30,000 × g で 4 °C で 30 分間遠心分離します。
    13. ペレットフリーの上清を最大75%を2本のクリーンな50 mLコニカルチューブに回収し、リボソームバッファーA + DTTでそれぞれの容量を25 mLまで補充します。
    14. サンプルを2本のきれいな予冷S100チューブに移します。
      注:超遠心分離の前に、チューブのバランスが正確に取れ(反対側のチューブ間の最大0.01 gの差)、25 mLの容量(S100チューブの最大容量)まで充填されていることを確認してください。
    15. 100,000 × g で 4 °C で 4 時間遠心分離します (図 3F)。
    16. S100ラン終了の30分前に、上記の指示に従って氷冷リボソームバッファーBを使用して0.5 M DTTストックを調製し、50 mLのリボソームバッファーBに1 mM DTTの最終溶液を生成します。
    17. デカントして超遠心チューブから上清を取り除きます。リボソームペレットを含む各S100チューブに5mLの氷冷リボソームバッファーB + DTTを加えます。残りのリボソームバッファーB + DTTを4°Cで保存して、翌日使用します。
    18. 冷蔵室の氷上でチューブをインキュベートし、リボソームペレットをリボソームバッファーB + DTTに一晩浸します。
      注:リボソームペレットがリボソームバッファーB + DTTに完全に浸されていることを確認してください。これは、チューブを氷の中に斜めに置くことで実現できます(図3D)。
  4. 4日目:超遠心分離とバッファーCソーク
    1. 翌日、さらに5 mLの氷冷リボソームバッファーB + DTTを、一晩浸したリボソームペレットを含む各S100チューブに加えます。
    2. ピペッティングによるペレットの再懸濁を穏やかに試みます。ピペットチップを使用してチューブ壁からペレットをこすり落とし、この方法で再懸濁します。内容物を2本のきれいな予冷S30チューブに移します。
    3. さらに10 mLの氷冷リボソームバッファーB + DTTをリボソームペレットを含む各S100チューブに加え、上記のように再懸濁ステップを繰り返します。
    4. 以前と同じS30チューブにリサスペンションを照合します。
    5. 30,000 × g で 4 °C で 1 時間遠心分離します (図 3G)。
    6. ペレットフリー上清を最大75%回収して2本のクリーンな50 mLコニカルチューブに回収し、リボソームバッファーB + DTTで容量を25 mLまで補充します。
    7. このサンプルを2本のクリーンな予冷S100チューブに移します。
      注:超遠心分離の前にチューブのバランスが正確に取れ、25 mLの容量(S100チューブの最大容量)まで充填されていることを確認してください。
    8. 100,000 × g で 4 °C で 4 時間遠心分離します (図 3H)。
    9. S100実行終了の30分前に、上記の手順に従って氷冷リボソームバッファーCを使用して0.5 M DTTストックを調製し、5 mLのリボソームバッファーCに1 mM DTTの最終溶液を生成します。このバッファーを氷上に置いてください。
    10. 超遠心分離後、上清を廃棄し、ピペッティングによって残留バッファーを除去します。ペレットを緩衝液で覆われていないままにしておくのが長時間ならないように、迅速に作業してください。
    11. 400 μLの氷冷リボソームバッファーC + DTTを、リボソームペレットを含む各超遠心チューブに加えます。
    12. 冷蔵室の氷上でチューブをインキュベートし、リボソームペレットをリボソームバッファーC + DTTに一晩浸します。
      注:リボソームペレットがリボソームバッファーC + DTTに完全に浸されていることを確認してください。これは、チューブを氷の中に斜めに置くことで実現できます。
  5. 5日目:収集
    1. 翌日、1 mLピペットを使用してリボソームペレットを穏やかに再懸濁し、穏やかに旋回させて透明なハロリボソームペレットを完全に溶解します。
      注:リボソームペレットは、この段階でバッファーに完全に溶解する必要があります:この時点で不溶性ペレットはあってはなりませんが、黄色の不溶性ペレットが残っている場合は、再懸濁しようとしないでください:透明なハローリボソームペレットのみを再懸濁します。
    2. リボソーム溶液を2本の滅菌2 mL微量遠心チューブに移し、20,000 × g で4°Cで10分間遠心分離して、残りの不溶性物質をペレット化します。
    3. ペレットフリーの上清をきれいなチューブに集め、氷上に保存します(図3I)。
    4. 2 μLを198 μLのリボソームバッファーCに3回ずつ加えて、リボソーム溶液の100倍希釈液を作成します。
    5. 260 nmでRNAの濃度を測定します。希釈したサンプルの10吸光度単位は、24μMのリボソームに相当します13。
    6. リボソーム溶液をアリコートし(ユーザーのニーズに応じて、例えば50 μLのアリコートで)、最大濃度24 μMの液体窒素中でスナップフリーズし、使用するまで-80°Cで保存します。
      注:プロトコルは、12〜18μM濃度で約1 mLのリボソームにつながるはずです。リボソームが希薄すぎる場合は、3 kDa MWCOフィルター8を使用して濃縮を達成できます。

4. CFPS実験の設定

  1. 予備作業
    1. 確立されたプロトコル9に従ってDNAテンプレート(線状またはプラスミド)を調製します。
      注:私たちの研究室では、無細胞発現に最適化されたT7p14発現システムに基づくDNAテンプレートを使用しています14。精製されたPCR産物は、リニアテンプレートとして使用できます。プラスミドはミニプレップ後にクリーンアップする必要があり、市販のキットが異なれば結果も異なることに注意することが重要です15。
    2. 表3に示すように、5倍のエネルギー溶液を調製します。
    3. 表4に示すように、6xマトリックス溶液を調製します。
  2. PURE 反応の設定と監視
    注:このプロトコルは、マスターミックスを使用した3回測定のセットアップについて説明します。反応数は、 補足表S3に示されているスプレッドシートを使用して、必要に応じてスケールアップまたはスケールダウンできますが、1つの実験条件に対して少なくとも3回の繰り返しをお勧めします。
    1. 解凍には、氷上のPURE、リボソーム、エネルギー溶液、マトリックス溶液のアリコートが必要でした。
    2. 表 5に示すように、PCRチューブで合計17 μLの3回反応の1セット用のマスターミックスを、エネルギー溶液、PUREタンパク質、リボソーム、マトリックス溶液、ヌクレアーゼフリー水の順序で組み立てて調製します:エネルギー溶液、PUREタンパク質、リボソーム、マトリックス溶液、ヌクレアーゼフリー水を17 μLまで。
    3. ピペットを5.1 μLに設定し、溶液を5〜6回穏やかに吸引して混合し、均一性を確保します。
    4. 同じピペット設定(5.1 μL)を使用して、マスターミックスを光学式384ウェルプレートの3つの個別のウェルにロードします。気泡の形成を防ぐために、ピペットを最初のストップを超えて押し込まないでください。蛍光クロストークを最小限に抑えるために、各反復の間に1つのウェルスペースを残します。
    5. 粘着プレートシールを使用してプレートをシールします。
    6. 必要に応じて、下流のインキュベーションまたはプレートリーダーの測定を続行します。
      注:グリセロールを含む追加の成分(エンハンサータンパク質など)を組み込む場合は、そのような成分の最終量が反応量の10%を超えないようにしてください。たとえば、グリセロールが 30% の成分は、マスターミックス 17 μL あたり 1.7 μL に制限する必要があります。
      ロード後に384ウェルプレートを遠心分離しないでください。遠心分離により、グリセロールが豊富な成分(PUREシステムなど)が分離され、発現レベルが一貫しなくなる可能性があります。プレート設計は少量の反応をサポートし、慎重なピペッティングにより遠心分離なしで適切な沈降が保証されます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

PUREおよびリボソーム調製のワークフローを 図1に示し、作業の推奨スケジュールを 表1に示します。通常、反応はGFPやmCherryなどの蛍光タンパク質の産生を通じて監視され、RFUの読み取り値はキャリブレーション11によって濃度に変換できます。ただし、CFPS収量は生成される特定のタンパク質に依存するため、Thorntonら16によって説明されているように、目的の目的のタンパク質を生成するようにシステムを最適化することが重要です。最適化の出発点は、「行列解」の成分の変動であり、エネルギー解の残りの部分とは分離されています。これらの成分には、DNAテンプレート、グルタミン酸カリウム、酢酸マグネシウム、およびtRNAが含まれます。このように溶液を調製することで、特定の一連の実験に対して複数のマトリックス溶液を生成でき、...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

私たちは、同じラボで複数のバッチとユーザーにわたって再現可能なPUREシステムを取得できる詳細な手順を提示しました。これを達成するには、いくつかの重要なステップが必要です。

最初の重要なステップは、36のPURE株の完全性を確保することです:すべてのプラスミドのシーケンシングに加えて、単一の株が失われるとCFPS活性が廃止される可能性があるため、すべての株が正しく過剰発現していることを確認するための発現試験を実施することが不可欠です。突然変異による発現の喪失と、1つの株に複数の株が存在する汚染の両方を観察しました。2番目のシナリオは、ノックアウトΔPUREシステムが必要な場合に排除することが重要です。将来の研究では、Zhangらが提案したように、PUREシステムをより安定したプラスミドと株に合理化することが有利です10:彼らのアプローチは、既存のプロトコルとシームレスに組み合わせることができます。

グリセロールス...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

SLは、ファージエンジニアリング用の無細胞技術を開発するBiophoundry Inc.の共同創設者兼CTOです。

謝辞

NL、SL、AB、およびNZは、NLのUKRIフューチャーリーダーズフェローシップ(MR / V027107 / 1)によってサポートされています。SLは、Biophoundry Inc.によってさらにサポートされています。SYは、エジンバラ大学のダーウィントラスト博士課程の学生によってサポートされています。CW は、BBSRC Eastbio 博士課程の学生によってサポートされています。著者らは、Wellcome Discovery Research Platform for Hidden Cell Biology [226791] からの資金提供によって支援された超遠心分離機の使用を支援してくれた A. Pompa に感謝しています。さらに、元のOnePotプロトコルの設定に協力してくれたB. LavickovaとS. J. Maerklに感謝します。オープンアクセスの目的で、著者は、この投稿から生じる著者承認原稿バージョンにクリエイティブ・コモンズ表示(CC BY)ライセンスを適用しました。 図 1 は、BioRender で部分的に作成されています。ラオハクナコーン、N. (2025) [https://BioRender.com/wj65i81]。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2倍のYouTubetシグマY2377-250G
アミノ酸シグマLAA21-1KT
アンモニウム酢酸RNAseフリーサーモ・サイエンティフィックAM9070G
塩化アンモニウムシグマ09718-1KG
アンピシリンシグマA8351-5G
BL21(DE3)適合した大腸菌NEBC2527H
ボトル、遠心分離機(ナルゲン)サーモ・サイエンティフィック3120-9500ポリプロピレン共重合体ボトル
ボトル、ガラス(デュラン) 250 mL、500 mL、1 L、2 LVWR215-1593, 215-1594, 215-1595, 215-1596
ブラッドフォードアッセイ、クイックスタート 1x染色試薬バイオ・ラッド5000205
遠心機サーモ・サイエンティフィックヘレウス・メガフュージ16R
遠心分離機、マイクロエッペンドルフ5424R 
クロマトグラフィーカラムバイオ・ラッド7321010
クレアチンリン酸シグマ27920
キュベット、セミマイクロ 1.6 mLフィッシャーブランドFB55147
ジナトリウム水素オルトホホスフェ酸二水和物フィッシャー・ケミカルS/4450/60
透析カセット、スライドAライザーG3、2 kDa MWCO、15 mLサーモ・サイエンティフィックA52962
二カリウム水素オルトリン酸無水フィッシャー・ケミカルP/5240/60
DTTノーウェイトサーモ・サイエンティフィックA39255
フィルターユニット、遠心3kDa MWCO Amicon Ultra 15EMDミリポアUFC900324
フラスコ、500 mLVWR214-1133
フラスコ、バッフル2.5 L トゥネアSS-5013
フォリン酸シグマF7878-100MG
グリセロールシグマG5516-1L
塩酸塩フィッシャーブランドH/1200/PB17
HEPESバッファー、1 M溶液、pH 7.3サーモ・サイエンティフィックBP299
イミダゾールシグマI2399-500G
孵卵器エッペンドルフニューブランズウィック州イノバリッジ;42
IPTGサーモ・サイエンティフィックR0392
KOHペレットサーモ・サイエンティフィックP1767-500G
L-グルタミン酸 ヘミマグネシウム塩 四水和物シグマ49605-250G
L-グルタミン酸 一カリウム塩 一水和物シグマ49601-500G
酢酸マグネシウム四水和物シグマM5661-50G
塩化マグネシウムフルーカ63020-1L
磁気攪拌装置スチュアートUS152
ナノドロップサーモ・サイエンティフィックナノドロップ2000
NEBExpress Ni-NTA マグビーズNEBS1423S
パラフィルムシグマP7543-1EA
ピペット、多チャネル Eppendorf Research Plus 30-300 およびマイクロ;Lエッペンドルフ3125000052
プレートリーダー用のプレート接着シールエクセルサイエンティフィックSTR-SEAL-PLT(無菌)
プレート通気性シールスターラブE2796-3005
プレートホイルシールエクセルサイエンティフィックFCS-25
ナンバープレートリーダーバイオテックシナジーH1
プレートシェーカーオールシェンMBI100-4A
プレート、384井戸サーモ・サイエンティフィック242764
プレート、96深井戸 1 mLサーモ・サイエンティフィック736-0601
板、96深井2 mLサーステット82.1972.002
プレート、96ウェルPCRサーステット721,978
プレート、光学96井戸サーモ・サイエンティフィック10057581
塩化カリウムシグマP5405-500G
二水素オルトリン酸カリウムフィッシャー・ケミカルP/4800/53
タンパク質抽出(バグバスター)試薬EMDミリポア70584-3
タンパク質精製樹脂(cOmplete)ロシュ5893682001
ロティサリーシェイカースターラブRM-マルチ1
塩化ナトリウムフィッシャー・ケミカルS/3105/70
ソニックプローブ、フィッシャーブランド 15-50 mLサーモ・サイエンティフィック12931181
ソニケーターフィッシャー・サイエンティフィックFB120
分光 光度 計ジェンウェイジェノバ・プラス
スペルミジンシグマS2626-1G
TCEP 0.5 Mスペルコ646547
サーモフィッシャーNTP、トリスバッファーサーモ・サイエンティフィックR1481
大腸菌からのtRNA MRE600ロシュ10109541001
トリプトンフォーミディアムTRP02
チューブ、0.2 mL PCRグレードサーステット72,737,002
チューブ、ビジュー ステリリン 7 mL ポリスチレンサーモ・サイエンティフィック129A
チューブ、円錐形(ファルコン)15 mLサーステット62.554.502
チューブ、円錐形(ファルコン)50 mLサーステット62.547.254
チューブ、マイクロ遠心分離機(エッペンドルフ)1.5 mLサーステット72.690.001
チューブ、マイクロ遠心分離機(エッペンドルフ)2 mLサーステット72.695.700
チューブ、S100遠心分離 ベックマン・コールター355619
チューブ、S30遠心分離 サーモ・サイエンティフィック3118-0050
超遠心分離機ベックマン・コールターオプティマ XPN-100
超遠心分離機ローターベックマン・コールター70Ti固定角ローター
UltraPure DNase/RNaseフリー蒸留水サーモ・サイエンティフィック10977049
渦巻VWR444-2791
酵母抽出物オキソイドLP0021T

参考文献

  1. Laohakunakorn, N., et al. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Front Bioeng Biotechnol. 8 (213), 1-26 (2020).
  2. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nat Rev Genet. 21 (3), 151-170 (2019).
  3. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat Biotechnol. 19 (8), 751-755 (2001).
  4. Shimizu, Y., Ueda, T. Pure technology. Methods Mol Biol. 607, 11-21 (2010).
  5. Wang, H. H., et al. Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis. ACS Synth Biol. 1 (2), 43-52 (2012).
  6. Shepherd, T. R., et al. De novo design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module. Nucleic Acids Res. 45 (18), 10895-10905 (2017).
  7. Villarreal, F., et al. Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery. Nat Chem Biol. 14 (1), 29-35 (2018).
  8. Lavickova, B., Maerkl, S. J. A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system. ACS Synth Biol. 8 (2), 455-462 (2019).
  9. Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo, C. OnePot PURE cell-free system. J Vis Exp. (172), e62625(2021).
  10. Zhang, Y., et al. Optimizing protein expression in the One-Pot PURE system: insights into reaction composition and translation efficiency. ACS Synth Biol. 14 (5), 1496-1508 (2025).
  11. Yadav, S., Perkins, A. J. P., Liyanagedera, S. B. W., Bougas, A., Laohakunakorn, N. ATP regeneration from pyruvate in the PURE system. ACS Synth Biol. 14 (1), 247-256 (2025).
  12. Doerr, A., et al. Modelling cell-free RNA and protein synthesis with minimal systems. Phys Biol. 16 (2), 025001(2019).
  13. Christodoulou, J., et al. Heteronuclear NMR investigations of dynamic regions of intact Escherichia coli ribosomes. PNAS. 101 (30), 10949-10954 (2004).
  14. Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. The all-E coli TXTL toolbox 3.0: new capabilities of a cell-free synthetic biology platform. Synth Biol. 6 (1), 1-8 (2021).
  15. Romantseva, E., Alperovich, N., Ross, D., Lund, S. P., Strychalski, E. A. Effects of DNA template preparation on variability in cell-free protein production. Synth Biol. 7 (1), 1-17 (2022).
  16. Thornton, E. L., Boyle, J. T., Laohakunakorn, N., Regan, L. Cell-free protein synthesis as a method to rapidly screen machine learning-generated protease variants. ACS Synth Biol. 14 (5), 1710-1718 (2025).
  17. Laohakunakorn, N. Cell-free 3PGA energy solution. , Protocols.io. (2020).
  18. Kalpaxis, D. L., Theocharis, D. A., Coutsogeorgopoulos, C. Kinetic studies on ribosomal peptidyltransferase: the behaviour of the inhibitor blasticidin S. Eur J Biochem. 154 (2), 267-271 (1986).
  19. Blaha, G., et al. Preparation of functional ribosomal complexes and effect of buffer conditions on tRNA positions observed by cryoelectron microscopy. Methods Enzymol. 317, 292-309 (2000).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

さらに記事を探す

PUREシステムリボソーム調製合成生物学超遠心分離GFP蛍光吸光度正規化グリセロール濃度タンパク質発現
再現性のある無細胞タンパク質合成のためのOnePot PUREおよび粗リボソーム生産の精製
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。