方法論記事

ナチュラルキラー細胞活性化の迅速なラベルフリー分析のためのフィールド展開可能なレンズフリーイメージングプラットフォーム

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DOI：

10.3791/68834

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2025年8月8日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electronics and Information Engineering, Korea University, 2Department of Biotechnology and Bioinformatics, Korea University, 3Metaimmunetech Inc., 4Department of Gastroenterology and Hepatology, Guro Hospital, Korea University College of Medicine, 5Department of Laboratory Medicine, Anam Hospital, Korea University College of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、レンズフリーシャドウイメージング技術を使用して、ナチュラルキラー(NK)細胞数および活性の迅速な単一細胞分析のためのラベルフリー法を記述しています。この方法は、回折パターンをコンピュータで分析することにより、個々のNK細胞の形態学的変化を定量化します。

要約

ナチュラルキラー(NK)細胞は、ウイルスに感染した悪性細胞を排除する自然免疫の重要なエフェクターです。NK細胞活性のモニタリングは、免疫機能を評価するために不可欠です。しかし、フローサイトメトリーなどの従来の方法は、手間と時間がかかります。このプロトコルは、レンズフリーシャドウイメージング技術(LSIT)を使用してナチュラルキラー(NK)細胞活性を迅速に分析するためのラベルフリー技術を説明しています。末梢血から単離され、独自の活性化剤で刺激されたNK細胞は、LSITプラットフォームを使用して5分以内に分析されました。LSITプラットフォームは、NK細胞への光の干渉によって生成される影画像と呼ばれるホログラフィック画像をキャプチャし、影パラメータの変化を分析することでその活性化状態を監視します。ピーク間距離(PPD)や二次最大幅の標準偏差(WSM-SD)など、シャドウ画像から導き出された主要なパラメータは、細胞の形態と内部の複雑さを定量的に反映しました。これらのパラメータは、複合シャドウパラメータ(CSP)と自然免疫指数(I3)に統合され、細胞の形態学的変化に基づいてNK細胞活性の包括的な評価と定量化が提供されました。活性化後のCSPの変化率として計算されたI3は、NK細胞活性の直接的な尺度として機能しました。健康な人のNK細胞は、免疫不全の人のNK細胞よりも一貫して有意に高いI3 値を示しました。LSITプラットフォームは、ポイントオブケア診断に適した、迅速かつ費用対効果の高い免疫プロファイリングを可能にします。

概要

細胞形態は、分子メカニズムの重要な指標として浮上しています。細胞構造を視覚的に表現するだけでなく、個々の細胞の根底にあるプロセスと機能についての貴重な洞察も提供します1。免疫細胞の形状、サイズ、活性を単一細胞レベルで分析すると、免疫細胞の挙動、不均一性、健康と病気における役割についての重要な洞察が得られます2,3,4,5,6。

これらの重要な細胞の中には、自然免疫系の中心的な構成要素であるナチュラルキラー(NK)細胞があります7,8。それらは、ウイルスに感染した癌細胞を排除し、サイトカイン放出を通じて適応免疫応答を調節します 9,10,11。癌、ウイルス感染、および免疫不全は、しばしばNK細胞の数を減少させ、それらの機能を損ないます12,13,14。したがって、NK 細胞の活性化は重要なバイオマーカーとして機能し、免疫系の全体的な健康状態に関する情報を提供します。したがって、NK細胞活性化の迅速な単一細胞評価は、予後、診断、疾患モニタリング、および患者の層別化に不可欠です15,16,17,18。

現在、NK細胞活性は、細胞毒性能力(標的細胞を殺す能力)とサイトカイン産生に基づいて評価されています19,20,21,22。クロム−51(51Cr)放出アッセイ24,25、フローサイトメトリーアッセイ26,27、および刺激後にNK細胞によって分泌されるインターフェロンガンマ(IFN-γ)を定量化するための酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)などの細胞媒介性細胞毒性23を測定するための従来の方法28,29,30いくつかの制限があります。これらには、標準化の欠如、長いプロトコル(一晩のELISAインキュベーションなど)、細胞標識への依存、および高額な機器コストが含まれます31,32,33。これらの課題は、迅速な結果、費用対効果、ラベルフリー分析、高スループットを提供する革新的な方法の必要性を浮き彫りにしています。さらに、単一細胞レベルでのNK細胞活性化の評価は、集団の不均一性と刺激に対する個々の細胞応答に関する詳細な洞察を提供します。

これらの制限を克服することを目的とした新興技術の中で、レンズフリーシャドウイメージング技術(LSIT)は、特に効果的なソリューションである34,35,36。LSITは、簡素化されたデジタルインラインホログラフィー(DIH)であり、単一細胞分解能37,38,39でNK細胞活性化の迅速でラベルフリーのハイスループット分析を可能にします。DIHは、散乱レーザー光とデジタルセンサー上の同一線上の基準ビームとの間の干渉パターンをキャプチャして、微視的物体40,41に関する3次元(3D)情報を再構築します。LSITは、部分的にコヒーレントなLED、マイクロピンホール、およびCMOSセンサーを使用して、セル42、43、44、45の回折パターン(すなわち、影の画像)をキャプチャすることにより、このアプローチを簡素化します。この技術の理論的根拠は、免疫細胞の活性化が、細胞サイズ、形状、細胞質粒度、および核構造の変化を含む形態学的変化を引き起こすことが多いという観察に基づいています46,47,48,49,50。LSITはこれらの変化に非常に敏感であり、回折パターン51,52,53に直接影響します。

これらの形態学的変化に対するLSITの感受性と回折パターンへの影響に基づいて、このプロトコルは、Cellytics NKプラットフォーム(以下、LSITプラットフォーム54と呼びます)を使用して、単一細胞レベルでのNK細胞数および機能活性を迅速かつ正確に定量するための新しい方法を提示します。図1Aに示すように、LSITプラットフォームは、サンプル処理、活性化、およびシャドウイメージングをコンパクトなマルチチャネルワークフローに統合します。NK細胞を全血から単離し、特別に配合された活性化刺激カクテル(ASC)で刺激し、専用のアッセイチップにロードしました。ASCは、曝露後1時間以内に、細胞サイズの増加や内部複雑さなどのNK細胞の形態学的変化を誘発し、LSITプラットフォーム55,56を用いて正確に検出することができる。

LSITプラットフォームは、LED光源とCMOSセンサーを使用して、個々のセルのDIHパターン(影)をキャプチャします(図1B)。次に、特別なアルゴリズムがこれらのシャドウパターンを分析し、細胞サイズと相関するピーク間距離(PPD)や、細胞質の複雑さと不規則性と相関する二次最大値の幅の標準偏差(WSM-SD)などの主要なパラメータを抽出します(図1C、D)。刺激前後の値を比較することにより、プラットフォームは複合指数を計算します: 複合シャドウ パラメーター (CSP = PPD × WSM-SD) と自然免疫指数 (I³) は、活性化後の CSP の変化率を反映します。CSPを導入する理由は、免疫活性化には細胞の肥大と細胞質の複雑さの増加の両方が伴うためです。2 つの基準のうちの 1 つだけに依存すると、境界線のアクティブ化を見逃したり、破片や不規則な照明などのノイズの影響を受けたりする可能性があります。CSP は、両方のメトリックで一貫したシフトを要求することで、分類を改善します。これらの指標は、蛍光標識や複雑なサンプル処理を行わずに、さまざまな細胞集団の活性化状態を分類します。

このプロトコルは、免疫細胞の活性化誘発性形態学的変化をモニタリングするために、迅速で定量的かつラベルフリーの方法を必要とする研究者や臨床医にとって特に役立ちます。基礎免疫学研究、前臨床薬物スクリーニング、免疫療法の評価に適しており、免疫状態の迅速な評価が不可欠な臨床現場での診断または予後ツールとして使用できます。この方法には、単離された細胞集団、LSITプラットフォームへのアクセス、および特定のNK細胞活性化カクテルが必要です。

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プロトコル

すべての研究は施設のガイドラインに従い、高麗大学安岩病院の治験審査委員会によって承認されました (承認番号: 2021AN0040)。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。

1. サンプルの採取と取り扱い

注:すべてのヒト血液サンプルは、標準的なバイオセーフティ対策と適切な個人用保護具を使用して取り扱ってください。

  1. 無菌ヘパリンチューブ内の患者から末梢全血を無菌で収集します。
  2. チューブを8〜10回静かに反転させて、抗凝固剤を血液と混合します。
  3. 採取後すぐに血液サンプルを分析します。分析が遅れる場合は、サンプルを2〜8°Cのヘパリン化チューブに保存し、48時間以内に使用してください。
    注:全血を凍結しないでください。細胞の完全性を維持するために、新鮮なサンプルを使用します。

2. NK細胞の単離と活性化

注:このプロトコルは、細胞単離用のNK Sepキットと刺激用のNK活性化キットで構成されるNK準備キットを使用して、ヒト全血から直接NK細胞を単離および活性化するための最適化された包括的なワークフローを提供します。このキットは、磁気ビーズベースのネガティブセレクションと刺激を統合し、レンズフリーのイメージングサイトメトリープラットフォーム を介して 迅速な表現型評価を可能にします。

  1. 事前テストのセットアップ
    1. 冷蔵庫からキットを取り出し、室温(15〜28°C)に戻します。
      メモ: NK Sep キットには、次のコンポーネントが含まれています。
      (a)緑色の蓋:抗体カクテルが入った反応チューブ。
      (b)赤い蓋:希釈培地(1.5 mL)に磁性粒子を含む分離チューブ1。
      (c)紫色の蓋:磁性粒子が入った分離管2。
      (d)灰色の蓋:回収チューブ(清潔で空)。
      NK アクティベーション キットには、次のコンポーネントが含まれています。
      (a) 車両: 密封されたアルミニウム袋に入った 8 本の透明チューブ。
      (b)ASC:密封されたアルミニウム袋に入った8本の黄色のチューブ。
      密封された袋から必要なチューブだけを取り出します。未使用のコンポーネントは再密封して冷蔵します。
    2. 必要な機器を準備します:磁気分離器、滅菌チップ付きピペット、37°Cに設定された校正済みのインキュベーターまたは加熱ブロック。
  2. NK細胞単離手順
    1. 抗体カクテルの入った緑色のキャップが付いた反応チューブに0.5mLの全血を加えます。チューブを2〜3回反転させて穏やかに混合し、5分間インキュベートします。
    2. 内容物全体を赤いキャップ付きの分離チューブ1に移します。2〜3回穏やかに混ぜます。
    3. チューブを磁気分離器に置き、室温で10分間インキュベートします。
    4. 磁石を所定の位置に置いた状態で、約1.5mLの上清を紫色のキャップ付きセパレーターチューブ2に移します。2〜3回穏やかに混ぜます。
    5. 分離チューブ2を磁気スタンドに置き、10分間インキュベートします。
    6. 磁石を取り付けたまま、約1.0mLの上清を灰色の蓋付きの回収チューブに移します。慎重に混ぜます。
  3. NK細胞の活性化
    1. 単離したNK細胞懸濁液100 μLをビヒクルチューブに加え、さらに100 μLをASCチューブに加えます
    2. 2本のチューブの内容物を注意深く混ぜます。
    3. チューブを37°Cで1時間インキュベートします。
      注:校正された加熱ブロックを使用して、一定のインキュベーション温度を維持します。

3. LSITプラットフォームによるイメージングと解析

注:細胞はインキュベーション直後に分析する必要があります。即時分析が不可能な場合は、インキュベートした細胞を2〜8°Cで保存し、6時間以内に分析します。LSITプラットフォームは、DIHを使用してヒト血液サンプルの細胞形態とカウントを評価します。免疫活性を分析するために、刺激されていないNK細胞とASC刺激されたNK細胞の両方を特別なスライドにロードし、デバイスに挿入し、自動的に画像化しました。

  1. デバイスのセットアップとキャリブレーション
    注:サンプルを分析する前に、必ずバックグラウンドキャリブレーションを実行してください。
    1. LSIT プラットフォームをオンにします。LED、ファン、カメラが機能していることを確認します。
    2. LSIT Captureソフトウェアを起動します。IDとパスワードを入力してログインします。
    3. [設定]に移動し、[キャリブレーション]を選択します。
    4. タッチスクリーンの開くボタンを押すか、物理的なスライドドアボタンを使用してドアを開きます。引き出しが開いたら、キャリブレーションスライドを取り外して保管してください。
    5. テストスライドが存在しないことを確認します。引き出しを閉じます。
      メモ: スライドの表面を清掃するには、光学ワイプのみを使用してください。
    6. [ 背景の設定 ]をクリックして、光学強度を調整します。
    7. キャリブレーションスライドを元に戻し、引き出しを閉じます。
    8. [ キャリブレーションの開始]をクリックします。
      注意: デバイスに液体がこぼれた場合は、すぐに電源を切ります。きれいに拭いてください。デバイスを分解しないでください。
  2. アッセイスライドの準備とローディング
    1. アッセイスライドをパウチから取り出し、サンプルデータでラベルを付けて、清潔で平らな面に置きます。
    2. 10 μLのビヒクル(非刺激)サンプルをチャネルAとBにピペットで入れます。
    3. ASC刺激サンプル10 μLをチャネルCおよびDにピペットで移します。
      注:気泡の形成や過剰充填は避けてください。
    4. [ 開く] を押してドロワーを取り出し、キャリブレーションスライドを取り外して、収納ボックスに入れます。
    5. 準備したアッセイスライドを挿入し、 閉じるを押します。
  3. 画像取得:テストメニュー1 - NK細胞活性
    メモ:画像取得に失敗した場合は、照明とサンプル量を確認してください。必要に応じて再調整します。
    1. LSITシステムにログインし、メイン画面で NK細胞活性テスト を選択します。
    2. サンプルIDを入力するか、バーコードスキャナーを使用します。
      注:アーカイブされたリストからサンプルIDを取得するには、[取得]ボタンを使用します。
    3. キャプチャ ー を押して、記録を開始します。
    4. 画像をキャプチャしたら、[分析] をクリックします
    5. 画面に表示されているNK細胞活性(%)と細胞数を確認します。
      注:有効な結果は数値で表示されます。I3 が範囲を下回っている場合は「≤100%」と表示されます。範囲の上には「>300%」と表示されます。
    6. 結果をUSBにダウンロードするか、タッチスクリーンメニューを使用して印刷します。
  4. 画像取得:テストメニュー2 - 細胞計数
    1. メインインターフェイスの[テスト]メニュー2で[ セルカウント] オプションを選択します。
    2. 10 μLのサンプルを新しいアッセイスライドチャネルにロードします。
    3. スライドを挿入し、引き出しを閉じて、サンプルIDを入力します。
    4. 該当する場合は、希釈係数を入力します。
    5. カウント を押します。
      注:結果がテスト範囲内にある場合、NKセルの数はシステム画面に数値として表示されます。試験範囲を下回る結果は「≤10細胞/μL」、1,000細胞/μLを超える結果は「>1,000細胞/μL」と表示されます。
    6. 結果をセル/μLとして表示します。
      注:黒い結果フィールドを切り替えて、画像内の実際のセル数を表示します。
    7. 結果を確認し、ダウンロードまたは印刷します。
      注:正確な結果を得るには、正しい希釈係数が入力されていることを確認してください。

4. 分析後のクリーンアップ

  1. 開 く ボタンまたは物理的なトグルスイッチを使用して引き出しを開きます。
  2. 使用済みのスライドを取り外します。
  3. センサーを保護するために、キャリブレーションスライドを引き出しに戻します。
  4. 引き出しを閉じます。
  5. 使用済みのチューブ、チップ、スライドは、実験室廃棄物の規制に従って廃棄してください。

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結果

このプロトコルに従って、LSITプラットフォームは、細胞の形態学的変化に基づいてNK細胞活性化の定量的でラベルフリーの評価を可能にします。 図2A は、ASCの有無にかかわらず、2時間インキュベーション後の健康なドナーからの初代NK細胞のHema-3染色サイトスピン調製物を示しています。ASCによる活性化は、ビヒクル(刺激されていない)コントロールと比較して、主に細胞の拡大と内部の複雑さまたは粒度の増加など、顕著な変化をもたらします。これらの変化は影回折パターンの形でキャプチャされ、統合ソフトウェアを使用してLSITプラットフォームによって分析され、各セルの主要な形態計測パラメータが抽出されます(図2B)。このプロトコルは、異なるNK細胞の活性化状態を効果的に区別し、全体的な自然免疫機能の評価を可能にします。

シャドウパラメータの再現性を評価するために、ビヒクルとASC刺激の両方の条件下で900を超える個々のNK細胞を分析しました。ASC活性化NK細胞の影画像は、...

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ディスカッション

このプロトコルは、NK Prep Kitを使用した細胞の単離と活性化を組み合わせた、NK細胞活性化を定量するための標準化されたラベルフリーの方法と、LSITプラットフォーム を介した 分析を提示します。 51Cr 放出、フローサイトメトリー、ELISA などの従来のアッセイに代わる迅速かつ定量的な代替手段を提供します。このプロトコルは、LSITプラットフォームを備えたラボ向けに開発され、NK細胞の数とI3のシャドウ画像分析に基づいて簡単な結果を提供します。その単一細胞分解能は、ELISAなどの質量アッセイでは不可能な詳細な洞察を提供します。

このワークフローの重要な要素は、負の磁気選択による細胞単離の正確な実行と試薬の標準化された取り扱いです。NK細胞調製の品質と純度は、シャドウ画像の鮮明さとパラメータの抽出に影響します。ASC 刺激中のばらつきを最小限に抑え、細胞の完全性を維持するには、採血中の溶血を防ぎ、サンプルを迅速に処理し、試薬が室温にあることを...

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開示事項

I.L.、S.H.、H.S.J.、およびS.S.は、この調査で提示されたLSITプラットフォームの開発と商業化に携わる企業であるMetaimmunetech Inc.と提携しています。具体的には、H.S.J.が創業者兼CEO、S.H.がCEO、S.S.がCTOです。ただし、著者らは、この原稿の結果と解釈は客観的に報告されており、いかなる種類の商業的利益にも影響されないことを確認します。他のすべての著者は、利益相反を宣言していません。

謝辞

本研究は、韓国研究財団(NRF)の基礎科学研究プログラム(助成金#:RS-2024-00353675、助成金#:2021R1I1A3056109)、IITP(情報通信技術企画評価研究所)が主管するITRC(情報技術研究センター)支援プログラム、および科学技術情報通信部(MSIT)が資金提供する研究開発成果事業化推進機構(COMPA)の支援を受けました。 韓国(助成金#: IITP-2025-RS-2023-00258971(50%)、助成金#: 2710084652)、韓国海洋水産部が資金提供する韓国海洋科学技術振興院(KIMST)支援プログラム(助成金#: 20210660)、高麗大学助成金。著者らは、高麗大学から移転された技術に基づいて、Cellytics NKデバイスの開発におけるMetaimmunetech Inc.の協力に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.7 mLマイクロ遠心チューブアクシゲンMCT-175-C滅菌、DNase/RNaseフリー
アッセイスライドメタイミュネテックAS050-GCellytics システム専用スライド
50 枚のスライドを箱に入り
ソフトウェア付きCellyticsシステムメタイミュネテックCS001レンズ不要のシャドウイメージングプラットフォーム
遠心分離機(スイングバケットローター)ラボジーン1580R型300–500回G範囲
CMOSイメージセンサーCellytics デバイスに付属統合回折イメージングに使用
サイトスピン遠心分離機ナスココリアTXT3 サイト遠心分離機サイトスピン染色用
デジタル加熱ブロック(37°C;C)ダイハン・サイエンティフィックDHです。WHB00349細胞インキュベーション用
ELISAキット(IFN-&ガンマ;)R&DシステムDIF50CヒトIFN-&ガンマ;ELISAキット
グアバeasyCyteフローサイトメーターミリポール0500-5005CD107a発現解析用
ヘマ3ステータスパックサーモフィッシャー122-911サイトスピン染色用
IL-12(組換えヒト)R&DシステムASCの構成要素
IL-2(組換えヒト)ペプロテック200-02ASCの構成要素
磁気分離ラックメタイミュネテックM13R8ビーズ分離用
顕微鏡スライドマリエンフェルト1000612サイトスピン調製用
NKアクティベーションキットメタイミュネテックMIT2301V、MIT2301ANK細胞活性化用
NK Sep キットメタイミュネテックMIT2301-500NK細胞単離用
PEマウス抗ヒトCD107a、100テストBDバイオサイエンス555801CD107a発現解析用
ピンホールアパーチャCellytics デバイスに付属統合LSIT照明経路で使用
ピペット (2–20 & マイクロ;L、20–200 & マイクロ;L)アクシゲンT-200-Y調節可能な音量
シャドウキャリブレーションスライドメタイミュネテックAS050-Gデバイスキャリブレーション用
1つのアッセイスライドボックスに1つのキャリブレーションスライド
ボルテックスミキサーメルク SI-0246A再サスペンション用

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