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方法論記事

広帯域コヒーレントアンチストークスラマンおよび2光子蛍光寿命顕微鏡による超高情報量化学イメージング

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DOI:

10.3791/68845

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2025年10月7日

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1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology, 3School of Electrical and Computer Engineering, Georgia Institute of Technology

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本稿では、広帯域コヒーレント抗ストークスラマン散乱(BCARS)、2光子励起蛍光(TPEF)、2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡(2p-FLIM)を組み合わせたマルチモーダルイメージングプラットフォームを紹介し、超高情報量のケミカルバイオイメージングを可能にします。

要約

ラマン指紋分光法と蛍光寿命イメージングは、生体標本の代謝プロファイルを研究するための新しいツールです。ラマン指紋分光法は、サンプルの分子組成と化学環境を反映する固有の分子振動を検出しますが、蛍光寿命イメージングは、微小環境に敏感な蛍光色素の励起状態寿命の変化を測定します。ここでは、生物学的に関連するラマン指紋スペクトルと蛍光寿命シグナルを in vivo で同時に取得できる、広帯域コヒーレント抗ストークスラマン散乱(BCARS)と2光子蛍光寿命イメージング(2p-FLIM)顕微鏡を組み合わせたマルチモーダルイメージングプラットフォームを紹介します。空間的に同時登録されたBCARSと2p-FLIM画像から得られた膨大な化学情報により、細胞内コンパートメント間の微妙な違いを特徴付け、蛍光イメージングのみで生成される潜在的な偽陽性結果を検証できます。これは、緑色蛍光タンパク質(GFP)マーカーを発現する生きた無傷の C.エレガンス で、同じ色素染色オルガネラから同時に得られたBCARS、2p-FLIM、および2光子励起蛍光(TPEF)シグナルを直接比較することによって実証されます。本研究では、BCARS/2p-FLIM/TPEFセットアップスキーム、画像取得ステップ、データ処理、およびクロスモダリティイメージング法が細胞内分解能での厳密な特性評価と in vivo 検出を可能にすることを示す代表的な結果を紹介します。このプロトコルは、複雑な生命システムにおける生物学的解釈の精度を向上させるために、化学的および蛍光の同時寿命イメージングのためのフレームワークを提供します。

概要

生物学研究における課題の1つは、細胞や組織の自然な状態と無傷の構造内の生物学的建築材料を正確に検出することです。ラマン分光法は、生体試料内の固有の代謝産物や化学種を検出する前例のない可能性を示しており、最近では生体試料の代謝プロファイリングのための新たなツールとして認識されています1。ラマン指紋スペクトルに示されるさまざまな代謝群のピークを分析することにより、指紋の特徴を使用して、がん2,3,4、心臓障害5,6、神経変性疾患7,8などの疾患の初期段階を検出でき、根本的な生物学的問題に対処するのに特に有用であることを示す証拠が増えています9,10標識摂動11のない細胞内構造のイメージング、さまざまな細胞状態の区別12、13、および細胞型分類14、15、16を含む。ラマンスペクトルでコード化された化学情報のほとんど(>90%)は指紋領域(500〜1800 cm-1)にあり、この領域は生物学的サンプル中の化学組成を識別するのに群を抜いて最も有用です17。しかし、この周波数範囲ではラマン信号が弱いため、特に生きた無傷の生体試料に対して、生物学的研究へのラマン指紋分光法の適用が困難になります1。

コヒーレントラマンイメージング(CRI)アプローチは、ラマン信号の取得時間を大幅に短縮しますが、これらのほとんどは比較的狭いスペクトルセグメントを取得し、2800〜3100 cm-1の間の強いCHストレッチ信号に最適化されています。狭帯域CARSおよび誘導ラマン散乱(SRS)(図1A、B)は、通常、強いCH信号18、19、20、21、22、23の狭い部分を取得するために、2つのピコ秒パルスを使用します。マルチプレックスCARSなどのマルチプレックスCRIアプローチ(図1C)は、ピコ秒と~100 fsパルスの組み合わせを使用して、通常CH領域24、25、26、27、28、29、30で中程度のスペクトル範囲(通常≤400 cm-1)を取得します。これらのイメージングアプローチを使用して、ピクセルあたりの生物学的関連ラマンスペクトル全体(600〜3200 cm-1)を取得することは、ほとんどの指紋信号がCHストレッチ信号よりも10〜100倍弱いため、通常は法外です31。ほとんどのCRIアプローチとは異なり、広帯域コヒーレント反ストークスラマン散乱(BCARS)は、フィンガープリントおよびCHストレッチ領域31、32、33をカバーするシングルショットブロードバンド取得用に最適化されています。BCARSは、~10fsパルスのパルス内相互作用を使用して、低周波(フィンガープリント)振動を効率的に励起し(図1D)、マルチプレックスCARSと同じメカニズム、fsパルスとpsパルスの組み合わせを使用して、CHストレッチ領域に振動コヒーレンスを生成します(図1C)32,33.さらに、BCARS信号は、非共鳴バックグラウンド(NRB)との相互作用により本質的に校正され、各ピクセル31におけるレーザーパルスあたりの定量的で機器不変のフルラマンスペクトルが得られ、細胞、無傷の組織、および生きた生物32、34、35、36、37から高情報量データを迅速に取得する能力を備え、38,39。

取得した生のBCARSスペクトルには、強いいわゆる「非共鳴バックグラウンド」(NRB)が含まれています。NRBは、化学的に特異的ではないレーザーパルスに対する電子応答からの寄与です。NRBは、ヘテロダイン増幅器32として機能し、振動共振信号にコヒーレントに干渉する。NRBは基礎となるラマンスペクトルも歪めますが(図2A)、重要な連続スペクトルセクションが取得されている限り、ラマンスペクトルは取得できます。現在、狭帯域CARSアプローチを使用して共振CARS信号を非共振成分から分離する後処理方法はありません。広帯域CARS信号からのラマン信号の検索は、時間領域のクレイマーズ-クローニッヒ関係(またはヒルベルト変換)33,40(図2B)、最大エントロピー41,42、または機械学習43,44,45,46,47,48を利用することによって達成することができるアプローチ。最初の2つの方法は、生のBCARSスペクトルから位相(共鳴ラマン信号)を解析的に取得するため、機械学習アプローチは計測器とトレーニングモデルに大きく依存する可能性があることに注意してください。

BCARS顕微鏡は、生体標本の代謝プロファイリングのラベルフリーの特性評価を可能にしますが、BCARSシグナル生成に使用されるのと同じスーパーコンティニュームレーザー(この研究で提示されたBCARSセットアップの場合は950〜1200 nm)は、ローダミンベース、ボディピーベース、Alexaフルオールベース、シアニンベースの色素、およびGFPやmCherry49を含むさまざまな蛍光タンパク質などの幅広い色素を励起することもできます。50.可視連続波(CW)レーザーを使用した単一光子励起と比較して、近赤外(NIR)光を使用する2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡(2p-FLIM)や2光子励起蛍光顕微鏡(TPEF)などの多光子蛍光顕微鏡は、より深いサンプル浸透深さ、固有の3Dセクショニング機能、高コントラスト画像、および最先端の共焦点顕微鏡に匹敵する優れた解像度を提供し、生物学的ツールとして魅力的なツールとなっています研究51,52。時間相関単一光子計数(TCSPC)アプローチを用いた蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)は、時間変調レーザー光源53,54によって繰り返し励起された蛍光減衰シグナルを検出する。特定の蛍光色素の蛍光スペクトルは、溶媒の極性などの環境要因によって変化する可能性がありますが、これらの変化は通常微妙です。一方、蛍光寿命は、pH値55、粘度56、極性57、イオン種の濃度58,59、結合相互作用、消光剤の存在、または構造変化53,54などの環境変化により、2つ以上の要因によって変化することがよくあります.蛍光寿命のこのユニークな特性は、蛍光イメージングにおいて追加のシグナルコントラストを提供し、細胞および組織イメージングにおける自家蛍光干渉の問題にうまく対処しました60、スペクトル分解FLIMアプローチを使用して複数の蛍光色素を混合解除61、がんの診断と治療のモニタリング62、細胞の不均一性のラベルフリー検出63、および代謝変化64,65.

本研究では、BCARS、2p-FLIM、TPEFを組み合わせたマルチモーダルイメージングプラットフォームを紹介します。私たちの知る限り、BCARSと2p-FLIM/TPEFの同時イメージングを可能にするイメージングプラットフォームを発表するのはこれが初めてです。この装置のin vivoイメージング能力を、広く使用されている遺伝的に扱いやすいモデル生物であるCaenorhabditis elegans(C. elegans)を使用して実証します。BCARSスペクトル、ナイルレッド(重要な脂質色素)の2p-FLIM崩壊、および報告された脂質マーカー(DHS-3::GFP)の2光子蛍光GFPシグナルが、ナイルレッド染色ワームからin vivoで同時に取得できることを示しています。ここで紹介するイメージングアプローチの実用的なガイドには、(i)サンプルは光学的に透明で、厚さは通常100μm未満である必要があります。(ii)染色条件は、染料やサンプルによって異なる場合があります。ここに示されているC.エレガンスのナイルレッド染色の結果では、ナイルレッド濃度は~μMレベルであり、染色時間は数時間から一晩の範囲です66。(iii) 2p-FLIM/TPEF 検出器への可視光漏れを避けるために、暗いサンプル環境が必要です。これらのイメージング条件は、ほとんどの非線形光学顕微鏡および蛍光顕微鏡のイメージング条件と同じです。さらに、ここで実証した当社のシステムは、2光子蛍光励起のために700〜950 nmの範囲をカバーするTi:Sapphire fsレーザーを追加導入することにより、ナイルレッドとGFPに加えて他の色素や蛍光レポーターの検出にもさらに適用できます。したがって、このプロトコルに記載されている代表的な結果は、GFPを発現する色素染色されたC.エレガンスのin vivoイメージングですが、超高情報量の化学バイオイメージングプラットフォームには、広範かつ広範囲にわたるアプリケーションがあります。

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プロトコル

1. C . エレガンス サンプル前処理とナイルレッドバイタル染色

注:C.エレガンスは、その全身の透明性により、複数のイメージング技術に多用されています。内臓や組織は、解剖することなく無傷の動物で簡単に画像化できます。さらに、 C. elegans は脊椎動物とは見なされず、げっ歯類などの高等動物と同じ倫理規制の対象ではないため、倫理承認は必要ありません。このセクションでは、 C.エレガンス ワームの同期と蛍光イメージング用のナイルレッド染色サンプルの調製について説明します。同期した1日成虫は、2世代産卵プロトコル を介して 取得され、新たに調製されたナイルレッド-OP50プレートを使用して染色されます。

  1. C. elegans株(例:N2、LIU1 ldrIs1 [dhs-3p::d hs-3::GFP + unc-76(+)])を、OP50細菌を播種した標準線虫増殖培地(NGM)プレート上に維持します。
  2. ワームを同期する
    1. 作りたてのOP50シードNGMプレートに10〜20匹の妊娠成虫を摘み取ります。
    2. プレートを20°Cで1〜3時間インキュベートして、産卵を可能にします。
    3. 成虫をすべて取り除き、産みたての卵だけを皿に残します。
    4. ワームが1日の成虫段階に達するまで、プレートを20°Cでインキュベートします。
    5. 同期精度を向上させるために、追加の生成に対して上記の手順を繰り返します。
  3. ナイルレッド原液を調製する
    1. 15.92 mgのナイルレッドを10 mLのDMSOに溶解し、最終濃度は5 mMにします。
    2. 溶解を助けるために必要に応じて、10〜30分間超音波処理します。
  4. ナイルレッド-OP50染色プレートを準備します。
    1. OP50バクテリアスラリーをナイルレッドストックと完全に混合して、NGMプレートあたり5 μMの最終ナイルレッド濃度を達成します。たとえば、10 μLのナイルレッドストックと20 μLのOP50細菌スラリーを混合し、混合物全体を播種されていない6 cm(~10 mL容量)のNGM寒天プレートにすぐに塗布して、NGMプレートあたり5 μMの最終ナイルレッド濃度を作ります。
    2. 混合物を播種されていない6 cmのNGMプレートに均等に広げます。
    3. プレートは室温で暗所に一晩保管し、細菌の増殖と染料の吸収を可能にします。
  5. 染色同期ワーム
    1. 30〜50匹の同期した1日成虫を、調製した各ナイルレッド-OP50プレートに移します。
    2. ワームを暗所で20°Cで1〜2時間インキュベートしてからイメージングします。
  6. イメージング用のワームを固定する
    1. 顕微鏡スライド上の2%アガロースパッドに100 mMアジ化ナトリウムを一滴塗布します(ワーム20匹で約10〜15 μL)
    2. 染色したワームを麻酔薬(アジ化ナトリウム)ドロップに移し、顕微鏡検査の前にワームをカバーガラスで覆います。
      注:産卵同期の最初のステップで、作りたてのNGM OP50プレートに10〜20匹の妊娠成虫を摘み取るときは、成虫のみを摘み、迷子卵や幼虫は摘み取りません。これは、プレートに残っているすべての卵が、1〜3時間の産卵時間枠内に摘み取られたワームによって生産されることを確認するためです。さらに、アジ化ナトリウムは危険物として分類されますが、線虫の麻酔には非常に少量しか必要としません。アジ化ナトリウム廃棄物の使用と処分は、施設の環境衛生安全部門のガイドラインに従わなければなりません。

2. プローブビームの生成

注:このプロトコルは、自家製の光パラメトリック発振器(OPO)を使用したピコ秒(ps)プローブビームの生成と、プローブビームの出力電力を安定させるための自家製の信号フィードバックループシステムを使用した第2高調波発生(SHG)について説明します。

  1. 1030 nm OPOポンプレーザー(図3A または 図4に示す1ps、~3 W OPOポンプレーザー)のスイッチを入れ、熱平衡化のために少なくとも2時間待ちます。OPOの動作には安定した出力が不可欠です。
  2. 出力をOPOキャビティに誘導します
    1. ターゲット信号の波長に合わせて、OPO PPLN(図3A)水晶振動子の適切なポーリング周期を選択します。
    2. ビームを最初の湾曲ミラー(CM)(図3A)に向け、線形キャビティの一部を形成します。
    3. ビームがOPO周期的に分極したニオブ酸リチウム(PPLN)結晶(図3A)を通過して、光学パラメトリックダウンコンバージョンを容易にします(図3B)。
    4. ビームが2番目の湾曲したミラー(CM)で反射し、次にエンドミラー(EM)で反射し(図3A)してキャビティループを形成します。
    5. 出力カプラ(OC)(図3A)を設定して、生成された信号ビームをキャビティから抽出します。
  3. 温度コントローラー(TC)(図3A)を使用してOPO PPLN水晶振動子の温度を調整し、信号波長を選択します。一般的な信号波長は1530nmで、1064nmで3Wで励起した場合の出力電力は約0.8Wに相当します。
  4. OPO アライメントの最適化
    1. 2つのCMとEMの位置と傾きを調整して、出力電力とビーム品質を最大化します。
    2. キャビティの長さを調整して、信号スペクトルを目的の周波数にシフトします。
  5. OPO信号ビームを一連のコリメートおよび集束光学系に通し、SHGステージに導きます。
    1. SHG PPLN水晶振動子(図3A)で、ターゲット信号の波長に一致する適切なポーリング周期を選択します。
    2. 温度コントローラーを使用して結晶温度を正確に制御し、SHG効率を最大化します。
    3. ビームをSHG PPLN結晶に向けて第2高調波発生を行い、1530 nmのOPO信号を765 nmに変換します(図3C)。標準的なSHG変換効率は、最適なアライメント条件下で約30%です。
    4. SHG PPLNの後に1300nmのショートパスフィルター( 図3AのSPF、材料 表の仕様)を挿入して、残留する1530nmの基本光を除去します。
    5. 適切なレンズ( 図3AのL)を使用して、得られた765nmビームをコリメートします。
  6. 電力安定化の実装
    1. ウェッジウィンドウ(WW)を使用してSHGビームをサンプリングし、フォトダイオード(PD)に向けます。
    2. フィードバックループがフォトダイオード信号( 図3AのPD)を基準値と比較し、エンドミラー(EM)のピコモーターを作動させてOPOキャビティの長さをリアルタイムで調整し、それによってSHG出力電力を安定させます。
      注意: 基準値を決定するには、まずSHG出力電力を記録しながらピコモーターを使用してEM位置をスキャンします。このプロファイルのピーク強度を特定し、基準値をピークの 90% に設定します。この選択により、フィードバック補正の明確な方向が保証され、システムが電力の増加と減少の傾向の両方を補正し、時間の経過とともに出力電力を効果的に安定させることができます。

3. BCARSの超連続体(SC)生成

注:BCARSベースのマルチモーダルシステムの簡略化されたスキームを 図4に示します。このプロトコルは、SCビームの生成を記述します。

  1. プリチャープ(群遅延分散、GDD)をフェムト秒(fs)パルス出力(1030 nm、150 fs、~1 W)に調整して、指紋領域信号をカバーする十分な広いSC帯域幅(SC帯域幅≥1800 cm−1)を取得します。これは、回折格子ペアの分離を調整し( 図4を参照)、分散を正確に制御することで実現します。
    注: 事前補償された GDD の適用は、目的のパルスを生成し、SC 生成を最適化するために重要です。必要な GDD 値は、使用するレーザー システムの特定の特性によって異なる場合があります。
  2. 同じ焦点距離の 2 つのレンズで構成されるビーム望遠鏡を組み込んで、ポンプ ビームの発散を調整します。
    注: ビームが広がるファイバーに入る前に数メートル以上移動する場合、ビームの発散を正確に制御することが不可欠になります。この距離でコリメートされたビームを維持することは、効率的なSC生成を確保するために重要です。
  3. ビームステアリング用のピエゾアクチュエータを備えたキネマティックミラーマウントを使用して、オートアライナ(図4)をセットアップします。これらを光学ウェッジおよび位置検出器(PSD)と組み合わせて、ビームアライメントをアクティブに監視および修正します。
  4. ウェッジから最初のミラーまでの距離が、ウェッジから最初の PSD までの距離と等しくなるようにコンポーネントを配置します。この対称的な構成により、広がるファイバーへのビームポインティングの安定性が保証されます。
    注: アクティブアライメントは、スペクトル広がり効率を最大化し、ファイバー入力損傷のリスクを最小限に抑えるために不可欠です。
  5. ファイバーに結合する前に、半波長プレート (HWP) と偏光ビーム スプリッター (PBS) を使用してレーザー出力を制御します。HWPを回転させてPBSに対する偏波角度を調整し、送信電力を調整します。これらのコンポーネントは 図4には示されていませんが、安全なアライメントと電力制御にとって重要です。
  6. ファイバーカプラーを使用して、約1Wのレーザー出力を10cmの大モード面積偏光維持(LMA-PM-5)フォトニック結晶ファイバー(PCF)に結合します。結合手順は次のとおりです。
    1. まず、ファイバーへの損傷を避けるために、初期アライメント中にレーザー出力を~20〜50mWに減らします。
    2. コリメートされたビームをファイバーに向け、反対側から光が確実に出るようにします。出力電力を最大化するために位置を調整してビーム経路を最適化します。
    3. 非球面レンズを挿入し(図4)、ビームを再度微調整して出力電力を最大化します。
    4. 非球面レンズの Z 位置を調整して、ファイバー ファセットに正確に焦点を合わせます。
    5. アライメントとフォーカスの調整を繰り返して、結合効率を最大化します。
    6. 動作のためにレーザー出力を1Wに上げます。
  7. 図4に示すように、焦点距離f = 15 mmの軸外放物面(OAP)ミラーを使用して、PCFから得られた広帯域スーパーコンティニューム(SC)出力をコリメートします。
    注:屈折素子によってもたらされる色収差を最小限に抑えるために、広帯域ビームにはOAPミラーなどの反射光学系が好まれます。
  8. コリメートされた広帯域スーパーコンティニューム(SC)出力を、一対のショットフリント(SF10)プリズムで構成されるプリズムコンプレッサー(図4)に導きます。
    1. SCビームを最初のプリズムの頂点に向けて、スペクトル分散を開始します。
    2. 分散したビームが頂点から入るように 2 番目のプリズムを配置します。
    3. 両方のプリズムをレールシステムに取り付けて、プリズムの分離を大まかに調整できるようにします。2 番目のプリズムをレールに沿って移動して、光路の長さと全体的な圧縮を調整します。このシステムの間隔は44cmです。
    4. 最初のプリズムを精密線形平進ステージに取り付けます。最初のプリズムの挿入深さを調整して、分散補正を微調整します。
    5. プリズムの分離と2番目のプリズムの挿入長さの両方を繰り返し調整して、SCパルスの最適な時間的圧縮を実現します。実験的に観察された縮退4波混合(DFWM)信号を、群遅延分散(GDD)と3次分散(TOD)を考慮したシミュレーション結果と照合することにより、最適な時間的圧縮を決定します。このアプローチには、GDD と TOD の効果を組み込んだ超連続体生成プロセスのシミュレーションを実行することが含まれ、最適に圧縮された SC パルスの予想される時間的およびスペクトル的特性の基準を提供します。次に、実験用DFWM信号がシミュレーション予測と一致するまで、プリズムコンプレッサーパラメータを繰り返し調整して、システムに存在するGDDとTODを補正します。SCのスペクトルプロファイルの典型的な結果を 図5に示します。
      注:適切な分散補償は、SCのスペクトルコヒーレンスを高めます。最適なアライメントの下で、SC出力の出力は約150 mW、中心波長は約1060 nm、スペクトル範囲は950〜1200 nm(1800 cm-1に相当)に及びます。これらの値は、アライメントとファイバー結合効率によって若干異なる場合があります。
  9. ダイクロイックミラーを使用してプローブビームと超連続体ビームを組み合わせます( 図4のDMを参照)。それらを一対のピンホールに合わせて、両方のビームが同一線上になるようにします。結合されたビームを高周波フォトダイオード(1GHz帯域幅)に集束させます。最適な信号品質を得るには、両方のビームを空間領域と時間領域の両方で重ね合わせる必要があります。プロセスは次のとおりです。
    1. フォトダイオードからの出力を高周波オシロスコープ(500MHz帯域幅)に向けます。レーザートリガーを基準時計として使用します。
    2. プローブビームを遮断し、SCパルスを測定します。SCパルスとレーザー基準の間の時間的差を記録します。
    3. SCビームをブロックし、プローブパルスを測定します。プローブパルスがSCパルスと時間的に重なるように、機械的遅延材( 図4を参照)を調整します。2 つのビームが同時に最大値に達するようにします。
    4. フォトダイオードを取り外し、ビームを顕微鏡に送ります。
      注: 上記の手順では、ビームのオーバーラップの大まかな調整について説明します。より正確な位置合わせのためのさらなる最適化については、手順 6.1 から 6.9 で説明します。

4. 2p-FLIMとTPEFの蛍光検出の設定とTi:Sapphire fsレーザーの追加導入

  1. Ti:Sapphire レーザーをオンにして、熱平衡に達するまで待ちます。安定した出力電力とビームポインティングを確保するために、約2時間待ちます。
    注:この研究では、GFPやナイルレッドなどの蛍光色素に対して広いスペクトルカバレッジと十分なパワーを提供するSCソースを使用してTPEFおよびFLIMイメージングを実施しました。Ti:Sapphireレーザーは、SCによって効率的に励起されない可能性のある950 nm未満の2光子吸収ピークを持つ蛍光色素のオプションの励起源としてシステムに含まれています。
  2. Ti:Sapphireレーザーのモードロック機構をアクティブにします。内蔵モニター で 安定したモードロックを確認します。
  3. プリズムコンプレッサーを使用して、サンプルで最適な時間的圧縮のためにTi:Sapphireパルスを事前にチャープします。手順3.8で説明したような構成でプリズムを配置し、2番目のプリズムの挿入長さを調整してパルス持続時間を微調整します。
    注:適切な時間的圧縮により、サンプル平面でのピーク強度と効率的な2光子励起が保証されます。
  4. (オプション)レーザーが別の光学テーブル上にある場合は、Ti:Sapphireビームを偏光保持シングルモードファイバーに結合します。入力結合光学系を調整し、ファイバー出力を監視して、結合損失を最小限に抑えます。
  5. ダイクロイックミラーを使用して、Ti:サファイアビームを超連続体(SC)およびプローブビームと組み合わせます( 図3に示すPBSの結合点を参照)。ビームを慎重に位置合わせして、二色性で空間的に重なり、顕微鏡に向かって共伝播するようにします。
  6. 結合したビームを顕微鏡に誘導し、空間的重なりを微調整します。蛍光サンプル(例えば、1 μmの蛍光ポリスチレンビーズを含むスライド)を使用して、BCARS励起経路に対するTi:Sapphireビームの位置合わせを確認します。Ti:Sapphireアライメントミラーを調整して、蛍光発光が同じイメージングフィールド内のBCARS焦点と共局在するようにします。同時に取得されたBCARS画像とTPEF画像のオーバーラップを視覚化して、空間オフセットが1ピクセル未満である必要があることで、共局在を確認します。
    注:蛍光信号とBCARSシグナル間の空間的オーバーラップを達成することは、マルチモーダル画像レジストレーションに不可欠です。
  7. 顕微鏡入力の前にダイクロイックミラーを挿入して、後方散乱蛍光を検出経路に向かって反射します。励起ビームから蛍光を効率的に分離するために、適切なカットオフ波長を持つダイクロイックを選択します。
  8. 発光経路の下流に2番目のダイクロイックミラーを挿入して、蛍光シグナルを2つの検出分岐に分割します。
    1. 550nm≥波長をFLIM検出器に送信します。
    2. 550 nm≤波長を光電子増倍管(PMT)に反射させ、アナログ2光子励起蛍光(TPEF)検出を行います。
      メモ:各検出ブランチにバンドパスフィルターを取り付けて、残留励起光を遮断し、特定の発光帯域を分離します。
  9. PMT出力をプリアンプに接続し、増幅されたアナログ信号をデータ収集(DAQ)デバイスに供給します。フィールドプログラマブルゲートアレイ(FPGA)からのグローバル同期トリガーをDAQと共有して、イメージングモダリティ間での時間的アライメントを確保します(図7)。
  10. FLIM検出器の出力を時間相関単一光子計数(TCSPC)モジュールに接続します。
    1. FLIM検出器信号をTCSPCモジュールの開始入力に接続します。
    2. Ti:Sapphireレーザー(またはBCARS SC)の同期出力をTCSPCモジュールの基準入力に接続します。
    3. グローバルカメラトリガー(FPGAによって生成)をTCSPCモジュールのフレーム同期入力に接続して、ラインスキャン画像取得と同期します。

5. BCARS検出パスの設定

注:このプロトコルでは、ラインスキャンハイパースペクトルイメージングのデスキャン検出パスの設定について説明します。1Dガルボミラーは、十分な信号積分のために、ピクセルあたり2〜4ミリ秒の滞留時間でy軸に沿って励起ビームをスキャンします。各ラインスキャンの後、サンプルステージはx軸に沿って1ステップ進みます。同期された二次ガルボミラーを使用したデスキャンは、高速ビームスキャン中にカメラ上のスペクトル信号の一貫した空間レジストレーションを維持し、隣接するピクセル間の信号クロストークを排除し、空間スペクトル忠実度を維持するために不可欠です39。

  1. スーパーコンティニューム(SC)ビームとプローブビームを1次元(1D)ガルボスキャナーに導入します( 図4 および参考文献39の詳細を参照)。ガルボミラー共役を集束対物レンズの後開口部に配置して、視野全体で正確なビームスキャンを可能にします。
  2. 反射ビームエキスパンダー( 図4を参照)を使用して、励起対物レンズの背面開口部に合わせて各ビームを拡張します。これにより、サンプル平面での最適なフォーカシングと最大の空間分解能が保証されます。
    注:反射光学系を使用して、色収差を最小限に抑え、SCビームの広帯域スペクトル内容を維持します。
  3. 励起対物レンズの背面開口面に位置合わせターゲットを配置します。SC ビームとプローブ ビームの両方がターゲットの中心を通過するように調整し、光軸に沿って一致します。
    注:正確な空間オーバーラップにより、BCARS信号強度が最大化され、焦点で最大の空間分解能が保証されます。
  4. 倒立顕微鏡に取り付けられた高NA励起対物レンズ(1.2 NA、60倍水浸対物レンズなど)を使用して、ビームをサンプルに集束させます。
  5. 2つのカバーガラスの間に一滴の水を挟み、密閉された顕微鏡スライドを作成して、アライメントサンプルを準備します。準備したスライドを顕微鏡ステージに置き、焦点を調整してサンプルが見えるようにします。
  6. 生成された反ストークス信号を、励起経路の反対側に配置された収集対物レンズを使用して、送信中に収集します。
  7. 4fデスキャンシステム( 図4を参照)を実装して、検出器の固定行へのアンチストークス信号の空間マッピングを維持します。
    1. 4f光学システムを使用して、収集対物レンズの背面焦点面(BFP)をデスキャンガルボミラーの軸に中継します。これは、次のように配置された2つの精密チューブレンズ( 材料表を参照)で構成されています。
      1. 最初のレンズは、収集対物レンズのBFPの1焦点距離(200mm)後に配置されます。
      2. 2番目のレンズは、ガルボミラーの1焦点距離前に配置されます。
    2. FPGA制御の波形発生器を使用して、走査ガルボを走査ガルボと同期させます。
    3. 7ビットデジタルポテンショメータをFPGA制御システムに統合して、デスキャンガルボ振幅を調整できるようにします。
      注:デスキャンガルボミラーは、一次走査ガルボによってもたらされる角度たわみを補正します。角度を同期して動的に調整することで、ビームの動きを打ち消し、アンチストークス信号が分光計に通じる光軸に沿って整列したままになるようにします。この安定化は、検出器上の空間レジストレーションを維持し、スキャン中のスペクトル画像の横方向の変位を防ぐために不可欠です。
  8. ガルボスキャンとカメラトリガーを同期するようにFPGAシステム( 材料表を参照)を設定します。
    1. スキャンおよびデスキャンガルボのアナログ出力を生成します。
    2. 入力ステージ・トリガーを受け入れて、各ライン・スキャンの開始をマークします。
    3. 各スキャン位置で、フレームキャプチャトリガー信号を科学相補型金属酸化膜半導体(sCMOS)カメラに出力します。
    4. デスキャン振幅を独立して制御し、さまざまな収集目的に対応します。
      注:一般的なFPGAパルストレインには、スキャンガルボ駆動信号、デスキャンガルボ駆動信号、ステージトリガ入力、および同期フレームタイミング用のピクセルクロックが含まれます。
  9. コリメートされたアンチストークス信号を2つのショートパスフィルターに通し、残留ポンプとSC励起光を遮断します。
  10. フィルタリングされたアンチストークス信号を分光器の入口スリットを通ってsCMOS検出器に集束させます。スキャンガルボとデスキャンガルボの両方の角度を調整して、ビームがスリットの長軸に平行にスキャンされ、光学像面がスリットに位置合わせされるようにします。この正確なアライメントにより、スペクトル分解能が最大化され、検出器列全体の横方向信号クロストークが最小限に抑えられます。
  11. アンチストークススペクトルをカメラ列に沿って垂直に分散するように分光計を設定します。最適なスペクトルカバレッジを得るには、適切な回折格子(例:300ライン/mm、700nmでブレイズ)を選択します。

6. 信号の最適化とスペクトル分解能の校正

  1. 自家製の取得ソフトウェアを起動し、sCMOSカメラからリアルタイムの信号監視を開始します。この集録ソフトウェアは、Hamamatsu DCAM-APIやMeasurement Computing Universal Libraryドライバなどの依存関係を持つPython 3.8+(Windows 10)で自家製で、HDF5形式でデータを出力します。ソフトウェアは、責任著者からの合理的な要求に応じて入手できます。
  2. 2つのカバーガラスの間にベンゾニトリルを一滴垂らして密閉スライドを形成し、スペクトルキャリブレーションサンプルを調製します。スライドを顕微鏡ステージに置き、励起対物レンズを使用して焦点を合わせます。
  3. sCMOSカメラでBCARS信号を見つけます。収集対物レンズのZ位置を調整して、アンチストークス信号強度を最大化します。
  4. 収集対物レンズの横方向の位置を調整して、アンチストークス光が分光計の入口スリットを通して正しく焦点が合うようにします。このアライメントにより、分光計への最適な結合とスペクトル忠実度の向上が保証されます。
  5. サンプル平面での超連続体(SC)ビームとプローブビームの間の空間的オーバーラップを最適化します。プローブビーム経路にミラーを使用して、その横方向の位置と入射角を微調整します。
  6. プローブビーム経路の光遅延線を変換して、SCパルスとの時間的重複を確保します。信号強度を監視し、アンチストークス信号が最大化されるまで調整し、適切な時間的同期を確認します。
  7. sCMOS画像上のベンゾニトリル(例:1002 cm-1)の強力でシャープなラマンピークを特定します。
  8. プローブの波長とそれに対応するピクセル位置をカメラに記録します。レイリーライン(プローブ波長で0 cm-1 )と1002 cm-1 および3073 cm-1 の既知のベンゾニトリルラマンピークを使用して、sCMOS検出器全体で線形ピクセルと波数のマッピングを確立します。レイリー線はゼロ波数基準を提供し、ベンゾニトリルピークはピクセルあたりの波数増分を決定します。
    注:分析には相対波数情報(ピクセル位置とラマンシフトの間のマッピング)のみが必要なため、発光ランプを使用した絶対波長校正は必要ありません。
  9. ピクセルと波数のマッピングを取得ソフトウェアに入力します。この校正は、光路、分光器の回折格子設定、またはアライメントに変更が加えられない限り、有効なままである必要があります。

7. 信号の取得

  1. ステップ1.1〜1.6で調製した C.エレガンス サンプルを顕微鏡ステージにロードします。関心領域を特定し、励起対物レンズを使用して焦点を合わせます。
  2. 非共鳴バックグラウンド(NRB)基準として機能するラマン活性シグナル(水のバックグラウンドまたはむき出しのガラスカバースリップ)を欠いているスライド上の領域を特定します。
  3. sCMOS検出器でBCARS信号を見つけます。収集対物レンズのZ位置を微調整して、アンチストークス信号強度を最大化します。
  4. 収集対物レンズの横方向の位置を調整して、アンチストークス光が分光計の入口スリットを通して適切に位置合わせされていることを確認します。
  5. FPGAを使用して、ガルボミラーの同期スキャンとデスキャンを開始します。デジタルポテンショメータを使用して、プライマリスキャンからの角度たわみが完全に補正されるまで、デスキャンガルボの振幅を調整します。アンチストークス信号は、スキャン範囲全体にわたってカメラ上の~12行以内に限定されたままにする必要があります。
  6. テンポラル取得シーケンスの定義
    1. プローブパルスを遅延させることにより、SCパルスとプローブパルス間の相互相関信号を取得します。これを取得するには、積分された3色BCARS信号とプローブパルスの時間遅延をプロットします。最も強い信号は、SCパルスとプローブパルスが時間的に重なり合っている時間0に現れます。
      注:FLIMおよびTPEF検出システムはBCARSと同じトリガーを共有するため、この時点で信号が同時に集録されます。
    2. BCARSの場合はプローブビームの後の遅延(たとえば、1〜2 ps)で記録し、非共鳴バックグラウンドの場合はSCビームの後の遅延で記録します( 図6AのNRBスペクトル)。狭帯域パルス(プローブ)に時間遅延を印加すると、3色CARS信号のNRBを効果的に抑制できるため、信号対雑音比を改善できます67。
    3. SCとプローブの間に時間的な重なりのない暗い画像を取得して、ベースライン検出器のノイズ(暗い基準)をキャプチャします。
    4. メタデータを含むすべてのBCARS、NRB、およびダーク画像を1つのh5ファイル内に保存します。
  7. BCARS信号処理プロトコル
    1. CRIkit2ソフトウェア68を開きます。
    2. 図6Bに示すように、Open HDFツールを使用して必要なすべてのデータセットをロードします。BCARSハイパースペクトルデータ、NRBリファレンス、およびダークリファレンスをロードします。Freq Windowツールを使用して、BCARS信号生成帯域幅内の周波数領域を選択します(ここで示されているBCARSシステムでは400 cm-1から≥3200 cm-1まで)。
    3. 前処理手順を実行します。
      1. Anscombe ツール (図 6B を参照) を使用して、BCARS および NRB データセットの分散安定化を行います。
      2. ノイズ除去ツールを使用して特異値分解(SVD)を実行する:目視検査に基づいて主成分を保持します。サンプルの形態に一致する空間分布を示す成分を保存し、非構造化ノイズまたはスペックル状ノイズが優勢な成分を破棄します。このノイズ除去ステップにより、特に低強度のスペクトル機能の信号対雑音比(SNR)が向上します。
      3. 逆 アンスコム ツールを使用して、データを元のドメインに復元します。
        注:取得時にリアルタイム処理を実行する場合は、これらの手順をスキップできます。
    4. Kramers-Kronig(KK)変換を使用してラマン様スペクトルを取得します。
      1. KK ツールを開きます (図 6B を参照)。
      2. NRB へのノルムを有効にして、適切なスペクトル基準正規化を確保します。
      3. NRBバイアス、パッド係数、エッジピクセル平均化などのパラメータを設定します。
      4. KK変換を実行して、取得したラマンスペクトルを取得します。
    5. KK後のエラー訂正の実行
      1. Savitzky-Golay平滑化を使用した位相誤差の補正: 位相誤差補正 ツールを開きます(図6B)。平滑化ウィンドウのサイズと多項式の次数を調整します。 プレビュー パネルを使用して、元のスペクトルと補正されたスペクトルを検査します。
      2. スケールエラーを修正する: スケールエラー修正 ツールを開きます(図6B)。スペクトルを正規化して、データセット全体の相対強度スケーリングを修正します。空間的およびスペクトル的次元全体で一貫性を確保します。
    6. スペクトル軸のキャリブレーション(オプション、位置がずれている場合): キャリブレーション ツールを開きます(図6B)。測定された波数を既知の基準ピークと比較します。補正された傾き/切片を適用して、スペクトル軸を再調整します。
    7. 関心領域 (ROI) からのデータの定義と抽出
      1. ROIスペクトを使用します。 または Pt Spect。 ツール(図6B)を使用して、BCARS画像の関心のある空間領域または関心のあるポイントをマークします。
      2. さまざまなROIのスペクトルコンテンツを視覚化して比較します。
      3. 取得したスペクトルをエクスポートして、さらなる定量分析またはケモメトリック分析を行います。

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結果

図5は、BCARS励起に使用される狭帯域プローブと広帯域超連続体(SC)パルスの測定スペクトルを示しています。自家製の光パラメトリック発振器(OPO、図3)からの~1530 nm信号の第2高調波発生によって生成されたプローブパルスは、764.2 nmを中心とし、半値全幅(FWHM)は0.2 nmで、結果として得られるラマンスペクトルで~6.8 cm-1のスペクトル分解能を提供します。事前にチャープされたフェムト秒の1030 nmレーザーパルスを10 cm PCFに結合することによって生成されるSCパルス( 材料表を参照)は、約950 nmから1200 nm(≥1800 cm-1)に及び≥、フィンガープリント(パルス内3色励起による)、サイレント領域(3色励起の混合)、 CH/OHストレッチ領域(パルス間2色励起による)。これらのビームを組み合わせることで、高いスペクトル特異性と広い振動範囲を備えた効果的...

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ディスカッション

この研究では、BCARSと2p-FLIM/TPEFイメージングプラットフォームのアーキテクチャを詳細に示します。現在のセットアップではデュアル出力の1030 nmレーザーが使用されていますが、ほとんどの高出力fs 1030 nmファイバーレーザーは、BCARS顕微鏡を構築するためのマスターレーザー光源として使用できます。OPO/SHG PPLN結晶の長さと周期を慎重に選択することで、サブpsのOPO 1030 nmポンプで数psのプローブパルスを生成することができます。ここでは、比較的高いレーザー繰り返し率(100 MHz)または比較的低いパルスピークパワーが実証されていますが、刺激内および刺激間(3色および2色信号生成)を組み合わせたBCARS信号励起スキームを使用して、BCARS信号を効果的に生成できます。代表的な結果に示されているin vivoC.エレガンス画像は、自家製のSC/プローブBCARSレーザー光源を使用してバイオイメージングを実行する可能性をさらに確認しました。BCARS分光バイオイメージングは、サンプルステージスキャン法

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開示事項

著者には開示するものは何もなく、競合する金銭的利益もありません。

謝辞

W-WCは、NIH(R21AG086974)からの支援を認めます。MTCは、米国エネルギー省(DOE BERDE-SC0022121)からの支援に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
カメラ浜松オルカフュージョンsCMOS、2304×2304ピクセル
収集目的 オリンポス LUMPLFLN60XW 水浸、1.0 NA
DAQデータ 忠実忠実しい MCC USB-1208HS データ取り込みカード
遅延線 ニューポート DL225 プローブパルスの機械的遅延
二色 性 セムロック FF925-DI01 ・・プローブとSCの組み合わせ
二色 性 セムロック FF705-DI01 エピモード蛍光検出
二色 性 ソーラブス DMLP550R FLIM信号とTPEF信号の分離
加振対物レンズ オリンポス UPLSAPO60XWIR 水浸、1.2 NA
フィルター セムロック FF01-1326/SP-25 SHG後の基本レーザーを除去
フィルター セムロック FF01-758/SP BCARSカメラの前に基本レーザーを除去
フィルター ソーラブス FESH0650 蛍光モダリティの前に基本レーザーを除去する
フリムPMT ピコクオンツ PMAハイブリッド FLIM単一光子検出器
FPGAの レドピタヤ ステムラボ 125-14 スキャンの同期とトリガー
ガルボ ソーラブス GVS101 スキャンとスキャン解除用
格子 コヒーレント ライトスミス 1040nm 1000グローブ/mm、SC用プリチャープ
半波プレート ソーラブス AHWP05M-980 偏光制御
Kキューブ ソーラブス KPA101 オートアライナ用PSDドライバ
レーザー 将来の機器 FSX-デュアル デュアル出力フェムト秒レーザー
レーザー コヒーレント ミラ-900 蛍光励起用フェムト秒レーザー
PBSの ソーラブス PBS255 SCとプローブのビームコンビネーション
PCFの ソーラブス LMA-PM-5 SC生成用10cmフォトニック結晶ファイバー
PDの ソーラブス PDA100A2 OPOフィードバックループ
ピエゾミラーマウント ソーラブス ポラリス-K1S2P オートアライナー用圧電アジャスター
プリアンプ エドモンドオプティクス 59-179 TPEFプリアンプ
プリズム ラムダ・リサーチの光学系 EQP-30SF10 SC圧縮
PSDの ソーラブス PDQ80A型 オートアライナー用位置感応検出器
分光 器 テレダイン プリンストン インスツルメンツ アイソプレーン 160 300 g/mmグレーチング、700 nmを中心に
舞台 アシ MS-2000型 電動3軸ステージ
TCSPC(英語) ピコクオンツ マルチハープ 150 FLIM用光子計数装置
TPEF PMT 浜松 H9305-03 TPEF検出器
チューブレンズ ソーラブス TL200-2P2 デスキャンシステムで使用

参考文献

  1. Cutshaw, G., et al. The emerging role of Raman spectroscopy as an omics approach for metabolic profiling and biomarker detection toward precision medicine. Chem Rev. 123 (13), 8297-8346 (2023).
  2. Kong, K., Kendall, C., Stone, N., Notingher, I. Raman spectroscopy for medical diagnostics - from in vitro biofluid assays to in vivo cancer detection. Adv Drug Deliv Rev. 89, 121-134 (2015).
  3. Abramczyk, H., et al. Aberrant protein phosphorylation in cancer by using Raman biomarkers. Cancers (Basel). 11 (12), 2017(2019).
  4. Contorno, S., Darienzo, R. E., Tannenbaum, R. Evaluation of aromatic amino acids as potential biomarkers in breast cancer by Raman spectroscopy analysis. Sci Rep. 11 (1), 1698(2021).
  5. John, R. V., et al. Micro-Raman spectroscopy study of blood samples from myocardial infarction patients. Lasers Med Sci. 37 (9), 3451-3460 (2022).
  6. You, A. Y. F., et al. Raman spectroscopy imaging reveals interplay between atherosclerosis and medial calcification in the human aorta. Sci Adv. 3 (12), e1701156(2017).
  7. Carlomagno, C. Human salivary Raman fingerprint as biomarker for the diagnosis of amyotrophic lateral sclerosis. Sci Rep. 10 (1), 10175(2020).
  8. Morasso, C. F., et al. Raman spectroscopy reveals biochemical differences in plasma derived extracellular vesicles from sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Nanomedicine. 29, 102249(2020).
  9. Pezzotti, G. Raman spectroscopy in cell biology and microbiology. J Raman Spectrosc. 52 (12), 2348-2443 (2021).
  10. Dodo, K., Fujita, K., Sodeoka, M. Raman spectroscopy for chemical biology research. J Am Chem Soc. 144 (43), 19651-19667 (2022).
  11. Hamada, K., et al. Raman microscopy for dynamic molecular imaging of living cells. J Biomed Opt. 13 (4), 044027(2008).
  12. Ichimura, T., et al. Non-label immune cell state prediction using Raman spectroscopy. Sci Rep. 6 (1), 37562(2016).
  13. Germond, A., Panina, Y., Shiga, M., Niioka, H., Watanabe, T. M. Following embryonic stem cells, their differentiated progeny, and cell-state changes during IPS reprogramming by Raman spectroscopy. Anal Chem. 92 (22), 14915-14923 (2020).
  14. Zahn, J., Germond, A., Lundgren, A. Y., Cicerone, M. T. Discriminating cell line specific features of antibiotic-resistant strains of Escherichia coli from Raman spectra via machine learning analysis. J Biophotonics. 15 (7), e202100274(2022).
  15. Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (32), 15842-15848 (2019).
  16. Nitta, N., et al. Raman image-activated cell sorting. Nat Commun. 11 (1), 3452(2020).
  17. Shipp, D. W., Sinjab, F., Notingher, I. Raman spectroscopy: techniques and applications in the life sciences. Adv Opt Photon. 9 (2), 315-428 (2017).
  18. Kong, C., et al. High-contrast, fast chemical imaging by coherent Raman scattering using a self-synchronized two-colour fibre laser. Light Sci Appl. 9 (1), 25(2020).
  19. Mutlu, A. S., Duffy, J., Wang, M. C. Lipid metabolism and lipid signals in aging and longevity. Dev Cell. 56 (10), 1394-1407 (2021).
  20. Fueser, H., Pilger, C., Kong, C., Huser, T., Traunspurger, W. Polystyrene microbeads influence lipid storage distribution in C. elegans as revealed by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Environ Pollut. , 294-118662 (2022).
  21. Lee, J., et al. Label-free multiphoton imaging of microbes in root, mineral, and soil matrices with time-gated coherent Raman and fluorescence lifetime imaging. Environ Sci Technol. 56 (3), 1994-2008 (2022).
  22. Sheng, M., et al. Single source CARS-based multimodal microscopy system for biological tissue imaging. Biomed Opt Express. 15 (1), 131-141 (2024).
  23. Zeng, Q., et al. Label-free Raman imaging for screening of anti-inflammatory function food. Food Chem X. 22, 101297(2024).
  24. Zhang, J., et al. High-throughput single-cell sorting by stimulated Raman-activated cell ejection. Sci Adv. 10 (50), eadn6373(2024).
  25. Yang, L., Iyer, R. R., Sorrells, J. E., Renteria, C. A., Boppart, S. A. Temporally optimized and spectrally shaped hyperspectral coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Opt Express. 32 (7), 11474-11490 (2024).
  26. Pegoraro, A. F., Stolow, A. Chirp modulation stimulated Raman scattering microscopy. Opt Express. 32 (18), 31297-31310 (2024).
  27. Zhang, Y., et al. Rapid coherent Raman hyperspectral imaging based on delay-spectral focusing dual-comb method and deep learning algorithm. Opt Lett. 48 (3), 550-553 (2023).
  28. Sorrells, J. E., et al. Programmable hyperspectral coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Opt Lett. 49 (9), 2513-2516 (2024).
  29. De la Cadena, A. Multiplex chemical imaging based on broadband stimulated Raman scattering microscopy. J Vis Exp. (185), e63709(2022).
  30. Zhang, S., He, Y., Yue, S. Coherent Raman scattering imaging of lipid metabolism in cancer. J Innov Opt Health Sci. 16 (3), 2230015(2023).
  31. Camp, C. H., Cicerone, M. T. Chemically sensitive bioimaging with coherent Raman scattering. Nat Photonics. 9 (5), 295-305 (2015).
  32. Camp, C. H. High-speed coherent Raman fingerprint imaging of biological tissues. Nat Photonics. 8 (8), 627-634 (2014).
  33. Camp, C. H., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Quantitative comparable coherent anti-Stokes Raman scattering spectroscopy: correcting errors in phase retrieval. J Raman Spectrosc. 47 (4), 408-415 (2015).
  34. Chen, W. W., et al. Spectroscopic coherent Raman imaging of Caenorhabditis elegans reveals lipid particle diversity. Nat Chem Biol. 16 (10), 1087-1095 (2020).
  35. Poorna, R., Chen, W. W., Qiu, P., Cicerone, M. T. Toward gene-correlated spatially resolved metabolomics with fingerprint coherent Raman imaging. J Phys Chem B. 127 (25), 5576-5587 (2023).
  36. Vernuccio, F., et al. Full-spectrum CARS microscopy of cells and tissues with ultrashort white-light continuum pulses. J Phys Chem B. 127 (21), 4733-4745 (2023).
  37. Murakami, Y., et al. Molecular fingerprinting of mouse brain using ultrabroadband coherent anti-stokes Raman scattering microspectroscopy empowered by multivariate curve resolution-alternating least squares. Chem Biomed Imaging. 2 (10), 689-697 (2024).
  38. Muddiman, R., Harkin, S., Butler, M., Hennelly, B. Broadband CARS hyperspectral classification of single immune cells. J Biophotonics. 18 (3), e202400382(2025).
  39. Dixon, J. Z., Chen, W. W., Xu, H., Audier, X., Cicerone, M. T. Broadband coherent anti-stokes Raman scattering microscopy for rapid, label-free biological imaging. Rev Sci Instrum. 96 (4), 043706(2025).
  40. Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform. Opt Lett. 34 (9), 1363-1365 (2009).
  41. Rinia, H. A., Bonn, M., Müller, M., Vartiainen, E. M. Quantitative CARS spectroscopy using the maximum entropy method: The main lipid phase transition. Chemphyschem. 8 (2), 279-287 (2007).
  42. Cicerone, M. T., Aamer, K. A., Lee, Y. J., Vartiainen, E. Maximum entropy and time-domain Kramers-Kronig phase retrieval approaches are functionally equivalent for CARS microspectroscopy. J Raman Spectrosc. 43 (5), 637-643 (2012).
  43. Houhou, R., et al. Deep learning as phase retrieval tool for CARS spectra. Opt Express. 28 (14), 21002-21024 (2020).
  44. Wang, Z., et al. Vector: Very deep convolutional autoencoders for non-resonant background removal in broadband coherent anti-stokes Raman scattering. J Raman Spectrosc. 53 (6), 1081-1093 (2022).
  45. Camp, C. H. Raman signal extraction from CARS spectra using a learned-matrix representation of the discrete Hilbert transform. Opt Express. 30 (15), 26057-26071 (2022).
  46. Junjuri, R., Saghi, A., Lensu, L., Vartiainen, E. M. Evaluating different deep learning models for efficient extraction of Raman signals from CARS spectra. Phys Chem Chem Phys. 25, 16340-16353 (2023).
  47. Vernuccio, F., et al. Non-resonant background removal in broadband CARS microscopy using deep-learning algorithms. Sci Rep. 14 (1), 23903(2024).
  48. Yao, B., et al. Recent progress in deep learning for improving coherent anti-stokes Raman scattering microscopy. Laser Photonics Rev. 18 (11), 2400562(2024).
  49. Bestvater, F., et al. Two-photon fluorescence absorption and emission spectra of dyes relevant for cell imaging. J Microsc. 208 (2), 108-115 (2002).
  50. Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nat Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
  51. Zhu, H., Fan, J., Du, J., Peng, X. Fluorescent probes for sensing and imaging within specific cellular organelles. Acc Chem Res. 49 (10), 2115-2126 (2016).
  52. Wu, L., Liu, J., Li, P., Tang, B., James, T. D. Two-photon small-molecule fluorescence-based agents for sensing, imaging, and therapy within biological systems. Chem Soc Rev. 50, 702-734 (2021).
  53. Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chem Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).
  54. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications. J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).
  55. Lin, H. J., Herman, P., Lakowicz, J. R. Fluorescence lifetime-resolved pH imaging of living cells. Cytometry A. 52 (2), 77-89 (2003).
  56. Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Levitt, J. A., Suhling, K. Molecular rotor measures viscosity of live cells via fluorescence lifetime imaging. J Am Chem Soc. 130 (21), 6672-6673 (2008).
  57. Wang, B., et al. Bipolar and fixable probe targeting mitochondria to trace local depolarization via two-photon fluorescence lifetime imaging. Analyst. 140, 5488-5494 (2015).
  58. Despa, S., Vecer, J., Steels, P., Ameloot, M. Fluorescence lifetime microscopy of the Na+ indicator sodium green in HeLa cells. Anal Biochem. 281 (2), 159-175 (2000).
  59. Wilms, C. D., Eilers, J. Photophysical properties of Ca2+-indicator dyes suitable for two-photon fluorescence-lifetime recordings. J Microsc. 225 (3), 209-213 (2007).
  60. König, K. Review: Clinical in vivo multiphoton FLIM tomography. Methods Appl Fluoresc. 8 (3), 034002(2020).
  61. Scipioni, L., Rossetta, A., Tedeschi, G., Gratton, E. Phasor s-FLIM: a new paradigm for fast and robust spectral fluorescence lifetime imaging. Nat Methods. 18 (5), 542-550 (2021).
  62. Ouyang, Y., Liu, J., Wang, Z. M., Liu, Z., Wu, M. FLIM as a promising tool for cancer diagnosis and treatment monitoring. Nano Micro Lett. 13 (1), 133(2021).
  63. Shirshin, E. A., et al. Label-free sensing of cells with fluorescence lifetime imaging: The quest for metabolic heterogeneity. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (9), e2118241119(2022).
  64. Liu, Z. Mapping metabolic changes by noninvasive, multiparametric, high-resolution imaging using endogenous contrast. Sci Adv. 4 (3), eaap9302(2018).
  65. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Label-free optical metabolic imaging in cells and tissues. Annu Rev Biomed Eng. 25, 413-443 (2023).
  66. Chen, W. W., et al. Identifying lipid particle sub-types in live Caenorhabditis elegans with two-photon fluorescence lifetime imaging. Front Chem. 11, 1161775(2023).
  67. Littleton, B., Shah, P., Kavanagh, T., Richards, D. Three-color coherent anti-stokes Raman scattering with optical nonresonant background removal. J Raman Spectrosc. 50 (9), 1303-1310 (2019).
  68. Crikit2 software for BCARS data processing. , https://github.com/ccampjr/crikit2 (2025).
  69. Zhang, P., et al. Proteomic study and marker protein identification of Caenorhabditis elegans lipid droplets. Mol Cell Proteomics. 11 (8), 317-328 (2012).
  70. Hulsey-Vincent, H. J., Cameron, E. A., Dahlberg, C. L., Galati, D. F. Spectral scanning and fluorescence lifetime imaging microscopy enable separation and characterization of C. elegans autofluorescence in the cuticle and gut. Biol Open. 13 (12), bio060613(2024).
  71. Gottlieb, D., Asadipour, B., Kostina, P., Ung, T. P. L., Stringari, C. FLUTE: A Python GUI for interactive phasor analysis of FLIM data. Biol Imaging. 3, e21(2023).
  72. Weber, G. Resolution of the fluorescence lifetimes in a heterogeneous system by phase and modulation measurements. J Phys Chem. 85 (8), 949-953 (1981).
  73. Ranjit, S., Malacrida, L., Jameson, D. M., Gratton, E. Fit-free analysis of fluorescence lifetime imaging data using the phasor approach. Nat Protoc. 13 (9), 1979-2004 (2018).
  74. Smolen, J. A., Wooley, K. L. Fluorescence lifetime image microscopy prediction with convolutional neural networks for cell detection and classification in tissues. PNAS Nexus. 1 (5), pgac235(2022).
  75. Walsh, A. J., et al. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nat Biomed Eng. 5 (1), 77-88 (2021).
  76. Vu, T., et al. Spatial transcriptomics using combinatorial fluorescence spectral and lifetime encoding, imaging and analysis. Nat Commun. 13 (1), 169(2022).

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