蛍光脂肪酸類似体を用いた内皮脂肪酸取り込みの定量化

サマリー

このプロトコルは、長鎖および超長鎖飽和脂肪酸のBODIPY-C₁₂およびBODIPY-C₁₆蛍光類似体による刺激時に内皮細胞における細胞脂質取り込みを測定するためのin vitroアッセイを詳述する。この方法は効率的で他の細胞型にも適応できるため、脂質代謝を研究するための有用なアプローチを提供します。

要約

内皮細胞 (EC) は、血流から代謝組織への脂肪酸 (FA) 輸送を調節する上で中心的な役割を果たしていますが、信頼性とスケーラブルな方法で EC FA の取り込みを定量化するツールは依然として限られています。ここでは、蛍光FA類似体(BODIPY-C₁₂ およびBODIPY-C₁₆)を使用してECにおけるFA取り込みを測定するための迅速で定量的かつ費用対効果の高いアッセイを提示し、96ウェルプレートフォーマットでの鎖長特異的取り込みダイナミクスの調査を可能にします。このプロトコルには、陽性 (3-ヒドロキシイソ酪酸、乳酸) および陰性 (ニクロサミド) コントロールが組み込まれており、一次 (HUVEC) と不死化 (EA.hy926) の両方の EC ラインで検証されています。このアッセイは、時間および用量依存のFA取り込みを検出し、結果はHoechst核染色を使用して細胞数に正規化され、適切なコントロールを使用してバックグラウンドで補正されます。生細胞イメージングやパルスチェイス形式など、さまざまな細胞タイプ、イメージングモダリティ、実験条件に適応できます。従来の脂質染色や放射性標識トレーサーと比較して、この方法は、生細胞での動的な FA 取り込みを捕捉しながら、安全性、速度、多用途性を向上させます。このアッセイは、内皮脂質輸送の調節と代謝性疾患への寄与を研究するための堅牢なプラットフォームを提供します。

概要

脂質などの血液由来の栄養素が骨格筋などの代謝組織に入るためには、まず毛細血管の壁を構成する内皮細胞(EC)関門を通過する必要があります。脂肪酸(FA)は単にこの障壁を越えて拡散して下にある組織に到達すると長い間信じられていましたが、新たな証拠は、ECが疎水性分子を水性細胞外および細胞内の世界に移動するように進化した特殊な輸送メカニズムを通じてこのプロセスを積極的に調節することを示唆^{しています1。}

血流中では、FAはアルブミン結合遊離脂肪酸(FFA)として存在するか、カイロミクロンや超低密度リポタンパク質(VLDL^)などのトリグリセリドに富むリポタンパク質(TRL)内にパッケージ化されています2。ECの管腔表面では、リポタンパク質リパーゼ(LPL)がTRLを加水分解してFFAを放出し、取り込みを行います。FA輸送には、細胞へのFAの実際の取り込みを実行するCD36を含む、さまざまなタンパク質が関与しています。ベクター輸送を媒介する脂肪酸輸送タンパク質(FATP)およびアシルCoA合成酵素(ACSL)。親油性シャペロンとして作用する脂肪結合タンパク質(FABP)、および無数の他のタンパク質、まだ発見および分類されていないものもあります^2,3。下にある組織も同様のメカニズムを使用して輸送された脂肪を取り込みますが、存在する特定のアイソフォームは細胞の種類によって異なることがよくあります。

最近の研究では、ECがパラクリンシグナル伝達を介して隣接する細胞と協調し、標的組織へのFA輸送を調節することが示されています。たとえば、骨格筋細胞は、3-ヒドロキシイソ酪酸(3-HIB)、血管内皮増殖因子B(VEGFB)、アペリンなどのパラクリン因子の集まりを分泌して、近くの内皮^によるFA輸送を促進します^4,5,6。興味深いことに、インスリンが脂肪細胞を刺激して乳酸を放出し、ECがFAを取り込むように刺激する場合のように、内分泌系も関与している^{可能性があります7。}

したがって、EC は脂肪の調節ゲートキーパーとして機能し、心血管疾患や 2 型糖尿病などの脂質代謝障害において重要な役割を果たしていることを示唆しています。最近の証拠は、EC自体が脂肪過負荷に応答して脂質滴(LD)を蓄積し、下^{にある組織への}脂肪酸送達を調節する緩衝液として機能する可能性があることを示しています^8,9。現代の食事の場合のように、脂肪を大量に摂取する場合、これらのLDの過剰な蓄積は、血管機能障害や高血圧を含む病気の一因となる可能性があります¹⁰。全体として、ECがFAをどのように取り込み、輸送するかをよりよく理解することは、脂質媒介性疾患に対処するための新しい治療法を提供する可能性があります。

この研究では、蛍光長鎖 FA 類似体 BODIPY-C₁₂ および BODIPY-C₁₆ を使用して、内皮 FA 取り込みを測定するための、シンプルで迅速かつ費用対効果の高いアッセイについて説明します。これらの試薬は、特に細胞脂肪取り込みの測定に伝統的に使用されてきた放射性または重同位体標識FAと比較して、かなり安価で非常に安全です^11,12。これらの試薬は、細胞の疎水性領域、主にLDに受動的に蓄積する非共役「遊離」BODIPY色素とは異なることに注意することが重要です¹³。対照的に、BODIPYを脂肪族FA鎖(例えば、C₁₂またはC₁₆)に結合させると、天然の長鎖FAを構造的に模倣する分子が生成されます。この修飾により、細胞内脂質の貯蔵や液滴形成を反映するのではなく、細胞への動的脂肪酸取り込みの特異的な測定が可能になります。

このアプローチの主な強みは、その柔軟性です。研究者は、他の細胞型、可変インキュベーション時間、およびさまざまなBODIPY結合FA類似体を使用して、鎖長依存性の取り込み、またはシスパリナル脂肪酸¹⁴などの天然蛍光脂質を研究できます。全体として、このプロトコルは、研究者に複数の条件下で細胞FA取り込みをテストする簡単な方法を提供し、脂質代謝、内皮生物学、および代謝性疾患における基本的な質問に答える道を開きます(図1)。

プロトコル

この研究で使用されたすべてのヒト由来内皮細胞 (HUVEC) は、ヒト生物学的材料の倫理的使用に関する機関およびベンダーのガイドラインに従って、市販の匿名化された供給源から入手されました。すべてのステップは、層流フードの下の無菌環境で実行します。すべての試薬と機器のリストについては、 材料表 を参照してください。

1. 96ウェルプレートのゼラチンコーティング

1. 25 mLの2%ゼラチンストックを500 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈して、0.1%ゼラチン溶液を調製します。
2. 完全に混合し、0.2 μmの真空フィルター(またはオートクレーブ)を使用してフィルター滅菌します。
3. 0.1%ゼラチンを1ウェルあたり100 μLを、黒色の底が透明な96ウェルプレートに加えます。
4. 37°Cで少なくとも30分間、または理想的には一晩インキュベートします。

2. 細胞播種

1. 完全培地中にECの単一細胞懸濁液を調製します。
   1. 適切な基礎培地に10%ウシ胎児血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシン(両方のv/v)を補充して、完全な培地を調製します。
      注:基礎培地は、特定の細胞タイプによって異なります。この研究では、内皮増殖培地 (EGM-2) とダルベッコ修飾イーグル培地 (DMEM) をそれぞれ HUVEC 細胞と EA.hy926 細胞に使用しました。
2. 100 μLの細胞懸濁液を、細胞が翌日までにコンフルエンスに到達できるようにする播種密度で各ウェルにピペットで入れます。

3. 処理試薬の調製と応用

1. すべての試薬を二価PBS(Ca²⁺ およびMg²⁺を含む)で調製し、37°Cに予熱します。
   1. 3-HIB(ポジティブコントロール)を20 mMの作業溶液として調製します。原液を二重蒸留水に1 Mで溶解し、4°Cで保存します。
   2. 乳酸(ポジティブコントロール)を20 mMの作業溶液として調製します。原液を二重蒸留水に1 Mで溶解し、4°Cで保存します。
   3. ニクロサミド(ネガティブコントロール)を最終濃度1μMで調製します。原液をDMSOに10mMで溶解します。凍結融解サイクルを避けるために少量に分注し、-20°Cで保存します。
2. 予熱した二価PBSで細胞を一度洗浄します。
3. 適切な処理試薬(3-HIB、乳酸、またはニクロサミド)をウェルあたり50 μL添加し、37°Cで30分間(ニクロサミドの場合)または60分間(3-HIBおよび乳酸の場合)インキュベートします。

4. BODYPY-FA: BSA複合体の調製と応用

1. 2:1 FA:BSAモル比を使用して、PBS中で最終濃度0.5 μM、1 μM、または2 μMのBODIPY-FA:BSA 複合体を調製します。2 μMのBODYPY-FA溶液の場合、1 μMのFAフリーBSAをPBS中でインキュベートします。1 μM BODYPY-FAの場合は、0.5 μM BSAを使用します。インキュベーション中は常に複合体を光から保護してください。
2. 使用前に混合物を室温で10分間インキュベートします。
3. 50 μLの複合体を処理ウェルに加えます。
   注: エッジ効果を避けるために、中央の 10 列のみを使用してください。外側のカラムを自家蛍光コントロールとして予約し、これらのウェルにはPBSのみを追加します。
4. プレートを37°Cで1分間、5分間、または10分間インキュベートします。

5. 蛍光消光と細胞内シグナル検出

1. 1 μMのFAフリーBSAを洗浄バッファーとしてPBS中で調製し、37°Cに予熱します。
2. BODIPY-FA:BSA を除去し、PBS 中の予熱した 1 μM FA フリー BSA 50 μL でプレート全体を 2 回洗浄します。各洗浄を1.5分間行います。
3. 50 μLの0.08%トリパンブルーを加えて、細胞外蛍光を消光します。
4. マイクロプレートリーダーを使用して、次の設定で細胞内蛍光をすぐに測定します:励起:488 nm、発光:515 nm、カットオフ:495 nm、モード:ボトムリード。
   注:ステップ4でBODIPY-FAで処理されなかった細胞を含む外側のカラムウェルを使用して、自家蛍光バックグラウンドを差し引きます。

6.細胞正規化のためのヘクスト核染色

1. トリパンブルー溶液を取り除き、PBSで優しく洗浄します。
   注:細胞はやや壊れやすく、脱落しやすい場合があります。洗濯の際は注意してください。
2. 10%培地に4 μg/mLのHoechstを加え、37°Cで30分間インキュベートします。
   注:Hoechstのインキュベーション時間には最適化が必要な場合があります。細胞の種類によっては、均一な核標識と十分なシグナル強度を達成するために5分から60分が必要な場合があります。外側の列に Hoechst を追加しないでください。
3. プレートをPBSで一度洗浄します。
4. 新しいPBSを追加し、次の設定を使用してHoechst蛍光を測定します:励起:350 nm、発光:461 nm、カットオフ:455 nm、モード:ボトムリード。
   注:外側のカラムウェルを使用して、Hoechst自家蛍光バックグラウンドを差し引きます。
5. ステップ5.3の自家蛍光補正値をステップ6.4で得られた対応するHoechst値で除算することにより、BODIPY-FA蛍光を細胞数に正規化します。BODIPY 信号と Hoechst 信号の両方にバックグラウンド補正値を使用します。
   注:最終値は、BODIPYチャネルとHoechstチャネルの両方で自家蛍光について補正された、細胞数に正規化されたBODIPY-FA取り込みを表します。

7. 統計分析

1. 二元配置分散分析を使用して 図 2 の統計分析を実行し、時間、集中、およびそれらの相互作用の影響を評価します。多重比較のためにTukeyの事後検定を適用します。
2. 図3と図4では、2つの条件を比較するときに、スチューデントの対応のない両側t検定を使用します。3つ以上の条件を含む実験では、一元配置分散分析とそれに続くダネット検定を使用して多重比較を行います。

結果

図1に示すように、このアッセイでは、ECをウェルに直接シードする96ウェルプレートフォーマットを使用します。BODIPY標識FAはウシ血清アルブミン(BSA)に結合し、実験ウェルと対照ウェルの両方に適用されます。FA治療の前に、ECは、siRNAトランスフェクションやCRISPR遺伝子編集などの薬理学的治療または遺伝的摂動によって操作できます。重要なことに、このような操作により、アッセイの信頼性を確保するために適切なポジティブコントロールとネガティブコントロールを含めることも可能になります。

HUVECとEA.hy926細胞の両方で、BODIPY-C₁₂を0.5 μM、1 μM、および2 μMで1分、5分、および10分間インキュベートした後、細胞内BODIPY-C₉₂₆シグナルの明確な用量依存性および時間依存性の増加が観察されました(図2)。ウェルあたりの細胞数の潜在的な変動を説明するために、BODIPY-C₁₂値をHoechst核染色に正規化し、蛍光で測定しました。バックグラウンドの自家蛍光は、no-BODIPY および no-Hoechst コントロールウェルを使用して補正されました。

アッセイの再現性と範囲を検証するために、BODIPY-C₁₂ を使用してEA.hy926 ECで脂肪酸代謝の既知のモジュレーターをテストしました(図3)。乳酸(0 mM、5 mM、20 mM)または3-HIB(0 mM、5 mM、20 mM)の濃度を増加させた1時間の処理は、用量依存的にBODIPY-C₁₂ の取り込みを促進し、FA取り込みの正の調節因子としての役割を確認しました。逆に、化学ニクロサミドがミトコンドリア脱共役 を介して 脂肪酸の取り込みを阻害できることが以前に実証されています¹⁵。実際、ニクロサミド(1 μM)による30分間の処理により、ビヒクルコントロールと比較してBODIPY-C₁₂ シグナルが大幅に減少し、ネガティブコントロールとしての有用性が検証されたため、同様の結果がここで再現されました。これらのデータは、細胞数の違いを説明するためにヘクストに正規化されていますが、これらの処理はいずれも細胞生存率やヘクスト蛍光値を変化させませんでした。

さまざまな脂肪酸類似体に対するアッセイの適応性を評価するために、非常に長鎖脂肪酸のプロキシと見なすことができるBODIPY-C₁₆をHUVECに投与し、5分間のインキュベーション後にその取り込みを測定しました(図4)。乳酸処理(0 mM、10 mM、20 mM)は用量依存的にBODIPY-C₁₆ シグナルを増加させ、ニクロサミド(1 μM)はシグナルを減少させ、BODIPY-C₁₂で観察された結果を反映していることが観察されました。

全体として、このアッセイにより、一次 (HUVEC) および不死化 (EA.hy926) EC の両方における FA 取り込みの堅牢で再現性のある定量化が可能になりました。さらに、これらの発見は、さまざまな鎖長の FA にわたるアッセイの多用途性を実証するだけでなく、ポジティブ コントロールとネガティブ コントロールの両方の妥当性を示しています。

図1:BODIPY標識脂肪酸を用いた脂肪酸取り込みアッセイの概略図。 内皮細胞を黒色の透明な底の96ウェルプレートに播種し、BODIPY共役脂肪酸(FA)類似体とインキュベートして細胞内取り込みを可能にします。インキュベーション後、細胞外蛍光をトリパンブルーで消光し、ボトムリード蛍光マイクロプレートリーダーを使用して細胞内シグナルを測定します。蛍光測定後にヘヒスト核染色を適用して、正規化のための細胞数を定量化します。BODIPY-FA インキュベーションの前に、薬理学的治療または遺伝的摂動を適用できます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:初代内皮細胞および不死化内皮細胞におけるBODIPY-C₁₂取り込みの定量化。 (A)0.5 μM、1 μM、および2 μM BODIPY-C₁₂で1分、5分、および10分間インキュベーションした後のHUVECにおけるBODIPY-C₁₂取り込みの時間および濃度依存性の増加は、それぞれ0.25 μM、0.5 μM、および1 μMのFAフリーBSAに複合体化した。(B)EA.hy926細胞は、同一条件下で同様の時間依存性および用量依存性のBODIPY-C₁₂取り込みを示しました。平均蛍光強度は、Hoechst染色核(細胞数)およびBODIPYなしのコントロールに正規化されました。データは平均± SD として示されます。統計分析は、二元配置分散分析を使用して実行され、時間、集中力、およびそれらの相互作用の影響を評価し、続いて多重比較のために Tukey の事後検定が行われました。時間(p < 0.0001)、濃度(p < 0.0001)、およびそれらの相互作用(p = 0.0443)について有意な主効果が観察されました。Tukeyの検定によって特定された統計的に有意なペアワイズ比較は、棒グラフに次のように示されます:*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、および****p < 0.0001。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:EA.hy926のポジティブコントロールとネガティブコントロールを使用したアッセイの検証。 (A)1時間の乳酸処理(0 mM、5 mM、20 mM)は、用量依存的にBODIPY-C₁₂ の取り込みを増加させました。(B)1時間の3-HIB処理(0 mM、5 mM、20 mM)は、同様にFA取り込みを増加させました。(C)30分間のニクロサミド処理(1 μM)は、ビヒクルコントロール(DMSO)と比較してBODIPY-C₁₂ の取り込みを有意に抑制しました。平均蛍光強度は、Hoechst染色核(細胞数)およびBODIPYなしのコントロールに正規化されました。データは平均±SDとして示されています。2 μM BODIPY-C₁₂ (1 μM脂肪酸フリーBSAに複合体化)をすべての実験で5分間インキュベートしました。(A)と(B)の統計量は、多重比較にはダネット検定の一元配置分散分析を使用し、Cについてはスチューデントの対応のない両側 T検定を使用して決定されました。p < 0.0001。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:HUVECにおけるBODIPY-C₁₆ を使用したアッセイ検証。 (A)乳酸処理(0 mM、10 mM、20 mMを1時間)は、用量依存的にBODIPY-C₁₆ の取り込みを増強しました。(B)ニクロサミド処理(1 μMで1時間)は、ビヒクル処理対照と比較してBODIPY-C₁₆ シグナルを有意に減少させました。平均蛍光強度は、Hoechst染色核(細胞数)およびBODIPYなしのコントロールに正規化されました。データは平均±SDとして示されています。2 μM BODIPY-C₁₆ (1 μM脂肪酸フリーBSAに複合体化)をすべての実験で5分間インキュベートしました。(A)の統計量は、多重比較のためにダネットの検定で一元配置分散分析を使用して決定され、Bについてはスチューデントの対応のない両側 T検定を使用して決定されました。*p < 0.05、***p < 0.001、****p < 0.0001。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

このアッセイは、96ウェルプレートベースのフォーマットと蛍光長鎖FA類似体を使用して、ECにおけるFA取り込みを測定するための迅速で定量的かつ費用対効果の高い方法を提供します。このプロトコルは、ポジティブコントロールとネガティブコントロールの両方を組み込み、一次 (HUVEC) および不死化 (EA.hy926) EC 全体で検証することにより、堅牢性、再現性、および幅広い適用性を実証します。

蛍光ベースの分析は、前述のように、内皮脂質輸送のパラクリン調節因子を明らかにするのに役立ちました^4,5,7。これらの例は、標準化されたシステムが、制御されたin vitro設定で脂質輸送の代謝物主導の調節を確実に解明し続ける方法を強調しています。ここで説明するプロトコルは、複数の濃度(0.5〜2 μM)でのBODIPY-C₁₂およびBODIPY-C₁₆の使用およびインキュベーション時間(1分、5分、および10分)を含む、信頼性の高いFA取り込み測定のための重要なパラメータを確立します。また、3-HIBと乳酸に反応した取り込みの増加と、ニクロサミドによる治療後の取り込みの減少を効果的に検出し、その感度とダイナミックレンジの両方を確認しました。このアッセイはEC用に最適化されていますが、BODIPY:BSA比と治療条件を調整することで、脂肪細胞、筋管、肝細胞などの他の細胞型に容易に適応できます。また、互換性のあるプレートを使用した生細胞イメージング用に変更したり、パルスチェイス形式に適合させて、細胞内FAの保持、代謝、または流出を評価することもできます。

他のアプローチと比較して、この方法には、スケーラブルで定量的であり、さまざまな FA チェーン長に適応できるという明確な利点があります。さらに、費用対効果が高く、ほんの一握りのステップしか含まず、一般的なマイクロプレートリーダーよりも複雑ではない機器を必要とするため、学生を含む新規ユーザーがこのプロトコルをすばやく習得できます。最後に、累積脂質含有量を反映する定性的顕微鏡ベースの方法やオイルレッドOのようなエンドポイント染色とは異なり、このプロトコルは、固定や溶解を必要とせずにリアルタイムのFA取り込みをキャプチャします。

それにもかかわらず、いくつかの制限に注意する必要があります。2D静的培養システムの使用は、血管環境の生理学的複雑さを完全に要約するものではありません。せん断応力やLPLを介した脂肪分解、内皮と実質の相互作用などの重要な要因は、この単純化されたモデルには存在しません。マイクロ流体またはオルガノイドベースの3D共培養などの高度なシステムは、より優れた技術的専門知識とインフラストラクチャを必要としますが、in vivoアーキテクチャとシグナル伝達をよりよく模倣します^16,17。たとえば、マイクロ流体バイオリアクターは、ECが微小血管系の形成を模倣し、他の組織タイプと相互作用できる環境を提供し、研究者がより生理学的な設定でパラクリンダイナミクスをモデル化できるようにします¹⁸。さらに、最近の研究は、3Dヒドロゲル培養19でライブ蛍光イメージングを実行するための特殊なシステムを開発できることを示しています。このような進歩により、このアッセイがいつかより生理学的に代表的な細胞培養システムに適応できるという確信が得られますが、最適化を実行する必要があります。

要約すると、このアッセイは、さまざまな条件下での細胞 FA 取り込みを調査するための柔軟でアクセスしやすく、再現性のあるプラットフォームを表しています。メカニズムの in vitro 研究に最適ですが、このシステムから得られた洞察は、内皮脂質輸送のより生理学的に関連するモデルを使用した将来の研究に役立つ可能性があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3-ヒドロキシイソブチレート(3-HIB)	ケイマン・ケミカルズ	26105	陽性コントロール、最終濃度5または20 mM。
96枚の黒い透明底ポリスチレンマイクロプレート	シグマ・オルドリッチ	CLS3603-48EA	プレートセルのアッセイのために
ボディピー FL C12(ボディピー-FA)	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	D3822	緑色蛍光長鎖脂肪酸
ボディピーFL C16(ボディピー-FA)	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	D3821	緑色蛍光の非常に長鎖脂肪酸
牛血清アルブミン溶液	シグマ・オルドリッチ	A9205-50ML	ボディピー:BSA複合体の準備に使われます
ジメチルスルホキシド(DMSO)	シグマ・オルドリッチ	D2650	医薬品株の溶剤
使い捨てピペット貯水池	VWR	89094-680	細胞にピペットで送り込むさまざまな溶液を含んでいます
ダルベッコ改良イーグルS Medium	コーニング・ライフサイエンス	10-013-CV	EA.hy926セル用のメディア
EA.hy926 セル	ATCC	CRL-2922	不死化内皮細胞ハイブリッド系統
EGM-2 内皮細胞成長培地-2 BulletKit	ロンザ	CC-3162	HUVEC用メディア
胎児用牛血清(FBS)	VWR	97068-085	EGM-2およびDMEMに10%の補足
蛍光マイクロプレートリーダー	様々な	該当なし	蛍光測定が可能なマイクロプレートリーダーは
ゼラチン溶液	シグマ・オルドリッチ	G1393-100ml	0.1%の作業濃度でプレートをコーティングするために使われます
Hoechst 33342 ソリューション	生命科学	62249	細胞正規化のための核染色(4 & μ;M)
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)	ロンザ	C2519A	一次ヒト内皮細胞
マルチチャネルピペット	VWR	76627-768	96ウェルプレートへのピペッティング用
ニクロスアミド	ミリポール・シグマ	N3510-50G	ネガティブコントロール、1μM 最終集中
PBS、カルシウムとマグネシウム配合	フィッシャー・サイエンティフィック	21031CV	処理の準備や洗浄バッファー(BSA使用)に使用されます。
カルシウムとマグネシウムなしのPBS	ジェネシー・サイエンティフィック	25-508	ゼラチン希釈、ホエスト染色、一般的な洗浄用
ペニシリン/ストレプトマイシン	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	15140122	EGM-2およびDMEMに1%のサプリメントが加えられています
L-乳酸ナトリウム	シグマ・オルドリッチ	L7022-5G	陽性コントロール、最終濃度5または20 mM。
トリパンブルー溶液	シグマ・オルドリッチ	T8154-20ML	細胞外蛍光消光に0.08%で使用
真空ろ過システム、500ml PES膜、0.45µm	ジェンクローン	25-227	ゼラチン溶液を滅菌するために