大規模データセットのユーザーフレンドリーで強力なR分析

科学分野で大規模なデータセットの利用可能性が高まるにつれ、研究者がこれらの大規模なデータセットを正確かつ簡単に迅速に分析できるように、ユーザーフレンドリーなツールを開発することが重要です。一般的な大規模なデータセットの1つのタイプは、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとして使用することから来ており、これにより、生細胞や生物における遺伝子発現の簡単、継続的、非侵襲的な検査が可能になりました。発光記録の自動化は、ルシフェラーゼ発光の測定を変革し、特に概日^{時計分野における}データ収集の拡大につながりました^1,2。96ウェルマイクロプレートとスタッカー付きの自動プレートリーダーを使用すると、ルシフェラーゼ遺伝子を発現する数千のサンプルを時系列で個別にアッセイでき、場合によっては数日間1時間間隔で、1回の実験で分析できます。このようなハイスループット実験により、従来の遺伝子発現実験では、手作業でサンプルを採取し、その後のRNAプロセシングでは達成できなかった大規模なデータセットが生成されました。このような大規模なデータセットをタイムリーに分析することは重要ですが、困難な場合があります。

リズミシティのデータを分析するためのツールは数多く存在しますが、ツールの多くは発光レポーター発現ではなく動物の行動ベースのアッセイを分析します3,4,5,6,7 (補足表S1)。一部のツールでは、研究者には Python スキルや MATLAB へのアクセスなど、事前のコンピューター プログラミング スキルが必要です。他のツールではソフトウェアの購入が必要であり、コストがかかる可能性があります。いくつかの無料の実行可能なソリューションはオンラインで入手できます。そのようなツールの 1 つが BioDare2⁸ で、リズミカル データを分析するためのさまざまな方法を提供します。BioDare2 はユーザーフレンドリーなオンライン ツールであり、最小限の計算専門知識しか必要としません。ユーザーは、入力されたデータをオンラインでアップロードし、さらに処理するためにオンライン インターフェイスからデータ出力をダウンロードする必要があります。

ここでは、大規模なデータセットを簡単に分析するための複数の機能を備えたユーザーフレンドリーな R スクリプトを紹介します。スクリプトの実行には、R と Python のインターフェイスである無料のオープンソース ソフトウェア RStudio⁹ を使用します。RStudio は、Windows、Mac、Linux などのさまざまなコンピューター システムで使用できます。このレポートでは、特にプロトコル セクション 1 と 2 で、R スクリプトの使用方法をユーザーにガイドするための詳細な段階的な手順が提供されます。この方法では、ユーザーからの入力は最小限で済みます。Rの予備知識がなく、プログラミングの経験がない初心者でも、この方法を使用して、ルシフェラーゼアッセイからの大規模なデータセット、または時系列データを含む他の種類のデータセットを分析できるものとします。すべての入出力データはローカルコンピュータに保存されるため、関連するすべてのRパッケージを初めてダウンロードすると、インターネットアクセスの制限なしにどこでも分析を行うことができます。出力データは、適切に整理されたフォルダーに分類され、その結果はパブリケーション用に処理される準備ができています。統計分析も出力の一部として含まれており、サンプル間の違いを迅速に評価できます。したがって、R メソッドは、大規模なデータセットを分析する研究者に簡単で強力なソリューションを提供する可能性があります。

1. ルシフェラーゼに基づく概日時計解析

1. ルシフェラーゼアッセイの実験セットアップ
   注:ルシフェラーゼアッセイは、概日時計の活動をリアルタイムで測定するために使用される一般的な方法です。生きたトランスジェニック生物や細胞が運ぶルシフェラーゼレポーターから放出される発光は、自動的に記録できるため、大規模な時系列データセットの作成につながります。当研究室では、主にルシフェラーゼ遺伝子を発現するシロイヌナズナの苗木をレポーターとして使用しています。図1と図2は、私たちの研究室で96ウェルフォーマットの苗木を用いたルシフェラーゼアッセイの典型的な実験セットアップのフローチャートを示しており、以前の説明²に基づいて変更されています。
   1. ビーカー内の100 mLのハウス漂白剤に3 mLの36%(w / w)HClを3 mL加えて生成した漂白剤蒸気で種子を滅菌します。ビーカーを密閉された蓋付きのベルジャーに入れ、化学ヒュームフードに入れます。滅菌後、層流キャビネット内で、滅菌ガラスパスツールピペットを使用して、0.5%スクロースと0.8%寒天(pH 5.7)を含む1/2MSプレートに種子をプレーティングします。化学廃棄物は蓋付きの瓶に集め、施設の環境保健サービス部門と協力して処分します。
   2. プレートを4°Cで2日間置いてから、12時間の光と12時間の暗光サイクル(LD)の組織培養チャンバーに移動します。
   3. LDで苗木を4日間成長させます。
   4. 苗木を96ウェルプレートに移します。各ウェルには、180 μLのアッセイ培地(1/2MS、0.5%スクロース、0.4%寒天、0.25 mMルシフェリン)が含まれています。プレートをLDに1日間置き、続いて24時間の定光(LL)で1日間置きます。
   5. ウェルに処理または模擬溶液を追加し、LLで5〜7日間、1時間間隔で発光を記録します。ゲインのために発光フィルターレンズを3,600に設定し、測定間隔時間を1秒に設定します。
      注意: 録音の開始時刻はいつでも可能です。ただし、R スクリプトは整数 (整数) のみを取るため、記録間隔は整数でなければなりません。たとえば、1 時間の間隔は許可されますが、R スクリプトでは 15 分の間隔は許可されません。
   6. 記録の最後に、プレートの写真を撮って苗の成長を記録します。
   7. プレートリーダー用のデータ解析ソフトウェアで「名前を付けて保存」機能を使用して、生データをR解析用のCSVファイルとして保存します。
2. ルシフェラーゼに基づく概日データのR解析の段階的解説
   注: この R 分析では、R スクリプトを使用します。補足ファイル1(LUC_2025.R)、概日データ解析用に開発された、および入力ファイル補足ファイル2(NO7.csv)。R スクリプトと入力ファイルは、オンライン リポジトリ プラットフォーム Github (https://github.com/elvenfire29/Circadian-Luciferase-Analysis) を介して公開されています。
   1. コンピュータシステム^9,10と互換性のあるRStudioソフトウェアをダウンロードします。
   2. 補足ファイル 1 (LUC_2025.R) で必要な RStudio アルゴリズム パッケージをダウンロードします: MetaCycle¹¹: MetaCycle パッケージの ARSER アルゴリズム¹²、ggplot2¹³、dplyr¹⁴、magrittr¹⁵、stringr¹⁶、filesstrings¹⁷、circular¹⁸、AICcmodavg¹⁹、および broom²⁰。
      注: パッケージのリストについては、R スクリプトの上部も参照してください。
   3. ユーザー入力Iの変更(作業ディレクトリ、入力ファイルの名前、処理のラベル、アッセイの相対開始時間など、ローカルコンピューター上の特定のデータセットに従って)。
      注: ステップ 1.2.1 と 1.2.2 は一度だけ完了する必要があります。その後、RStudio インターフェイス コンソールは、新しい分析ごとに変更を加えて、ユーザー入力を受け取る準備が整います。ユーザー入力セクションには2つの部分があります(補足図S1)。
      1. 作業ディレクトリを選択します。入力ファイルの場所を示します。同じフォルダが出力ファイルの場所になります。
      2. 入力ファイル、つまり R スクリプト用に正しくフォーマットされた CSV ファイルを選択します (図 2B)。具体的には、一番上の行には時系列があり、最初の列には96ウェルプレート上の個々のサンプル位置が含まれています。
         注:このような入力CSVファイルの例は、補足ファイル2(NO7.csv)にあります。
      3. サンプルや処理に名前を付けます。この分析は、時間経過のある96ウェル設定から得られたデータに使用されるため、実験を、プレートあたり合計12回の処理で処理ごとに8回の反復、またはプレートごとに合計最大8回の処理で処理ごとに12回の繰り返しとして設計します。サンプル数がカウントされるため、正しいサンプル数 (8 または 12) を入力してください。サンプル数が 8 または 12 でない場合、コードは実行されません。ただし、空のウェルの列がある場合は、処理名のスペースにそのようにリストします(たとえば、空の1、空の2として名前を付けます)。
         注: サンプル名の場合、バックスラッシュや同様の記号の使用は、ファイル名の問題を引き起こす可能性があるため、避けてください。さらに、ユーザー入力IIでANOVAを使用することを選択する場合は、ラベルとして「NA」を使用することも避ける必要があります。まったく同じ名前の治療は、1 つの大きな治療グループにまとめられます。
      4. アッセイの相対的な開始時間を示します。24時間の特定の日について、主観的な夜明けは、通常の明暗サイクル中にチャンバーライトがオンになったときです。たとえば、午前 7 時にライトが点灯している場合、この時間は概日時間 0 と考えてください。ルシフェラーゼアッセイが午前9時に開始された場合、アッセイ時間は概日時間2になります。相対開始時刻として 2 を入力します。
         注: 相対開始時刻は整数である必要があり、負にすることはできません。これは、サンプルの位相読み取りに影響します。
   4. 特定のニーズに応じてユーザー入力IIオプションを変更します。
      注: 以下の手順では、ユーザー入力セクションの詳細な説明と、変更を行うためのステップバイステップのガイドを提供します。
      1. グラフを含めます:発光曲線、遺伝子型および処理ごとの期間、位相、振幅のプロット。
      2. Tukey HSD で ANOVA 検定を使用して、治療の周期、位相、振幅を比較します。ANOVA検定出力のコントロールを選択します。ANOVA 検定のコントロールを指定するか、オプションを空のままにして、各処理をペアワイズ比較のコントロールとして使用します。または、ANOVA 出力ファイルに番号を付けて、参照と整理を容易にするかどうかを選択します。
      3. t 検定を使用して、治療の周期、位相、振幅を比較します。t検定をペアワイズ比較にするかどうかを選択します。ペアワイズ t 検定を選択した場合は、データがペアであるかどうかを選択します。t検定のコントロールを選択します。t検定のコントロールを指定するか、オプションを空のままにして、各処理をコントロールとして使用します。参照と整理を容易にするために、t検定出力ファイルに番号を付けるかどうかを選択します。
         注:これは、SAまたはMockのいずれかが追加された同じ遺伝子型の2つの系統など、一度に2つの治療を比較するためにのみ使用してください。表示されている p 値は、同じ線との複数比較を考慮して調整されていません。
      4. 時点を丸めるかどうかを選択します。時点が 1 分か 2 分しかずれていない場合は、最も近い時間に丸めて、この分析を使用します。
         注:このコードは、ARSメソッド¹²を使用して周期、位相、および振幅を計算します。この方法では、実行するために時間単位の一線性のある時系列が必要です。
      5. プレートリーダーがウェルを記録する方法に応じて、入力の読み取り方法を変更します。A1、A2、A3 によるウェルの標準データリストのいずれかを選択します。または、A1、B1、C1 にリストされている井戸用のもの...
   5. コンソールの右上隅にある [ソース] ボタンをクリックするだけで、分析を実行します。
      注:解析が完了するまでに1分もかかりません。R 分析の出力は、入力データセットと同じファイル フォルダーに自動的に表示されます。
   6. 出力の表示:出力フォルダーには、各遺伝子型および/または処理の反復の平均期間、位相、振幅の統計情報を含む包括的な分析を提供するいくつかのドキュメントとサブフォルダーがあります。
      注:入力ファイル補足ファイル2(NO7.csv)については、プロトコルセクション1の補足ファイル1(LUC_2025.R)スクリプトによって生成された出力ドキュメントのリストを表1に示し、補足図S2のツリー構造で便利に表示できます。

2. ルミノールベースのROSアッセイ

1. ROSアッセイの実験セットアップ
   1. 生検パンチャーで生検パンチャーで、生因植物の4枚目から7枚目の葉から直径4mmの葉の円盤を切り取ります。
   2. 毛むくじゃらの面を上にして、96ウェルプレート内の100 μLの滅菌水の上に葉ディスクを浮かせます。
   3. プレートをきれいな錫箔で覆い、LD成長チャンバーに一晩置きます。
   4. 水を100 μLのルミノール溶液(pH 7.4の10 mM MOPSバッファー中で300 μM、および1 μM flg22または別の誘発体)に置き換えます。対照として flg22 の代わりにモック ソリューションを使用します。
   5. すぐに40〜60分間、毎分発光測定値の記録を開始します。
2. ROSデータのR解析の段階的解説
   注:このR解析では、Rstudio、Rスクリプト、 補足ファイル3(ROS_2025.R)、および入力ファイル補足ファイル4(ROS_flg22.csv)または補足ファイル5(ROS_elf26.csv)を使用します。R スクリプトと入力ファイル Supplemental File 4 (ROS_flg22.csv) は、オンライン リポジトリ プラットフォーム Github (https://github.com/elvenfire29/ROS-Luminol-Analysis) を介して公開されています
   1. RStudio パッケージをダウンロードします: gplot2¹³、dplyr¹⁴、magrittr¹⁵、stringr¹⁶、および filesstrings¹⁷。
      注: 手順 2.2.1 は一度だけ完了する必要があります。ユーザーが各分析をコンピュータ上の特定のデータセットに合わせて調整できるようにするために、「ユーザー入力」と呼ばれるセクションが作成され、ユーザーが実験の特定のパラメータを指定できるようにしました(補足図S3)。
   2. ローカルコンピュータ上の特定のデータセット(作業ディレクトリ、入力ファイルの名前、処理のラベル、アッセイの相対開始時間など)に従って、ユーザー入力Iを変更します。
      1. 作業ディレクトリを選択します。入力ファイルの場所を示します。同じフォルダが出力ファイルの場所になります。
      2. 入力ファイル、つまり R スクリプト用に正しくフォーマットされた CSV ファイルを選択します (図 2B)。具体的には、一番上の行には時系列があり、最初の列には96ウェルプレート上の個々のサンプル位置が含まれています。
         注:このような入力CSVファイルの例は、補足資料、補足ファイル4(ROS_flg22.csv)または補足ファイル5(ROS_elf26.csv)にあります。
      3. サンプルや処理に名前を付けます。この分析は、時間経過のある96ウェル設定から得られたデータに使用されるため、実験を、プレートあたり合計12回の処理で処理ごとに8回の反復、またはプレートごとに合計最大8回の処理で処理ごとに12回の繰り返しとして設計します。空のウェルの列がある場合は、処理名のスペースにそのようにリストします (たとえば、空の 1、空の 2 として名前を付けるなど)。
         メモ: サンプル数はカウントされるため、正しいサンプル数 (8 または 12) を入力することが重要です。サンプル数が 8 または 12 でない場合、コードは実行されません。サンプル名の場合は、ファイル名の問題を引き起こす可能性があるため、バックスラッシュや同様の記号の使用は避けてください。また、ユーザー入力IIでANOVAを使用することを選択する場合は、ラベルとして「NA」を使用することは避けてください。補足ファイル 1 (LUC_2025.R) スクリプトとは異なり、この補足ファイル 3 (ROS_2025.R) スクリプトでは、同じ名前の処理が 1 つのグループに結合されません。
   3. ユーザー固有のニーズに応じてユーザー入力IIオプションを変更します。
      メモ:ユーザー入力の例は、補足図S3に見ることができます。
      1. Tukey HSD で ANOVA 検定を使用して、処理の発光合計を比較します。
      2. 両側 t 検定を使用して、一度に 2 つの治療のみのデータを比較します。
         注:表示されているp値は、同じ線との複数の比較を考慮して調整されていません。
      3. 蛍光曲線と蛍光の合計を比較する棒グラフをグラフ化します。平均の標準偏差または標準誤差をグラフに追加します。
      4. プレートリーダーがウェルを記録する方法に応じて、入力の読み取り方法を変更します。A1、A2、A3による井戸の標準データリストを使用します。または、A1、B1、C1 にリストされている井戸用のもの...
3. コンソールの右上隅にある [ソース] ボタンをクリックするだけで、分析を実行します。
   注:解析が完了するまでに1分もかかりません。R 分析の出力は、入力データセットと同じファイル フォルダーに自動的に表示されます。
4. 出力の表示: 出力フォルダーには、包括的な分析を提供するためのいくつかのドキュメントとサブフォルダーがあります。
   注:入力ファイル補足ファイル4(ROS_flg22.csv)について、プロトコルセクション2で説明されている補足ファイル3(ROS_2025.R)スクリプトによって生成された出力ドキュメントのツリー構造を補足図S4に示します。

ケーススタディ 1.シロイヌナズナの苗木による概日時計活動の発光アッセイ

我々は以前、グリシンリッチRNA結合タンパク質7(GRP7)遺伝子がマスタークロックタンパク質CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIATED 1(CCA1)によって制御され、GRP7の概日発現が植物防御における役割にとって重要であることを示しました野生型GRP7プロモーター(pGRP7wt:LUC)21の制御下でルシフェラーゼレポーターを発現するトランスジェニックCol-0植物を使用して.これらのトランスジェニック植物の概日時計活動を、対照植物CCA1:LUC / Col-0とともに、LUC_2025.Rという名前のRスクリプト(プロトコルセクション1の補足ファイル1 )を使用して分析しました。

NO7.csv (補足ファイル 2) という名前の入力ファイルには、7 つの独立した pGRP7wt:LUC ラインと CCA1:LUC/Col-0 コントロール (補足ファイル 2 (NO7.csv)) の発光測定値が含まれています。スクリプトを実行すると、入力ファイルNO7.csvと同じフォルダの下にNO7 outputという出力サブフォルダが生成されます(補足ファイル2(NO7.csv))。NO7出力フォルダのファイルは表1に記載されており、補足図S2のツリー構造で便利に表示できます。NO7出力フォルダ内の値をさらに処理して、図3と図4を作成しました。図3は、CCA1:LUCレポーターが3,000RLUの振幅、23.5時間の周期、3.5時間の位相を示したことを示しています。これらのクロックパラメータは、以前のレポート22,23とほぼ一致しています。pGRP7wt:Luc系統では異なる発現パターンが観察されました。すべてのpGRP7wt:LUC系統は周期と位相が類似しているように見えましたが、おそらく染色体内の導入遺伝子の位置効果による、これらの系統の振幅値に違いがありました。これらの観測は、周期、振幅、位相パラメータをRスクリプトで計算した際にさらに確認されました(図4)。この分析を検証するために、概日データ分析のための無料のオンラインプラットフォームであるBioDare2を使用して、同じデータセットを再分析しました8。R解析の結果は、BioDare2 FFT-NLLS(NLLS)アルゴリズム8,24から得られた結果と同等でした(図4)。

ケーススタディ 2.哺乳類細胞による概日時計活動の発光アッセイ
RスクリプトLUC_2025.R(補足ファイル1は、哺乳類細胞によって示される概日時計活動を分析するためにさらに使用された25。概日時計レポーターを発現するU2OS細胞株は、哺乳類の概日時計活動を測定するために一般的に使用されるモデル細胞株である26,27。96ウェルプレートで培養したPer2d:Lucレポーターを発現するU2OS細胞で生成された時系列データを再分析しました。細胞は、特定の遺伝子を標的とするsiRNA分子で処理されました。図5は、siRNAで処理されなかった陰性対照細胞が、23.3時間の周期、2.8時間の相、184.8RLUの振幅を示したことを示しています。予想通り、CRY2遺伝子を標的とするsiRNAは振幅を有意に減衰させ、レポーターの周期と位相に影響を与えました。PSMD4およびPSMD7遺伝子は、タンパク質分解のための26Sプロテアソーム蓋成分の一部であるタンパク質をコードします。前回のレポート25と一致して、R解析は、それぞれのsiRNAによるPSMD4またはPSMD7のノックダウンがクロックパラメータに影響を与えないことを示しています。したがって、このRスクリプトは、概日時計研究のためのさまざまな実験システムに容易に適用できます。

ケーススタディ 3.防御応答のためのROSアッセイ
発光概日時計アッセイからの大規模なデータセットに加えて、Rスクリプトは他のデータ型の分析に適応させることができます。ここでは、活性酸素種(ROS)を定量するためのそのようなアプリケーションの1つを紹介します。植物は病原体の侵入に対抗するためにさまざまな戦略を進化させてきたことが知られています。戦略の1つは、病原体から非自己分子を認識し、その後自然免疫応答を活性化することです。そのような初期の免疫応答の1つは、宿主が非自己分子に遭遇したときに数分以内に発生するROSバーストです。典型的なROSアッセイは、処理ごとに遺伝子型ごとに12個のリーフディスクを含む96ウェルプレートで実施されました(プロトコルセクション2)。ここでは、細菌の鞭毛タンパク質28の保存領域に由来する22アミノ酸ペプチドであるflg22と、伸長因子Tuタンパク質29由来の26アミノ酸ペプチドであるelf26の2つの一般的な誘導分子を使用して、ROSバーストを誘導しました。スクリプトである 補足ファイル 3 (ROS_2025.R) は、ROS データ分析用に開発されました。R 分析の形式に変換された ROS アッセイの 2 つの CVS ファイル、 補足ファイル 4 (ROS_flg22.csv)と 補足ファイル 5 (ROS_elf26.csv)は、補足材料セクションからダウンロードできます。R分析後、出力フォルダーは、統計分析とともに、ROSバースト曲線とアッセイ時間中の合計ROS値を含む、自分のコンピューター内の各入力ファイルと同じフォルダーに生成されます(補足図S4)。データをさらに処理して、図6を作成しました。ここに示されている結果は、手動で処理された公開された結果と同様です30。

図1:R分析用のルシフェラーゼアッセイのフローチャート。 クロックプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現する苗を滅菌し、LDの1/2 MS培地で4日間増殖させました。苗木を、D-ルシフェリンを含む180 μLの1/2 MS培地を含む96ウェルプレートに移しました。各井戸には1本の苗木が含まれていました。LD で 1 日後、続いて LL で 1 日後、プレート リーダーで発光を記録しました。プレート上の苗木は、通常、5〜7日間、1時間間隔でLLの発光について記録されました。記録後、プレートを撮影して苗の成長を評価し、生データを R 分析用の CSV ファイルとして保存しました。略語:LD = 12時間ライト/12時間ダーク;LL = 一定の光。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:発光データ取得とR解析のフローチャート。(A)Rスクリプトを使用した概日時計分析の5段階の手順が概説されています。ステップ 1.遺伝子型ごとおよび/または処理ごとに 8 本または 12 本の苗木として実験を設定します。ステップ 2.LLの発光を1時間間隔で5〜7日間記録します。ステップ 3.CSV ファイルでデータを取得してフォーマットします。ステップ 4.R を使用してデータを分析します。とステップ5。出力データを表示します。録画の開始時間はいつでも可能です。ただし、R スクリプトは整数 (整数) のみを取るため、記録間隔は整数でなければなりません。(B) R スクリプト用に正しくフォーマットされた入力 CSV ファイルのスクリーンショット。元の入力ファイル NO7.csv は、補足ファイル 2 にあります。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:トランスジェニック植物におけるpGRP7wt:LUCの概日発現。pGRP7wt:LUCの発光トレースを示します。x軸の下のバーは、主観的な昼(開いたバー)と夜(灰色のバー)を示します。各遺伝子型の発光トレースは、平均12回の繰り返しです。曲線の数が多いため、エラーバーは表示されませんでした。略語:RLU =相対発光単位。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:RスクリプトとBioDare2からの出力データの比較。図3に示すのと同じデータセットを、概日時計パラメータ、振幅、周期、位相についてRスクリプトとBioDare2で分析しました。データは、SEM ±平均値 (n=12) を表します。異なる文字は、サンプル間の有意差を示します (P < 0.05;事後 Tukey の HSD 検定による一元配置分散分析)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:哺乳類細胞による概日時計活動の分析。 DDの96ウェルプレート上で培養したPer2dLucレポーターを発現するU2OS細胞で生成された時系列データは、前述25。CRY2、PSMD4、またはPSMD7を標的とするsiRNA分子を使用して細胞を処理しました。(A)発光の痕跡。(b)per2d:Lucの振幅、周期、位相。データはSEM±平均を表します(n = 3)。パネル(B)の異なる文字は、陰性対照とsiRNA処理サンプルとの間に有意差があることを示しています(P<0.05;事後 Tukey の HSD 検定による一元配置分散分析)。略語:RLU=相対発光単位。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:RによるROSバースト解析 実生は、1 μM flg22(左)または1 μM elf26(右)で処理した直後に相対発光単位で記録されました。(A)誘発後の時間経過における遺伝子型(n = 12)あたり12本の苗木から平均された発光トレース。処理ごとの遺伝子型ごとの平均値は、R 出力の一部です。(B)flg22またはelf26処理による各遺伝子型の平均総発光数。データは、SEM±平均を表します(n = 12)。異なる文字は、サンプル間の有意差を示します (P < 0.05;事後 Tukey の HSD 検定による一元配置分散分析)。略語:RLU=相対発光単位。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表 1: R 分析からの出力ドキュメントの一覧。 これは、LUC_2025.R スクリプト (補足ファイル 1) と入力ファイル NO7.csv (補足ファイル 2) によって生成された出力ドキュメントのリストです。

補足図S1:プロトコルセクション1の入力Iと入力IIのスクリーンショット。 ユーザー入力 I は、ローカル コンピューター上の特定のデータセットに合わせて分析を調整するために変更する必要があります。ユーザー入力IIへの変更は、実験設定に応じてオプションです。 補足ファイル 1 (LUC_2025.R) スクリプトは、選択または使用されたウェルだけでなく、すべてのウェルがファイルに存在することを想定していることに注意することが重要です。 この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S2:出力ドキュメントのツリー構造。 この出力は、LUC_2025.R スクリプト (補足ファイル 1) と入力ファイル NO7.csv (補足ファイル 2) を使用して生成されました。LUC_2025.R スクリプトは、入力ファイル名に基づいて出力フォルダーを生成します。出力ファイルの詳細については、 表 1 を参照してください。ボックスはファイル フォルダーを表します。 この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S3:プロトコルセクション2のユーザー入力Iとユーザー入力IIのスクリーンショット。補足ファイル 3 (ROS_2025.R) スクリプトは、補足ファイル 1 (LUC_2025.R) スクリプトと同じ一般的な入力形式を使用します。ユーザー入力 I は、ローカル コンピューター上の特定のデータセットに合わせて分析を調整するために変更する必要があります。ユーザー入力IIへの変更は、実験設定に応じてオプションです。補足ファイル3(ROS_2025.R)スクリプトは、選択または使用されたウェルだけでなく、すべてのウェルがファイルに存在することを想定していることに注意することが重要です。この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S4:出力ドキュメントのツリー構造。 この出力は、ROS_2025.R スクリプト (補足ファイル 3) と入力ファイル ROS_flg22.csv (補足ファイル 4) を使用して生成されました。ROS_2025.R スクリプトは、入力ファイル名に基づいて出力フォルダーを生成します。そのフォルダ内には、Total ROS Counts のファイルとグラフのファイルがあります。PRISMとグラフデータ、ANOVA検定、およびt検定用のサブフォルダーもあります。ボックスはファイル フォルダーを表します。 この図をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表 S1: 概日データ分析に利用可能なバイオインフォマティクス ツールのリスト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:LUC_2025.R. これは、概日時計データの分析に使用される R スクリプトです。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 2: NO7.csv。 これは、概日時計データの例を含む入力ファイルです。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル3:ROS_2025.R. これは、ROS データの分析に使用される R スクリプトです。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 4: ROS_fig22.csv。 ROSデータの例を含む入力ファイルです。ROSは1μMのflg22処理によって誘導されました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 5: ROS_elf26.csv。 ROSデータの例を含む入力ファイルです。ROSは1μMのelf26処理によって誘導されました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者には開示すべき利益相反はありません。