3 つの異なる方法論の比較分析を使用したがん細胞の増殖に対する SASP 因子の影響の評価

サマリー

この研究では、リアルタイムモニタリングを備えた 3 つの in vitro モデルを使用して、老化性 HeLa 細胞からの老化関連分泌表現型 (SASP) 因子が非老化性 HeLa 細胞に及ぼす増殖効果を評価します。がんにおける細胞間相互作用をよりよく理解するために、各方法の利点と限界を体系的に比較しました。

要約

化学療法によって誘発された老化がん細胞は、老化関連分泌表現型と呼ばれるさまざまな因子も分泌して、細胞外微小環境を調節します。以前の研究では、これらの SASP 因子が、増殖、上皮間葉転換 (EMT)、血管新生、遊走の促進など、周囲の細胞に有害なパラクリン効果を発揮することが報告されています。同じ種類の細胞と異なる種類の細胞を一緒に培養することにより、相互作用から生じる細胞プロセスを理解するために、いくつかの in vitro 共培養技術が広く使用されています。ここでは、老化性HeLa細胞が非老化性HeLa細胞に分泌するSASP因子の潜在的な増殖効果を、3つの相補的な in vitro アプローチを用いて調査した。最初のアプローチでは、老化細胞と非老化細胞を共培養して、SASPによって媒介されるパラクリンシグナル伝達を調査しました。2番目のアプローチでは、老化がん細胞から採取した条件付け培地を濃縮し、その後、増殖をリアルタイムでモニタリングしながら条件付けされた培地の影響を調べるために使用しました。3番目の方法では、老化細胞と非老化細胞を並べて培養し、細胞間直接接触によるSASPのジュクタクリン効果を評価しました。3つの実験モデルはすべて、SASP因子が非老化がん細胞の増殖を有意に促進することを一貫して実証しました。特に、老化細胞共培養は増殖率を64.6%増加させ、3倍濃縮SASPコンディショニング培地は対照と比較して増殖を50%以上増加させました。蛍光ベースのイメージングでは、ジュクタクリン条件下でGFP陽性細胞数が49.3%増加しました。これらの方法を総合すると、SASP 誘発性増殖変化の定量的および定性的評価が可能になりました。これらのアプローチの比較分析により、それぞれの長所と限界が浮き彫りになり、老化細胞のパラクリン効果についての貴重な洞察が得られます。

概要

多細胞生物では、細胞は微小環境とメッセージを交換することにより、パラクリンおよびジュクタクリンシグナル伝達を介して通信し、それによって互いの行動に影響を与えます。このコミュニケーションは、ナノチューブやギャップ接合をトンネリングして直接行うことも、サイトカイン、成長因子、ケモカインなどの可溶性化学分子を細胞外マトリックスに分泌することで間接的に行うこともできます。これらのシグナル伝達メカニズムは、組織の発達や免疫細胞応答などのさまざまな生理学的プロセスの調節に重要な役割を果たしており、がん、HIV、高血圧、アルツハイマー病などの多くの疾患の病因にも関与しています¹。

1960年代に、レナード・ヘイフリックは、正常なヒト線維芽細胞がin vitroで複製する能力が限られていることを発見^{しました2。}テロメラーゼの短縮によって発生するこの制限された細胞増殖状態は、複製老化と呼ばれます。その後の研究により、さまざまな形態の細胞ストレスも細胞老化を引き起こす可能性があることが明らかになりました。化学療法や放射線療法などの一般的ながん治療も、治療誘発性老化と呼ばれるがん細胞と間質細胞の両方に細胞老化を誘発することが判明しています^3,4。細胞の老化と老化は階層的に関連するプロセスです。それらは異なる生物学的プロセスを表しています。生物内の老化細胞の蓄積は、炎症、組織機能障害、加齢に伴う病気の発症を促進することにより、老化に寄与します。ただし、老化には、老化と比較して、はるかに幅広い全身的なイベントとメカニズムが含まれます⁵。

老化細胞は、^{正常細胞と比較して}、それらの拡張した細胞質が有意に大きく、平らな形態を有することを特徴とする6。これらの老化細胞はリソソーム活性が増加しており、酸性pH 6.0でも活性を維持するリソソーム酵素である老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-gal)活性が陽性です。SA-β-gal染色は、^{老化細胞を}検出するために最も広く使用されているバイオマーカーです7。核の肥大と不規則な形態は、老化中の細胞で一般的に観察されます。さらに、これらの細胞は、不可逆的な細胞周期停止を媒介する老化関連異色病巣(SAHF)と呼ばれる独特のクロマチン再構成によって特徴付けられます^8,9。

老化したがん細胞は最終的に増殖能力を失いましたが、生存可能であり、代謝活性を維持しました。老化細胞は、老化関連分泌表現型(SASP)^10,11と呼ばれる細胞外腫瘍微小環境を調節するためにさまざまな因子も分泌することが知られています。これらのSASP因子には、可溶性シグナル伝達因子(インターロイキン、ケモカイン、成長因子)、分泌プロテアーゼ、および分泌不溶性タンパク質/細胞外マトリックス(ECM)成分が含まれます。集合的に、これらの要因は、がん細胞の増殖、遊走、浸潤、および上皮から間葉への移行(EMT^)の誘導の促進など、有害なパラクリン効果を発揮します^4,12。さらに、化学療法誘発性の副作用は、老化細胞の蓄積に部分的に起因しています¹³。したがって、老化細胞と非老化細胞の間の相互作用を調査することは、がん治療の文脈において重要な研究分野となっています。特に、SASP因子、特にその組成とがん微小環境への影響の分析は、がん治療の新しい標的分子を特定し、これらの分子の新薬を発見するための有望な戦略と考えられています。

in vitro 共培養技術は、細胞間相互作用の理解を研究するために長い間使用されてきました¹⁴。この方法論の記事では、3つの異なる方法を使用して、老化細胞から分泌される因子の非老化がん細胞に対する増殖活性の可能性を評価することが目的でした。さらに、3つの異なる方法から得られた結果を比較し、それぞれのアプローチのそれぞれの長所と短所を批判的に評価しました。

まず、老化性HeLa細胞と非老化性HeLa細胞の間に共培養モデルを設定し、リアルタイム細胞分析システム¹²を使用して、がん細胞増殖の可能性のある変化をリアルタイムで監視しました。このシステムは、細胞間相互作用を評価するための2つのプレートで構成されています。下層を形成する電子プレートビューは、標的細胞が播種される表面を持ち、プレートの下部に微小電極が配置されています。この表面への標的細胞の接着によって生成される電気抵抗は、測定可能なパラメータセルインデックス(CI)で表されます。CI値は、細胞の数と表面への接着度に比例します¹⁵。さらに、eプレートビューにより、位相差顕微鏡下で細胞の形態学的検査が可能です。上層を形成する電子プレートインサートは、エフェクター細胞が播種される領域です。このプレートの底面は、0.4μmの孔径の半透膜で覆われています。エフェクター細胞から分泌された因子は、膜を通過し、電子プレートビューの標的細胞に影響を与える可能性があります。この相互作用が細胞増殖を刺激する場合、これはCI値の増加として観察されます。したがって、細胞間の相互作用を定量的に評価できます。

2番目の方法では、老化HeLa細胞から採取したコンディショニング培地を濃縮し、非老化HeLa細胞に添加しました。これらの細胞に対する潜在的な増殖効果は、リアルタイム細胞分析システムを使用して監視されました。

3番目の方法では、老化したHeLa細胞と非老化のGFP-HeLa細胞を直接2Dで共培養し、がん細胞の増殖変化の可能性を顕微鏡下でリアルタイムに監視することが計画されました。

この実験の目的は、老化性HeLa細胞と非老化性HeLa細胞の間の相互作用を研究し、がん細胞増殖の可能性の変化をリアルタイムで監視するための3つのモデルを設定することです。したがって、老化がん細胞から分泌されるSASP因子が他のがん細胞に及ぼす影響を簡単に調べることができます。したがって、3 つのアプローチの利点と限界が体系的に評価されました。

プロトコル

注:すべての細胞培養手順は、認定された安全キャビネット内のバイオセーフティレベルII+(BSL2 +)条件下で実施されました。ドキソルビシンは危険な化学療法剤です。すべての手順は、白衣や手袋などの適切な個人用保護具 (PPE) を使用して、認定されたバイオセーフティ レベル II+ (BSL2+) キャビネットで実行する必要があります。培地や固定剤を含むドキソルビシンを含むすべての廃棄物は、指定された明確なラベルが貼られた有害廃棄物容器に収集し、施設の有害廃棄物管理システムを通じて処分する必要があります。

1. モデル1:リアルタイム細胞解析システムを用いた共培養

1. 細胞の培養と老化の誘導(1-2日目)
   1. 10%ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン(100 U/mL)、およびストレプトマイシン(0.1 μg/mL)を添加した5 mLのダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)を含むT25培養フラスコに8 x 10⁵ HeLa細胞を播種し、5%CO₂を含む加湿雰囲気で37°Cで細胞をインキュベートします。
   2. 翌日、細胞の培地を5 mLの新鮮な完全培地と交換します。細胞老化を誘導するために培地に添加することにより、細胞を300 nMドキソルビシンで直接処理します。T25フラスコを5%CO₂ を含むインキュベーターで37°Cで72時間維持します。
2. 非老化細胞播種(4日目)
   1. 10%ウシ胎児血清、ペニシリン(100 U/mL)、およびストレプトマイシン(0.1 μg/mL)を添加した5 mLのDMEMの新しいT25フラスコに8 x 10⁵ 個の未処理HeLa細胞(非老化対照)を播種し、5%CO₂で37°Cの加湿インキュベーターに保持します。
3. 老化の誘発の確認(5日目)
   1. 72時間のドキソルビシン治療が老化を誘発したかどうかを判断するには、SA-β-gal^{染色を実行します}6。このアッセイは、主な実験では使用されていない別の細胞セットで実行します。得られた結果については、 図1A、Bを参照してください。
   2. 老化がんHeLa細胞のコンディショニング培地中のIL-6を測定して、それらの分泌活性を評価します。細胞をドキソルビシンで72時間処理し、続いて無血清およびフェノールレッドフリー培地でさらに2日間インキュベートします。収集したコンディショニング培地を細胞数に正規化し、IL-6レベルを測定します。
      注:IL-6は、SASP¹²の特徴的なサイトカインです。IL-6測定の結果を 図1Cに示します。
4. リアルタイム細胞分析システムのセットアップ(5日目)
   1. 細胞播種前にリアルタイム細胞分析システムの電源を入れます。RTCAソフトウェア2.0を起動します。[ Exp Notes ]ボタン(図2)をクリックし、実験の詳細を入力します。
   2. [ スケジュール] ボタンをクリックし、2 つのステップを追加します。最初のステップは背景です。2番目のステップは、15分ごとに細胞増殖を72時間監視することです。
   3. [最初のステップ]を選択し、[再生]をクリックして、電子プレートビューの各ウェルに50 μLの完全培地を追加してバックグラウンドインピーダンスを記録します。
5. 電子プレートビューへの細胞の播種(5日目)
   1. ドキソルビシン処理(老化)と未処理(非老化)の両方のHeLa細胞を、細胞を播種する前に、位相差顕微鏡で10倍の倍率を使用してチェックします。顕微鏡下では、老化細胞は正常細胞よりもはるかに拡大した形態を持っています。
   2. 老化性および非老化性の両方のHeLa細胞を5 mLの滅菌予熱PBSで洗浄し、吸引します。
   3. 予熱した0.05%トリプシン1 mLを加え、フラスコを37°Cで2分間維持して細胞を剥離します。10%ウシ胎児血清、ペニシリン(100 U/mL)、およびストレプトマイシン(0.1 μg/mL)を添加した5 mLの完全DMEMでトリプシンを中和します。
   4. 細胞を室温で500 x g で10分間遠心分離し、上清を廃棄し、10%ウシ胎児血清、ペニシリン(100 U/mL)、およびストレプトマイシン(0.1 μg/mL)を添加した5 mLの完全DMEMに細胞ペレットを再懸濁します。
   5. 血球計算盤を用いたトリパンブルー色素排除法を用いて生細胞を数える。
   6. 10%ウシ胎児血清、ペニシリン(100 U/mL)、およびストレプトマイシン(0.1 μg/mL)を添加した完全な100 μLのDMEMに、1つのeプレートビューの各ウェルに5 x 10^3細胞/ ウェルの密度で非老化性HeLa細胞を播種します。
   7. eプレートビューをリアルタイム細胞分析システムのクレードルに配置して、細胞をインキュベーターのプレート表面に付着させます。
   8. スケジュールボタンで 「Second Step 」を選択し、「 Play 」ボタンをクリックして、RTCAソフトウェア2.0を使用して72時間のインピーダンス測定を開始します(図2)。
6. 電子プレートインサートへの細胞の播種
   1. 1つのeプレート内のシード細胞は、10%ウシ胎児血清、ペニシリン(100 U/mL)、およびストレプトマイシン(0.1 μg/mL)を添加した60 μLの完全DMEMにウェルを挿入します。
   2. 3つの異なる実験セットアップでeプレートインサートに細胞を播種します。グループ1(ネガティブコントロール):細胞を播種しない(培地のみ)
      グループ 2: 2 × 10⁴ つの非老化性 HeLa 細胞
      グループ 3: 1 × 10⁵ 個の老化性 HeLa 細胞
   3. eプレートインサートを5%CO₂ のインキュベーターで37°Cで6時間維持して取り付けます。
7. 共培養細胞
   1. セルシーディングの6時間後に 一時停止 をクリックします。eプレートビューの各ウェルから培地をそっと吸引して、血清細胞と非接着細胞を除去します。
   2. 37°Cで予熱したPBSでウェルを2回洗浄します。140 μLの無血清DMEMをeプレートビューの各ウェルに加えます。
   3. 電子プレートインサートを取り、培地を吸引します。37°CでPBSで2回静かに洗浄し、60 μLの無血清DMEMを加えます。
   4. 電子プレートインサートを電子プレートビューに配置し、インサートがウェルに完全に収まるまでゆっくりと押し下げます。
   5. 結合プレートをリアルタイム細胞解析システムに挿入し、[ 再生 ]をクリックすると、ソフトウェアを使用して15分間隔で細胞インデックス値のリアルタイムモニタリングを再開します(図2)。
   6. 実験時間が終了したら、リアルタイム細胞分析システムをオフにします(図3A)。
8. eプレートインサート上の細胞のイメージング
   注:eプレートインサートウェルには膜があるため、ここに播種された細胞は位相差顕微鏡を使用して膜上で視覚化することはできません。したがって、細胞が実験の終わりまで生存率を維持したかどうか、および老化細胞が構造的完全性を維持しているかどうかをテストするために、それらをDAPIで染色しました(図3B)。
   1. 電子プレート ビューから電子プレート インサートを取り外します。電子プレートインサート内の細胞をDAPIで染色し、蛍光顕微鏡¹⁶で細胞の存在を確認します。老化細胞の核は正常細胞の核よりも大きいことが知られています。したがって、DAPIで染色された細胞の核サイズに基づいて、どのウェルに非老化細胞が播種され、どのウェルに老化細胞が播種されたかを決定します。
9. 電子プレートビューでの細胞のイメージング
   1. 10倍の倍率を使用して位相差顕微鏡で電子プレートビューを直接調べます(図3B)。電子プレートビューでは、各ウェルの中央から4列の微小電極センサーが取り外されたため、顕微鏡による細胞モニタリングを可能にするスペース6が作成されました。
10. データ分析
    1. eプレートビューとeプレートインサートが組み合わされ、リアルタイムセル解析システムに挿入された時点でのCI値を正規化します。
    2. [ データ解析 ]ボタンをクリックして、リアルタイムセル解析システムから得られた最大セルインデックスと傾きデータを使用して増殖率と量を計算します(図2)。次に、適切な統計プログラムを使用してデータを分析します(図3C、D)。

2. モデル2:リアルタイム細胞解析システムを用いたコンディショニング培地処理アッセイ

1. 細胞の培養と老化の誘導(1-2日目)
   1. 10%ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン(100 U/mL)、およびストレプトマイシン(0.1 μg/mL)を添加した2.5 mLのダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)を含む6ウェルプレートの各ウェルに35 x 10⁴ HeLa細胞を播種し、5%CO₂を含む加湿雰囲気で37°Cで細胞をインキュベートします。
   2. 翌日、細胞の培地を2.5 mLの新鮮な完全培地に交換します。細胞老化を誘導するために培地に添加することにより、300 nMドキソルビシンで細胞を直接処理します。6ウェルプレートを5%CO₂ を入れたインキュベーターで37°Cで72時間維持します。
2. 非老化細胞播種(4日目)
   1. 35 x 10⁴ 個の未処理HeLa細胞(非老化対照)を、10%ウシ胎児血清、ペニシリン(100 U/mL)、およびストレプトマイシン(0.1 μg/mL)を添加した2.5 mLのDMEMに新しい6ウェルプレートの各ウェルに播種し、5%CO₂で37°Cの加湿インキュベーターに保持します。
3. ステップ1.3で説明したように、老化の誘発の確認を行います。
4. 老化および非老化HeLa細胞からのコンディショニング培地の調製
   1. ドキソルビシン処理細胞(老化細胞)と未処理のHeLa細胞(非老化細胞)の両方を位相差顕微鏡で確認します。顕微鏡下では、老化細胞は正常細胞よりもはるかに拡大した形態を持っています。
   2. 2つの6ウェルプレート(老化性および非老化性HeLa細胞)の両方から培地を吸引します。細胞を37°Cで予熱したPBSで2回洗浄し、残留血清と細胞破片を除去します。
   3. ペニシリン(100 U/mL)とストレプトマイシン(0.1 μg/mL)を添加した無血清DMEMを各ウェルに2 mL加えます。細胞を37°Cの加湿インキュベーターで5%CO₂ で48時間インキュベートします。
5. コンディショニング培地の収集と濃縮(7日目)
   1. 各ウェルから調整された培地を層流安全キャビン内の滅菌チューブに収集します。
   2. 細胞をトリプシン化し、血球計算盤を使用したトリパンブルー色素排除法を使用して細胞をカウントし、条件付け培地を細胞数に正規化します。
   3. 細胞数に従って正規化されたコンディショニング培地を、滅菌2 mLチューブにペニシリン(100 U/mL)とストレプトマイシン(0.1 μg/mL)を添加した無血清DMEMで最終容量2 mLに調整します。
   4. 収集したコンディショニング培地を1,000 x g で4°Cで10分間遠心分離して細胞破片を除去し、続いて10,000 x g で4°Cで10分間遠心分離して、清澄化した上清を得る。
   5. 2 mLの超遠心フィルターユニットを使用して、コンディショニングされた培地を4°Cで3,000 x g で60分間遠心分離し、濃縮します。この手順では、2 mLのコンディショニング培地を濃縮された400 μLのコンディショニング培地の5倍に濃縮します。
   6. 得られた40 μLのコンディショニング培地を新鮮な無血清培地で希釈し、層流安全キャビン内の滅菌チューブで1x、2x、および3x濃縮コンディショニング培地を調製します。
      注:細胞上に48時間残った培地は細胞の消費により枯渇するため、収集および濃縮されたコンディショニング培地は、その後新しい培地で希釈されます。
6. eプレートビューへの細胞の播種
   1. ステップ1.1〜1.4で説明したように、リアルタイム細胞解析システムをセットアップします。非老化性HeLa細胞を予熱したPBSで洗浄し、吸引します。
   2. 予熱した0.05%トリプシン1 mLを加え、フラスコを37°Cで2分間維持して細胞を剥離します。10%ウシ胎児血清、ペニシリン(100 U/mL)、およびストレプトマイシン(0.1 μg/mL)を添加した5 mLの完全DMEMでトリプシンを中和します。
   3. 細胞を室温で500 x g で10分間遠心分離し、上清を廃棄し、10%ウシ胎児血清、ペニシリン(100 U/mL)、およびストレプトマイシン(0.1 μg/mL)を添加した5 mLの完全DMEMに細胞ペレットを再懸濁します。
   4. 血球計算盤を用いたトリパンブルー色素排除法を用いて生細胞を数える。
   5. 10%ウシ胎児血清、ペニシリン(100 U/mL)、およびストレプトマイシン(0.1 μg/mL)を添加した200 μLの完全DMEMに、1つのeプレートビューの各ウェルに5 x 10^3細胞/ ウェルの密度で非老化性HeLa細胞を播種します。
   6. eプレートビューをリアルタイム細胞分析システムのクレードルに配置して、細胞をインキュベーターのプレート表面に付着させます。
   7. スケジュールボタンの2番目のステップを選択し、[再生]ボタンをクリックして、RTCAソフトウェア2.0を使用してインピーダンス測定を開始します(図2)。非老化性HeLa細胞をプレーティングして6時間後に、ソフトウェアの[一時停止]ボタンをクリックします(図2)。
   8. eプレートビューの各ウェルから培地をそっと吸引して、血清細胞と非接着細胞を除去します。37°Cで予熱したPBSでウェルを2回洗浄します。
   9. 予熱して37°Cに調整した培地を適切なグループに加えます。
      グループ1:生鮮メディア
      グループ2:1x非老化性HeLa細胞調整培地
      グループ3:2x非老化性HeLa細胞コンディショニング培地
      グループ4:3x非老化性HeLa細胞コンディショニング培地
      グループ5:1x老化性HeLa細胞コンディショニング培地
      グループ6:2x老化性HeLa細胞調整培地
      グループ7:3x老化HeLa細胞調整培地
   10. eプレートビューをリアルタイムセル解析システムに挿入し、[ 再生 ]をクリックすると、15分間隔で48時間、セルインデックス値のリアルタイムモニタリングを再開します(図2)。
   11. 実験時間が終了したら、リアルタイム細胞分析システムをオフにします(図4A)。
7. 電子プレートビューでの細胞のイメージング
   1. 位相差顕微鏡で10倍の倍率で電子プレートビューを直接調べます(図4B)。電子プレートビューでは、各ウェルの中央から4列の微小電極センサーが取り外されたため、ミクロソピーによる細胞モニタリングを可能にするスペースが生まれました。
8. データ分析
   1. 濃縮コンディショニング培地が非老化性HeLa細胞に投与された時点でのCI値を正規化します。
   2. [ データ解析 ]ボタンをクリックすると、リアルタイム細胞解析システムから得られた最大細胞指数と傾きデータを使用して増殖率と増殖量を計算します(図2)。次に、適切な統計プログラムを使用してデータを分析します(図4C、D)。

3. モデル3:細胞間相互作用のリアルタイムモニタリング

1. 細胞の培養と老化の誘導(1-2日目)
   1. 10%ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン(100 U/mL)、およびストレプトマイシン(0.1 μg/mL)を添加した5 mLのダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)を含むT25培養フラスコに8 x 10⁵ HeLa細胞を播種し、5%CO₂を含む加湿雰囲気で37°Cで細胞をインキュベートします。
   2. 翌日、細胞の培地を5 mLの新鮮な完全培地と交換します。細胞老化を誘導するために培地に添加することにより、細胞を300 nMドキソルビシンで直接処理します。T25フラスコを5%CO₂ を含むインキュベーターで37°Cで72時間維持します。
2. 非老化細胞播種(4日目)
   1. 10%ウシ胎児血清、ペニシリン(100 U/mL)、およびストレプトマイシン(0.1 μg/mL)を添加した5 mLのDMEMに新しいT25フラスコで8 x 10⁵ GFP-HeLa細胞(非老化対照)を播種し、5%CO₂で37°Cの加湿インキュベーターに保持します。
   2. 8 x 10⁵ HeLa細胞(非老化対照)を、10%ウシ胎児血清、ペニシリン(100 U/mL)、およびストレプトマイシン(0.1 μg/mL)を添加した5 mLのDMEMに新しいT25フラスコに播種し、5%CO₂で37°Cの加湿インキュベーターに保持します。
3. ステップ1.3(5日目)で説明したように、老化の誘発の確認を実行します。
4. 共培養細胞
   1. ドキソルビシン処理細胞、未処理のGFP-HeLa、および未処理のHeLa細胞を位相差顕微鏡で確認してから、細胞を播種します。顕微鏡下では、老化細胞は正常細胞よりもはるかに拡大した形態を持っています。
   2. 3つのT25フラスコすべてを5 mLの滅菌予熱PBSで洗浄し、吸引します。予熱した0.05%トリプシン1 mLを加え、フラスコを37°Cで2分間維持して細胞を剥離します。
   3. 10%ウシ胎児血清、ペニシリン(100 U/mL)、およびストレプトマイシン(0.1 μg/mL)を添加した5 mLの完全DMEMでトリプシンを中和します。
   4. 細胞を室温で500 x g で10分間遠心分離し、上清を廃棄し、10%ウシ胎児血清、ペニシリン(100 U/mL)、およびストレプトマイシン(0.1 μg/mL)を添加した5 mLの完全DMEMに細胞ペレットを再懸濁します。
   5. 血球計算盤を用いたトリパンブルー色素排除法を用いて生細胞を数える。10%ウシ胎児血清、ペニシリン(100 U/ml)、およびストレプトマイシン(0.1 μg/mL)を添加した200 μLの完全DMEMに細胞を播種します。
   6. 細胞を3つの異なる実験セットアップでμスライド8ウェルハイに播種します。
      グループ1:7 x 10³ GFP-HeLa細胞
      グループ 2: 18 x 10 3 非老化性 HeLa 細胞 + 7 x 10^{3 GFP-HeLa} 細胞
      グループ3:18 x 10³ 老化HeLa細胞+ 7 x 10³ GFP-HeLa細胞
   7. μスライドを8時間維持し、5%CO₂のインキュベーターで37°Cで取り付けます。8時間後、細胞に対する血清の影響を排除するために、予熱したPBS(37°C)で細胞を2回洗浄します。
   8. ペニシリン(100 U/mL)とストレプトマイシン(0.1 μg/mL)を含む無血清DMEM200 μLを各ウェルに加えます。
5. 顕微鏡のセットアップ
   1. 温度コントローラーとCO_2-Controllerの電源を入れ、ステージトップのインキュベーションシステムを30分間安定させます。
   2. CO₂ 濃度と温度の設定を手動で確認し、生理学的条件(5%CO₂、37°C)に達していることを確認します。
   3. 倒立蛍光顕微鏡の電源を入れ、システムが自己校正を完了できるようにします。蛍光光源のスイッチを入れます。イメージングおよび解析ソフトウェアを起動して、イメージングパラメータと画像取得を制御します。
6. タイムラプスイメージング
   1. スライドを、高解像度デジタルカメラで倒立蛍光顕微鏡のステージトップインキュベーションチャンバーに置きます。ソフトウェアを開き、 パーツX、Y、Z、Tモードを選択し、取得設定で実験を行います(図5A)。
   2. 蛍光および位相差イメージング用に高コントラストの20倍対物レンズを選択します(図5A)。位相差と蛍光(FITCフィルター)チャネルを追加して、両方のモードでイメージングできるようにします(図5A)。
   3. [ ライブ ]ボタンをクリックして生細胞イメージングを開始し、位相差の下で細胞に焦点を合わせます(図5A)。zスタックウィンドウを開き、目的の細胞(老化/非老化HeLa細胞とGFP HeLa細胞の両方を含む)の位置をマークします。自動ステージコントローラーを使用してウェル間のステージをナビゲートし、位置マーキングのために選択した領域を正確に配置できるようにします(図5A)。
      メモ: このようにして、スライドの同じウェルで複数の領域を選択できます。
   4. チャンネルを蛍光チャンネルに切り替えて、蛍光イメージングを開始します。適切な露出(89.506ミリ秒)、ゲイン(10)、および強度(136)の設定を設定します(図5A)。
      注:これらのパラメータは、蛍光タンパク質を発現する細胞の蛍光強度によって異なります。
   5. μmのzスタック間隔を選択し、上部と下部の位置を設定し、位相差の下でzスタックを設定します(図5A)。[ 停止] をクリックして、[ライブ] オプションを閉じます。
   6. タイムラプスイメージングの [期間] フィールドと [時間間隔] フィールドを使用して、期間 (48 時間) と時間間隔 (30 分) を設定します。
   7. [ 開始 ]をクリックして、48時間のイメージングを開始します(図5A)。48時間後にプロジェクトを保存します(図5A)。
   8. 各時点(0時間と48時間)で、zスタックから最適なフレームを選択し、画像をエクスポートします(図5A)。
   9. 0時間および48時間でGFP陽性細胞をカウントし、GFP陽性細胞の増加率を計算し、適切なソフトウェアプログラムを使用してデータを分析します(図1D、E)。
7. ムービーの生成
   1. [ Show Gallery] をクリックして、キャプチャされたすべての画像を時点と Z スタック層別に整理して表示します (図 5B)。
   2. 各時点で、対応するZスタックから 最も焦点の合った画像 を右クリックし、行 の親指を選択を選択します。選択したフレームを保存します(図5B)。
   3. このプロセスをポジションごとに個別に繰り返します。最も焦点の合った画像を選択するには、最適なフォーカスフレームを検索機能を使用します。選択した画像を保存するには、選択したフレームを保存オプションを使用します。保存した画像は、プロジェクトを開くセクションに自動的にアップロードされます。
   4. ムービーを右クリックし、画像シーケンスが完全にロードされたら、画像のエクスポートを選択します。
   5. エクスポートウィンドウの[ムービー]タブに移動し、目的のフレームレート(フレーム/秒)を設定し、必要に応じてスケールバー、タイムスタンプなどの追加オプションを選択し、[参照]オプションを使用してエクスポート先を選択してエクスポートを完了します(図5B、ビデオ1、ビデオ2、およびビデオ3)。

結果

この代表的な一連の実験は、老化がん細胞に由来する老化関連分泌表現型が他のがん細胞に及ぼす潜在的な影響を調査しました。したがって、ドキソルビシンによる72時間の治療が、SA-β-Gal染色を用いてHeLa細胞の老化を誘導できるかどうかを最初に確認しました。老化細胞では、リソソーム酵素β-ガラクトシダーゼは低pHでも活性を維持し、発色基質X-galを切断して青色沈殿物^{を形成します17}。したがって、青色に染色された細胞の存在は、細胞老化の誘導を示しています。ドキソルビシン治療は、対照群と比較して HeLa 細胞の老化の統計的に有意な誘導をもたらし、p < 0.0001 でした。 (図1A、B、 n = 3)。形態学的分析により、老化細胞は対照細胞と比較してより大きく、より平らな外観を示すことも明らかになりました。 図1C は、ドキソルビシン処理HeLa細胞の条件付け培地中...

ディスカッション

微小環境におけるがん細胞の動的相互作用は腫瘍の進行にとって重要であり、転移の誘導と二次腫瘍の発生に影響を与えます。また、老化がんと間質細胞は、^{老化細胞から}分泌される因子を通じて腫瘍の微小環境を調節することも報告されています4。これらの因子は、細胞の増殖、遊走、浸潤、分化を刺激し、多剤耐性を増加させます^4,13。したがって、周囲のがん細胞に対する SASP の影響を理解することは、腫瘍微小環境を理解するために不可欠です。

この研究では、非老化がん細胞におけるSASP因子の増殖活性の可能性を3つの異なる方法を使用して評価しました。最初の方法では、このシステムは、細胞インデックス値を追跡することにより、細胞増殖のリアルタイムモニタリングを可能にします。eプレートビューでは、選択したインキュベーションポイントで記録を一時停止することにより、位相差顕微鏡下で標的...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
µ-スライド8 井戸高