PhosタグSDS-PAGEゲル電気泳動と in vitro キナーゼアッセイを用いたリン酸化修飾の解明

サマリー

このプロトコルは、臨床サンプルおよび in vitro キナーゼアッセイ中のPhos-tagゲル電気泳動を使用して、標的タンパク質のリン酸化修飾の変化を検出する手順を説明しています。

要約

リン酸化は、タンパク質機能を調節する古典的な翻訳後修飾です。タンパク質には通常、複数の潜在的なリン酸化部位が含まれており、さまざまな場所でさまざまなキナーゼによって修飾される可能性があります。疾患における標的タンパク質のリン酸化変化を研究するには、多くの場合、リン酸化特異的抗体が必要です。ただし、商用オプションは単一のサイトに限定されるか、完全に利用できない場合があります。ここでは、Phos-tagゲル電気泳動を用いて臨床サンプル中の標的タンパク質のリン酸化修飾の変化を検出し、 in vitro キナーゼアッセイにより詳細なリン酸化部位を同定する方法について説明します。Phos-tagに結合したリン酸化タンパク質は、SDS-PAGEゲル電気泳動で移動速度が遅いため、ゆっくりと移動するバンドの平均ピクセル強度に基づいて、疾患組織のリン酸化変化を半定量的に分析できます。Phos-tag SDS-PAGEと、複数の候補タンパク質に対する汎特異的抗体を用いたイムノブロッティングを組み合わせることで、研究者はリン酸化変化のある標的タンパク質を効率的に同定することができます。候補キナーゼのスクリーニングに続いて、標的タンパク質を使用して in vitro キナーゼ アッセイを実行し、得られたリン酸化生成物を質量分析にかけて正確な部位同定を行います。この方法は、特定のリン酸化タンパク質抗体を必要としないため、組織サンプルの大規模なスクリーニングにより、疾患におけるリン酸化状態の変化を特定できます。さらに、同定されたリン酸化部位は、疾患組織における定量的および局在化分析のための特異的抗体の開発に使用でき、その機能的役割についてのより深い洞察を提供します。

概要

リン酸化は、タンパク質の細胞内局在、キナーゼ活性、転写活性を調節するための重要な翻訳後修飾です。ヒトゲノムには500以上のプロテインキナーゼ遺伝子が発見されており、シグナル伝達、遺伝子発現、タンパク質間相互作用に関与^{しています1。}リン酸化と脱リン酸化はさまざまなキナーゼの制御下にあり、細胞接着、細胞増殖、および細胞分化を調節するために迅速に可逆的です²。しかし、異常なタンパク質リン酸化修飾は、腫瘍形成、自己免疫疾患、神経変性、不妊症など、多くのヒト疾患の原因となっています^3,4,5。

臨床検体のりん蛋白質プロファイリングにより、複数の候補が差次的にりん酸化された蛋白質が得られます⁶。ヒト疾患における重要なリン酸化修飾を明らかにするには、特定の標的タンパク質のリン酸化状態を検出する簡単で効率的な方法が必要です。異なる部位でのリン酸化は、タンパク質に明確な機能変化をもたらす可能性があります。したがって、特定のアミノ酸部位を標的とするリン酸化特異的抗体を使用することは、タンパク質のリン酸化の変化を検出するための最良の方法であることは間違いありません。しかし、多くのタンパク質には、十分に特徴付けられたリン酸化特異的抗体が存在しません。さらに、新しい潜在的なリン酸化部位を特定するには、より適切なアプローチが必要です。特定のアミノ酸残基でのリン酸化は、ゲル電気泳動におけるタンパク質の移動速度を変化させることが多く、移動が遅いバンドはリン^{酸化状態の変化}を反映する可能性があります7。ただし、これらのモビリティの変化は通常微妙であり、区別が困難です。Phos-tagは、アルカリホスファターゼ触媒ドメインをモデルとして設計された合成化合物で、リン酸化されたSer/Thr/TyrおよびHis/Asp/Lys残基を捕捉できます。したがって、ホスタグ結合は、リン酸化タンパク質と非リン酸化タンパク質の間の移動速度の違いを効果的に増幅すると同時に、リン^{酸化部位の数}の変動も区別します8。

組織サンプル中の標的タンパク質のリン酸化変化を検出するためのこの Phos タグベースの方法論は、従来のアプローチに比べて明確な利点をもたらします。重要なのは、リン酸化特異的抗体の必要性を排除し、代わりに標準的なWBグレードのタンパク質特異的抗体を検出に利用することです。標的タンパク質のリン酸化型と非リン酸化型は、Phos-tag SDS-PAGE中に異なるバンドとして分解され、比較バンド強度分析を通じて疾患状態におけるリン酸化レベルの変化を半定量的に評価できます。このプロトコルのワークフローには、(1)タンパク質サンプルのPhos-tag SDS-PAGE分離、(2)リン酸化標的の免疫ブロットスクリーニング、(3)ホスホ-Ser/Thr抗体によって検証された候補キナーゼを用いた in vitro キナーゼアッセイが含まれます。その後の質量分析(外部サービスプラットフォームによって実施)により、リン酸化部位を特定し、部位特異的抗体開発を可能にします。詳細な方法論は、現在のプロトコルには含まれていません。特に、このアプローチは、臨床サンプル中のNur77リン酸化変化の検出に適用され、Mst1キナーゼをNur77リン酸化の上流調節因子として同定し、Nur77のスレオニン366でのリン酸化を臨床的に検出するための部位特異的リン酸化抗体を開発し^{ました9。}したがって、このアプローチは、市販の抗体を使用して多数の標的にわたるリン酸化状態の変化を大規模にスクリーニングできるため、複数の候補タンパク質を調査する予備研究段階で特に価値があることが証明されています。

プロトコル

南京鼓楼病院の治験審査委員会は、ヒト研究を承認しました (2013-408081-01)。現在のプロトコルは、子宮内膜組織を代表的なモデルとして使用して確立されています。適切な最適化により、この方法論は、タンパク質抽出およびその後の分析のための腫瘍組織を含むがこれらに限定されない、他の臨床標本に拡張できます。子宮内膜生検は、妊娠可能な女性 (対照群) および体外 受精 - 胚移植を受けている胚着床失敗を繰り返す女性 (疾患群) から中期分泌期に行われます。すべての患者は、サンプリング手順の前にインフォームドコンセントを提供しました。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。

1. サンプルの調製

1. 得られた新鮮な組織サンプルを予冷したPBSで2回すすぎ、血球を除去し、約100 mgの組織を1.5 mLの遠心分離管に分離します。
2. 組織タンパク質溶解バッファー(150.0 mmol/L NaCl、1.0%NP-40、50.0 mmol/L Tris pH 8.0、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、プロテアーゼ阻害剤カクテル、ホスファターゼ阻害剤カクテル2および3)を含む2 mLの丸底粉砕チューブに組織を入れます。
3. 高速組織分散機の速度をレベル5(6レベルのうち)に設定し、組織を10秒間粉砕し、その後氷上で30秒間インキュベートします。このプロセスを5回繰り返して、組織ホモジネートを取得します。
4. ホモジネートを4°Cのシェーカー上で30分間ゆっくりと回転させて溶解し、次に4°Cおよび13,000 × g で10分間遠心分離し、上清を回収します。
5. BCA法を使用してタンパク質濃度を測定します。
6. 合計300 μgのタンパク質を取り、等量に調整し、4×のLaemmliタンパク質サンプルバッファーと混合します。混合物を95°Cで8分間加熱し、室温まで冷却してから、さらなる分析のためにロードすることにより、混合物を変性させます。
   注:ステップ2の前に、発現レベルを評価するために、総抗体を使用して目的のタンパク質を検出するために、従来のウェスタンブロッティング分析が推奨されます。

2. PhosタグSDS-PAGEゲルのゲル調製

1. 29.0 gのアクリルアミドと1.0 gのN,N'-メチレン-ビスアクリルアミドを加えて、100 mL 30%w/vアクリルアミド/ N,N'-メチレン-ビスアクリルアミド混合溶液を調製します。
   注:暗所で4°Cに保管してください。
2. 従来のSDS-PAGEで使用していた1.5 mol/L Tris-HCl溶液(pH 8.8)、0.5 mol/L Tris-HCl溶液(pH 6.8)、10% w/v SDS溶液、および10% w/v過硫酸アンモニウム溶液を調製します。
3. PhosタグSDS-PAGEゲルに特異的な5.0 mmol/LのPhosタグ溶液と10 mmol/L MnCl₂ 溶液を調製します。
4. 6 w/v%ポリアクリルアミドゲルと50 μMのPhosタグ溶液および100 μM MnCl₂を含む10 mL溶液を調製する場合、2 mL 30%(w / v)アクリルアミド/ビスアクリルアミド混合溶液、2.5 mL 1.5 mol/L Tris/HCl溶液(pH 8.8)、0.1 mL 5.0 mmol/L Phosタグ溶液、 0.1 mL 10 mmol/L MnCl₂ 溶液、0.1 mL 10% (w/v) SDS 溶液、10 μL TEMED、および 5.14 mL 蒸留水。
5. 調製した分離ゲル溶液を穏やかにボルテックスして均一性を確保し、ゲル溶液チューブを真空デシケーターに入れ、目に見える気泡が残らなくなるまで真空(0.1 MPa)を2分間適用します。
6. 50 μLの10%過硫酸アンモニウムを加え、穏やかに、しかし完全に混合します。
7. すぐに溶液を組み立てたゲルカセットにピペットで、ショートプレートの上端から~1cm下まで移します。気泡の導入は避けてください。
8. ゲルの上に0.5 mLの蒸留水を慎重に重ねて、空気を排除し、平らな界面を確保します。室温で20〜30分間重合させます。
9. 同時に、0.6 mL 30%(w/v)アクリルアミド/ビスアクリルアミド混合溶液、1 mL 0.5 mol/L Tris-HCl溶液(pH 6.8)、40 μL 10%(w/v)SDS溶液、4 μL TEMED、および2.33 mL蒸留水を混合して、標準的なTris-HCl緩衝スタッキング(4.5%w/vポリアクリルアミドゲル)ゲル溶液を調製します。穏やかにボルテックスして脱気します。
10. ゲルが完全に固化したことを確認します(ゲルカセットを傾けて、中間界面の不動を確認しながら、上層液層の傾きを観察します)。水のオーバーレイを慎重に注ぎ、完全に排水します。
11. 調製したスタッキングゲル溶液に20 μLの10%過硫酸アンモニウムを加え、穏やかに混合し、すぐに分離ゲルの上にピペットで移動させます。
12. 気泡を避けて、10 ウェルまたは 15 ウェルのコームをスタッキング ゲル溶液に慎重に入れます。スタッキングゲルを室温で10分間重合させます。
    注:必ず使用直前にジェルを準備してください。目的のタンパク質ごとに、Phosタグ付き濃度とアクリルアミド濃度を最適化してください。

3. PhosタグSDS-PAGEの電気泳動

1. 電気泳動装置を組み立て、電極チャンバーに従来のTris/Glycine/SDSランニングバッファーを充填します。
2. マイクロピペットを使用して、30 μgのタンパク質サンプルを各ウェルにロードします。
3. ブロモフェノールブルーが分離ゲルの底に達するまで、定電流条件(30 mA/ゲル)で電気泳動を実行します。
4. ゲルをメタノールフリーのSDS-PAGE転写バッファーに5 mM EDTAを含む10分間2回浸し、二価カチオンを除去します。
5. ウェット/タンクブロッティングシステムを使用して、タンパク質を90 Vで90分間PVDFメンブレンに転写します。

4. イムノブロッティングと分析

1. スキムミルクまたはウシ血清卵白粉末(1×トリス-ホウ酸ナトリウム-トゥイーン-20溶液、TBST)の5%溶液で室温で1時間ブロックします。
2. 標的タンパク質に対する一次抗体を適切な比率で希釈し、メンブレンと4°Cで一晩インキュベートします。
3. メンブレンをTBSTで3回、1回10分間、室温で穏やかに撹拌して洗浄します。
4. メンブレンをHRP結合二次抗体とともに室温で1時間インキュベートします。
5. メンブレンをTBSTで3回、1回10分間、室温で穏やかに撹拌して洗浄します。
6. 強化した化学発光基質と暗所で1分間インキュベートし、その後曝露します。
7. 自動ゲルドキュメンテーションシステムを使用して画像をキャプチャし、ImageJソフトウェアを使用してグレースケール強度のターゲットバンド(ゆっくりと移動するリン酸化ターゲットタンパク質と急速に移動する非リン酸化ターゲットタンパク質)を定量します。
   注:Phos-Tagゲルのウェスタンブロットは、分子量の割り当てには使用できません。
8. 各サンプルのゆっくりと移動するリン酸化バンドと急速に移動する非リン酸化バンドの比率を計算し、グループ間のリン酸化率の統計的差を分析します。

5. 標的タンパク質の免疫沈降

1. 標的タンパク質のFLAGタグ付き(またはHA、GFP、GSTまたはHisを含むがこれらに限定されない代替エピトープタグ)野生型または部位特異的リン酸化変異体をコードする発現プラスミドを構築します。
2. メーカーのプロトコルに従って、Lipofectamine 3000を使用して発現プラスミドでHEK293細胞をトランスフェクトします。
3. ステップ1で説明したように、1 mLの組織タンパク質溶解バッファーで細胞を溶解し、タンパク質上清を抽出します。
4. 上清を20 μLのAnti-FLAG M2アフィニティーゲルとともに4°Cで回転させながら一晩インキュベートします。
5. 遠心分離(1000 × g、3分)、アガロースビーズを回収し、10カラム容量のTBSで洗浄して、非特異的に結合したタンパク質を除去します。
6. FLAGペプチドをTBSに溶解し、最終濃度100μg/mLにします。
7. 抗FLAG M2アフィニティーゲルから結合したFLAG融合タンパク質を、5つの1カラム容量のFLAGペプチド溶液(20 μLのアガロースビーズに100 μLの溶液を使用)で5〜10分間穏やかに混合して溶出します。
8. 遠心分離(1000 × g、3分)し、上清を回収します。
   注:キナーゼがわかっている場合は、ステップ6に進みます。それ以外の場合は、ステップ6に進む前に、まず酵母2ハイブリッドスクリーニングまたはバイオインフォマティクス予測(例えば、PhosphositePlusまたはグループベースの予測システムを使用)を通じて潜在的なキナーゼを特定します。

6. リン酸化アミノ酸を同定するための in vitro キナーゼ アッセイ

1. キナーゼ緩衝液(反応あたり30 μL)を調製します:40 mM HEPES pH7.6、10 mM MgCl₂、1 mM EGTA、1 mM DTT、2.5 mM β-グリセロリン酸、200 μM ATP、100 ngの活性キナーゼ、免疫沈降FLAG融合タンパク質。
2. 30°Cで30分間、穏やかに攪拌しながらサーモミキサーで30分間インキュベートします。
3. 10 μLの4×Laemmliバッファーを加えて反応を停止し、95°Cで5分間変性させます。
4. 活性キナーゼの有無にかかわらず反応した免疫沈降FLAG融合タンパク質を使用して、従来のSDS-PAGE電気泳動を実行します。
5. 抗リン酸化アミノ酸を同定するための抗リン酸化-Thr抗体および抗リン酸化-Ser抗体でプローブします。アンチフラッグ抗体をコントロールとしてプローブします( 材料表を参照)。
6. 手順4で説明したように、イムノブロッティングと分析を完了します。

結果

対照群および疾患群からのヒトサンプルの予備的なリン酸化プロファイリングにより、Nur77が異なるリン酸化タンパク質の候補として同定されました。Nur77タンパク質のリン酸化検出におけるPhosタグSDS-PAGEの有効性を評価するために、Mn²⁺-PhosタグSDS-PAGE実験を実施しました。組織サンプルから全タンパク質を抽出した後、30 μgのタンパク質をロードし、Mn²⁺-Phosタグゲル電気泳動で分離し、続いてPVDFメンブレンに転写しました。免疫ブロッティングは、Nur77一次抗体とそれに続くHRP結合抗ウサギ二次抗体を使用し、ECL化学発光によって検出されました。2つの異なるバンドが観察されました(図1A)。より速く移動するバンド(下)は、非リン酸化Nur77を表します。移動の遅いバンド(上)はリン酸化Nur77を表します。半定量分析では、対照と比較して不妊群でリン酸化Nur77対非リン酸化Nur77の比率が有意に低下していることが示され(図1B)、疾患状態でのN...

ディスカッション

臨床組織における標的タンパク質のリン酸化変化を検出するための Phos-tag ベースのアプローチは、タンパク質リン酸化研究に大きな利点をもたらします。リン酸化タンパク質は、Phosタグ結合により電気泳動移動度が低下し、リン酸化特異的抗体を必要とせずに候補タンパク質のリン酸化状態をハイスループットでスクリーニングできます。これは、複数の候補タンパク質の初期の大規模なプロファイリングに特に価値があります。リン酸化修飾が変化したタンパク質は、その後の in vitro キナーゼアッセイで優先順位を付けて、特定のリン酸化部位を同定することができます。

Phos-tag SDS-PAGEのサンプル前処理は、従来のウェスタンブロッティングと類似点がありますが、いくつかの重要な技術的考慮事項に注意する必要があります。EDTAはPhosタグ機能に不可欠なMn²⁺またはZn²⁺イオンをキレート化するため、サンプル処理中はEDTA含有試薬を避ける必要があります。ただし、電...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10% SDS ソリューション	Sangon Biotech	B548118
10x Tris/Glycine/SDS	BIO-RAD
4× Laemmliタンパク質サンプルバッファー	BIO-RAD	1610747
アクリルアミド	Sangon Biotech	A601032
過硫酸アンモニウム	Sangon Biotech	A100486
抗 FLAG M2 アフィニティーゲル	Millipore	A2220
強化化学発光キット	ThermoFisher	32106
FLAG 抗体	CST	14793
フラグ ペプチド	ミリポア	F3290
HRP 標識型二次抗体	Bioworld テクノロジー	BS13278
リポフェクタミン 3000	ThermoFisher	L3000015
ミニトランスブロット細胞	BIO-RAD	1703930
Mini-PROTEAN Tetra 垂直電気泳動セル	BIO-RAD	1658005
Mst1 抗体	CST	3682
N、N'-メチレン-ビスアクリルアミド	Sangon Biotech	A600025
N、N、N'、N'-テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)	Sangon Biotech	A610508
Nur77 抗体	CST	3960
ホスファターゼ阻害剤カクテル 2	シグマ	P5726	チロシンタンパク質ホスファターゼ、酸およびアルカリホスファターゼホスファターゼ
害剤カクテル	グマ	P0044	ターゼ2A、アルカリホスファターゼ、プロテインホスファターゼ1および2Aの阻害用
スホセリン抗体	グマ	P5747
スホスレオニン抗体	グマ	P6623
スタグアクリルアミド	Wako	304-93526	ホスタグ調製用SDS PAGE ゲル
Pierce BCA タンパク質アッセイ キット	Thermo	23227
プロテアーゼ阻害剤カクテル	シグマ	S8830	EDTA フリー、錠剤、セリン、システイン、アスパラギン酸、メタロプロテアーゼ
PVDF メンブレン	Roche	3010040001
ThermoMixer	Eppendorf	2231001127
ティッシュディスパーサー	IKA	T 10	組織ホモジネートを得るには
Tris-HCl バッファー (0.5M、pH 6.8)	Sangon Biotech	B546020
Tris-HCl バッファー (1.5M、pH 8.8)	Sangon Biotech	B546019
真空デシケーター	ThermoFisher	5311-0250	ゲル溶液を脱気するには
-メルカプトエタノール	Sigma	M3148