方法論記事

PhosタグSDS-PAGEゲル電気泳動と in vitro キナーゼアッセイを用いたリン酸化修飾の解明

DOI：

10.3791/68884

⸱

2025年8月8日

 ,  , 
1Department of Gastroenterology, Zhongda Hospital, School of Medicine, Southeast University, 2Medical School of Nanjing University

この記事について

サマリー

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このプロトコルは、臨床サンプルおよび in vitro キナーゼアッセイ中のPhos-tagゲル電気泳動を使用して、標的タンパク質のリン酸化修飾の変化を検出する手順を説明しています。

要約

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リン酸化は、タンパク質機能を調節する古典的な翻訳後修飾です。タンパク質には通常、複数の潜在的なリン酸化部位が含まれており、さまざまな場所でさまざまなキナーゼによって修飾される可能性があります。疾患における標的タンパク質のリン酸化変化を研究するには、多くの場合、リン酸化特異的抗体が必要です。ただし、商用オプションは単一のサイトに限定されるか、完全に利用できない場合があります。ここでは、Phos-tagゲル電気泳動を用いて臨床サンプル中の標的タンパク質のリン酸化修飾の変化を検出し、 in vitro キナーゼアッセイにより詳細なリン酸化部位を同定する方法について説明します。Phos-tagに結合したリン酸化タンパク質は、SDS-PAGEゲル電気泳動で移動速度が遅いため、ゆっくりと移動するバンドの平均ピクセル強度に基づいて、疾患組織のリン酸化変化を半定量的に分析できます。Phos-tag SDS-PAGEと、複数の候補タンパク質に対する汎特異的抗体を用いたイムノブロッティングを組み合わせることで、研究者はリン酸化変化のある標的タンパク質を効率的に同定することができます。候補キナーゼのスクリーニングに続いて、標的タンパク質を使用して in vitro キナーゼ アッセイを実行し、得られたリン酸化生成物を質量分析にかけて正確な部位同定を行います。この方法は、特定のリン酸化タンパク質抗体を必要としないため、組織サンプルの大規模なスクリーニングにより、疾患におけるリン酸化状態の変化を特定できます。さらに、同定されたリン酸化部位は、疾患組織における定量的および局在化分析のための特異的抗体の開発に使用でき、その機能的役割についてのより深い洞察を提供します。

概要

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リン酸化は、タンパク質の細胞内局在、キナーゼ活性、転写活性を調節するための重要な翻訳後修飾です。ヒトゲノムには500以上のプロテインキナーゼ遺伝子が発見されており、シグナル伝達、遺伝子発現、タンパク質間相互作用に関与しています1。リン酸化と脱リン酸化はさまざまなキナーゼの制御下にあり、細胞接着、細胞増殖、および細胞分化を調節するために迅速に可逆的です2。しかし、異常なタンパク質リン酸化修飾は、腫瘍形成、自己免疫疾患、神経変性、不妊症など、多くのヒト疾患の原因となっています3,4,5。

臨床検体のりん蛋白質プロファイリングにより、複数の候補が差次的にりん酸化された蛋白質が得られます6。ヒト疾患における重要なリン酸化修飾を明らかにするには、特定の標的タンパク質のリン酸化状態を検出する簡単で効率的な方法が必要です。異なる部位でのリン酸化は、タンパク質に明確な機能変化をもたらす可能性があります。したがって、特定のアミノ酸部位を標的とするリン酸化特異的抗体を使用することは、タンパク質のリン酸化....

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プロトコル

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南京鼓楼病院の治験審査委員会は、ヒト研究を承認しました (2013-408081-01)。現在のプロトコルは、子宮内膜組織を代表的なモデルとして使用して確立されています。適切な最適化により、この方法論は、タンパク質抽出およびその後の分析のための腫瘍組織を含むがこれらに限定されない、他の臨床標本に拡張できます。子宮内膜生検は、妊娠可能な女性 (対照群) および体外 受精 - 胚移植を受けている胚着床失敗を繰り返す女性 (疾患群) から中期分泌期に行われます。すべての患者は、サンプリング手順の前にインフォームドコンセントを提供しました。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。

1. サンプルの調製

  1. 得られた新鮮な組織サンプルを予冷したPBSで2回すすぎ、血球を除去し、約100 mgの組織を1.5 mLの遠心分離管に分離します。
  2. 組織タンパク質溶解バッファー(150.0 mmol/L NaCl、1.0%NP-40、50.0 mmol/L Tris pH 8.0、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、プロテアーゼ阻害剤カクテル、ホスファターゼ阻害剤カクテル2および3)を含む2 mLの丸底粉砕チューブに組織を入れます。
  3. 高速組織分散機の速度をレベル5(6レベルのう....

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結果

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対照群および疾患群からのヒトサンプルの予備的なリン酸化プロファイリングにより、Nur77が異なるリン酸化タンパク質の候補として同定されました。Nur77タンパク質のリン酸化検出におけるPhosタグSDS-PAGEの有効性を評価するために、Mn2+-PhosタグSDS-PAGE実験を実施しました。組織サンプルから全タンパク質を抽出した後、30 μgのタンパク質をロードし、Mn2+-Phosタグゲル電気泳動で分離し、続いてPVDFメンブレンに転写しました。免疫ブロッティングは、Nur77一次抗体とそれに続くHRP結合抗ウサギ二次抗体を使用し、ECL化学発光によって検出されました。2つの異なるバンドが観察されました(図1A)。より速く移動するバンド(下)は、非リン酸化Nur77を表します。移動の遅いバンド(上)はリン酸化Nur77を表します。半定量分析では、対照と比較して不妊群でリン酸化Nur77対非リン酸化Nur77の比率が有意に低下していることが示され(図1B)、疾患状態でのN.......

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ディスカッション

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臨床組織における標的タンパク質のリン酸化変化を検出するための Phos-tag ベースのアプローチは、タンパク質リン酸化研究に大きな利点をもたらします。リン酸化タンパク質は、Phosタグ結合により電気泳動移動度が低下し、リン酸化特異的抗体を必要とせずに候補タンパク質のリン酸化状態をハイスループットでスクリーニングできます。これは、複数の候補タンパク質の初期の大規模なプロファイリングに特に価値があります。リン酸化修飾が変化したタンパク質は、その後の in vitro キナーゼアッセイで優先順位を付けて、特定のリン酸化部位を同定することができます。

Phos-tag SDS-PAGEのサンプル前処理は、従来のウェスタンブロッティングと類似点がありますが、いくつかの重要な技術的考慮事項に注意する必要があります。EDTAはPhosタグ機能に不可欠なMn2+またはZn2+イオンをキレート化するため、サンプル処理中はEDTA含有試薬を避ける必要があります。ただし、電.......

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開示事項

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著者らは、潜在的な利益相反はないと宣言している。

謝辞

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この研究は、中国国家自然科学基金(82271698)と江蘇省自然科学基金(BK20231117)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10% SDS ソリューションSangon BiotechB548118
10x Tris/Glycine/SDSBIO-RAD
4× Laemmliタンパク質サンプルバッファーBIO-RAD1610747
アクリルアミドSangon BiotechA601032
過硫酸アンモニウムSangon BiotechA100486
抗 FLAG M2 アフィニティーゲルMilliporeA2220
強化化学発光キットThermoFisher32106
FLAG 抗体CST14793
フラグ ペプチドミリポアF3290
HRP 標識型二次抗体Bioworld テクノロジーBS13278
リポフェクタミン 3000ThermoFisherL3000015
ミニトランスブロット細胞BIO-RAD1703930
Mini-PROTEAN Tetra 垂直電気泳動セルBIO-RAD1658005
Mst1 抗体CST3682
N、N'-メチレン-ビスアクリルアミドSangon BiotechA600025
N、N、N'、N'-テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)Sangon BiotechA610508
Nur77 抗体CST3960
ホスファターゼ阻害剤カクテル 2シグマP5726チロシンタンパク質ホスファターゼ、酸およびアルカリホスファターゼホスファターゼ
害剤カクテルグマP0044ターゼ2A、アルカリホスファターゼ、プロテインホスファターゼ1および2Aの阻害用
スホセリン抗体グマP5747
スホスレオニン抗体グマP6623
スタグアクリルアミドWako304-93526ホスタグ調製用SDS PAGE ゲル
Pierce BCA タンパク質アッセイ キットThermo 23227
プロテアーゼ阻害剤カクテルシグマS8830EDTA フリー、錠剤、セリン、システイン、アスパラギン酸、メタロプロテアーゼ
PVDF メンブレンRoche3010040001
ThermoMixerEppendorf2231001127
ティッシュディスパーサーIKAT 10 組織ホモジネートを得るには
Tris-HCl バッファー (0.5M、pH 6.8)Sangon BiotechB546020
Tris-HCl バッファー (1.5M、pH 8.8)Sangon BiotechB546019
真空デシケーターThermoFisher5311-0250ゲル溶液を脱気するには
-メルカプトエタノールSigmaM3148
1610732 阻3シプロテインホスファホシホシホの阻害用。

参考文献

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  1. Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. The protein kinase complement of the human genome. Science (New York, N.Y.). 298 (5600), 1912-1934 (2002).
  2. Lim, S., et al. Regulation of mitochondrial functions by protein phosphorylation ....

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