Method Article

出芽酵母における細胞周期依存過程の操作と解析

DOI:

10.3791/68887

⸱

September 26th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、酵母細胞周期停止とオプションの放出の2つの方法を詳述し、 S. cerevisiaeの細胞周期依存性プロセスを研究するための蛍光顕微鏡の使用について詳しく説明します。

Abstract

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真核細胞は、DNA 維持や細胞小器官の恒常性など、さまざまなプロセスを調節する保存された細胞周期に従います。実験結果を適切に解釈するには、細胞周期依存的な方法で細胞プロセスを研究する必要があります。脊椎動物モデルを含む幅広い生物の培養細胞で細胞周期の同期を生み出すために利用できる化学的および遺伝的方法があり、細胞周期依存プロセスの研究を可能にします。しかし、モデル生物の中では、出芽酵母は、その特に堅牢な同期方法、短い生成時間、および遺伝的扱いのしやすさにより、依然として細胞周期解析の原動力となっています。酵母は他の真核生物とコア細胞周期機構を共有しており、細胞周期調節における画期的な発見を可能にしました。このプロトコルは、株の構築、培養準備、顕微鏡検査など、G1停止放出および有糸分裂停止放出実験に焦点を当てて、酵母の細胞周期分析の方法を詳述します。細胞周期停止と蛍光顕微鏡に適した株を産生するためのPCRタグ付け方法が提示されます。G1停止はペプチドフェロモンα因子を使用して達成され、短時間の洗浄により同期放出と細胞周期の進行がもたらされます。サンプルは、細胞周期への放出後のさまざまな時点で採取され、顕微鏡検査のために固定されます。2番目の方法は、細胞周期調節因子Cdc20を枯渇させて中期停止集団を達成することにより、酵母細胞を有糸分裂で停止させ、オプションで後期への放出を実現します。サンプルは固定され、放出前および放出後のイメージング用に準備され、イメージングおよび分析されます。画像解析は、細胞周期におけるタンパク質の動的局在化と集団存在量の変化をカタログ化することに重点を置いています。これらの同期方法は、多様な細胞周期操作に適しており、ここでは固定細胞のイメージングでの使用を強調していますが、生細胞イメージングや生化学的および分子的アッセイなど、他の多くの分析にも適応できます。

Introduction

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真核生物の細胞分裂は、細胞周期と呼ばれるプログラムを通じて高度に制御されています。細胞周期で発生する高度に保存された動的プロセスは、それ自体を研究することに興味深いものにしますが、他の細胞生物学的プロセスの研究に情報を提供する広範な意味も持っています-たとえば、多くの細胞小器官は細胞分裂中に劇的なリモデリングを受け、多くのタンパク質の存在量と局在は1,2,3全体で高度に調節されています.酵母と比較して後生動物系には、より多様な調節キナーゼやタンパク質、および後生動物の外部シグナル伝達からの追加の入力など、いくつかの追加の複雑さの層が存在しますが、細胞分裂は全体的にすべての真核生物で非常に高度に保存されています4,5。細胞周期の進行と重要な調節ステップに関する重要な洞察を確立する多くの基本的な研究が酵母で行われ、多くの理由から細胞周期関連の質問を研究するための非常に魅力的な生物であり続けています6,7。これらの中で最も重要なのは、細胞周期を操作するた....

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Protocol

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1. 細胞周期解析・イメージングのための菌株の構築

  1. プリングルタグ付けプラスミド(pFA6aプラスミド)24を使用して、目的の遺伝子をC末端にタグ付けするためのプライマーを設計します。つまり、pFA6aシリーズプラスミドと併用すると、酵母に直接形質転換して目的の遺伝子の「タグ付き」バージョンを生成できるPCR産物を生成できるF2およびR1プライマーを設計します。 表1 に含まれるプライマーペアとプラスミドを使用して、このプロトコルで目的の遺伝子にタグを付けます。酵母遺伝子のC末端タグ付けのためのプラスミドおよびプライマー設計戦略は、Longtine et al.24によって詳細に説明されています。
    注:この方法は、イメージング用の蛍光タグ付きタンパク質、または細胞周期停止および標的タンパク質の分解によって可能になるその他の実験を促進するためのオーキシン誘導性デグロン(AID)タグ付きタンパク質の生成に使用できます18。例えば、CDC20にAID(IAA7)タグを付けるために、フォワードタグ付けプライマーは、STOPコドン(5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
    CAGCCAATATTTGATCAGG 3'....

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Results

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蛍光顕微鏡による細胞周期依存性タンパク質局在の変化の分析は、ここで説明する方法を使用して容易に達成できます。私たちのグループは、有糸分裂紡錘体の動的調節と機能に長い間関心を持っていました。酵母では、紡錘体極体(成分Spc110でマークされる)は、微小管フィラメントが発出して有糸分裂紡錘体30の構造を作成する微小管組織化中心として機能します。微小管結合タンパク質Stu2は、微小管を重合させることにより紡錘体形成に役割を果たします31。Stu2はまた、動原体、紡錘体極体、微小管プラス末端など、多くの細胞位置で異なる役割を果たしており、細胞周期全体の局在の変化がこれらの機能を促進します32,33,34,35

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Discussion

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出芽酵母の細胞周期同期を利用することで、さまざまな細胞プロセスの重要なメカニズムを研究することができます。α因子治療によるG1停止放出の使用は、細胞周期の段階を通じて細胞集団の同期進行を可能にし、示したように、Stu236のような細胞調節因子の動的な局在化パターンを明らかにすることができます。細胞周期の停止は、中期の細胞を停止するために使用されるCdc20などの細胞周期調節因子の枯渇 を介して 、遺伝的手段を使用して達成することもできます。これにより、紡錘体張力がない場合の動原胞へのBub1動員などの有糸分裂特異的プロセスの評価が可能になります37。

出芽酵母に細胞周期停止を引き起こす他の多くの遺伝的手段があります。cdc34の温度感受性変異体(ユビキチンリガーゼSCF複合体の成分)は、G1/S遷移に必要な細胞周期調節因子のプロテオソームを介したタンパク質分解をブロックすることにより、.......

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Disclosures

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

Acknowledgements

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デルタビジョン顕微鏡施設の維持管理に感謝します。この研究は、NIH助成金F31CA2717405(MGSへの)とT32GM141848(MGSおよびTCS)、5 For the Fight(MPM)、Pew Biomedical Scholars(MPM)、およびNIH助成金R35GM142749(MPMへの)によって部分的に支援されました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
。-因子ユタ大学コア合成施設シーケンス: WHWLQLKPGQPMY
1.5 mL エッペンドルフ管アクシゲンMCT-175-C
10mM dNTPミックスサーモ・サイエンティフィックR0193
50 mL円錐形チューブグライナー・バイオ・ワン227 261
5倍のPhusion HF反応バッファーニューイングランド・バイオラボB0518S
酢酸、氷河期フィッシャー・ケミカルBP2401C-212
アデニン・ヘミ硫酸塩シグマ・オルドリッチA9126-100G
寒天、顆粒状Apex Chemicals and Reagents20-275
アガロースエイペックス・バイオリサーチ・プロダクツ20-102GP
オートクレーブ Amsco センチュリー蒸気滅菌器ステリスSV-1262
オートクレーブ処理されたDI水
オーキシンシグマ・オルドリッチCat#I3750-5G-A;CAS: 87-51-4
カーギルレーザーリキッドカーギル研究所20130
D-ソルビトールシグマ・オルドリッチS1876-500G
DAPI(40 、6-ジアミジノ-2-フェニルリンドール、ジヒドロ塩)分子プローブCat#D1306
サーモン精巣からのデオキシリボ核酸ナトリウム塩シグマ・オルドリッチD1626
葡萄糖フィッシャー・ケミカルD16-10
ジナトリウムエチレンジアミン・テトラアセテートフィッシャー・ケミカルS811-10
DMSOサーモ・サイエンティフィック20688
FIJI/ImageJ2 と 2.14.0/1.54f の比較イメージJ2https://imagej.net/software/fiji/
固定速度渦ミキサーVWRhttps://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2
蛍光顕微鏡 DV Ultraライカhttps://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwEシリアル#:NV01063。サポート終了
ホルムアルデヒドフィッシャー・ケミカルカテゴリー#F79-500
ゲル装置サーモ・サイエンティフィックオウル・イージーキャスト B1
GeneRuler DNAラダーミックス発酵SM0333
ガラスビーズフィッシャー・サイエンティフィック11312A
ガラススライドVWR48300-026
イノバ2300プラットフォームシェイカーニューブランズウィックNB-2300
キムワイプズキムテック06-666
1.5 mLチューブ用の実験室遠心分離機エッペンドルフ2525
50 mLチューブ用の実験室遠心分離機エッペンドルフ5804
酢酸リチウム二水和物シグマ・オルドリッチL4158-250G
マスターサイクラーネクサスX2エッペンドルフhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586
マイクロピペットp2、p20、p200、p1000および対応するチップレイニンL-2XLS+R、L-20XLS-R、L-200XLS-R、L-1000XLS-R
顕微鏡カバーガラスフィッシャー・サイエンティフィック12541014
ノコダゾールカルバイオケム猫#487928;CAS: 31430-18-9;ロット#B35705
オレンジGシグマ・オルドリッチO7252
ペッグハンプトン・リサーチHR2-591
ペプトン顆粒化 フィッシャー・バイオリエージェントBP9725-5
フュージョンHF DNAポリメラーゼニューイングランド・バイオラボM0530L
ピペトXレイニンPX-100R
リン酸カリウム、二塩基サーモ・サイエンティフィック424195000
リン酸カリウム、単塩基サーモ・サイエンティフィック424200025
電源バイオ・ラッド23786
開始 取得 Ultra 1.2.2softWoRx CytivaDVウルトラで取得
トリス・ベースフィッシャー・バイオリエージェントBP152-10
トライトン X-100シグマ・オルドリッチ9002-93-1
チューブローテーターVWR10136-084
水浴VWRWBE10A11B
水、超純粋エイペックス・バイオリサーチ・プロダクツ18-194
粒状酵母抽出物フィッシャー・バイオリエージェントBP9727-5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carlton, J. G., Jones, H., Eggert, U. S. Membrane and organelle dynamics during cell division. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (3), 151-166 (2020).
  2. Cai, Y., et al. Experimental and computational framework for a dynamic protein atlas of human cell division. Nat....

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