Method Article

出芽酵母における細胞周期依存過程の操作と解析

DOI:

10.3791/68887

⸱

September 26th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、酵母細胞周期停止とオプションの放出の2つの方法を詳述し、 S. cerevisiaeの細胞周期依存性プロセスを研究するための蛍光顕微鏡の使用について詳しく説明します。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

真核細胞は、DNA 維持や細胞小器官の恒常性など、さまざまなプロセスを調節する保存された細胞周期に従います。実験結果を適切に解釈するには、細胞周期依存的な方法で細胞プロセスを研究する必要があります。脊椎動物モデルを含む幅広い生物の培養細胞で細胞周期の同期を生み出すために利用できる化学的および遺伝的方法があり、細胞周期依存プロセスの研究を可能にします。しかし、モデル生物の中では、出芽酵母は、その特に堅牢な同期方法、短い生成時間、および遺伝的扱いのしやすさにより、依然として細胞周期解析の原動力となっています。酵母は他の真核生物とコア細胞周期機構を共有しており、細胞周期調節における画期的な発見を可能にしました。このプロトコルは、株の構築、培養準備、顕微鏡検査など、G1停止放出および有糸分裂停止放出実験に焦点を当てて、酵母の細胞周期分析の方法を詳述します。細胞周期停止と蛍光顕微鏡に適した株を産生するためのPCRタグ付け方法が提示されます。G1停止はペプチドフェロモンα因子を使用して達成され、短時間の洗浄により同期放出と細胞周期の進行がもたらされます。サンプルは、細胞周期への放出後のさまざまな時点で採取され、顕微鏡検査のために固定されます。2番目の方法は、細胞周期調節因子Cdc20を枯渇させて中期停止集団を達成することにより、酵母細胞を有糸分裂で停止させ、オプションで後期への放出を実現します。サンプルは固定され、放出前および放出後のイメージング用に準備され、イメージングおよび分析されます。画像解析は、細胞周期におけるタンパク質の動的局在化と集団存在量の変化をカタログ化することに重点を置いています。これらの同期方法は、多様な細胞周期操作に適しており、ここでは固定細胞のイメージングでの使用を強調していますが、生細胞イメージングや生化学的および分子的アッセイなど、他の多くの分析にも適応できます。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

真核生物の細胞分裂は、細胞周期と呼ばれるプログラムを通じて高度に制御されています。細胞周期で発生する高度に保存された動的プロセスは、それ自体を研究することに興味深いものにしますが、他の細胞生物学的プロセスの研究に情報を提供する広範な意味も持っています-たとえば、多くの細胞小器官は細胞分裂中に劇的なリモデリングを受け、多くのタンパク質の存在量と局在は1,2,3全体で高度に調節されています.酵母と比較して後生動物系には、より多様な調節キナーゼやタンパク質、および後生動物の外部シグナル伝達からの追加の入力など、いくつかの追加の複雑さの層が存在しますが、細胞分裂は全体的にすべての真核生物で非常に高度に保存されています4,5。細胞周期の進行と重要な調節ステップに関する重要な洞察を確立する多くの基本的な研究が酵母で行われ、多くの理由から細胞周期関連の質問を研究するための非常に魅力的な生物であり続けています6,7。これらの中で最も重要なのは、細胞周期を操作するために利用できる幅広い方法であり、さまざまな段階での停止と細胞の同期を可能にします。その他の利点としては、酵母の細胞周期が短い(温度や培地条件に応じて~90〜150分)、遺伝子操作の容易さ、野生型での研究を可能にする幅広い条件付き対立遺伝子などがあります。

細胞周期のさまざまな段階を経ての進行は、ユビキタスなサイクリン依存性キナーゼ (Cdk)、ポロ様キナーゼ、オーロラキナーゼなど、いくつかの重要なキナーゼの活性によって促進されます。細胞周期チェックポイントは、細胞周期全体の進行を調節し、特定の条件が満たされない限り、細胞が分裂の次の段階に進まないようにします8,9。これらのチェックポイントとそれらが調節する遷移は、研究者によってハイジャックされて長期停止、または一過性の停止と解放を達成して細胞集団を同期させることができます(図1)。例えば、細胞周期コミットメントチェックポイント(制限点または酵母の開始)は、DNA複製を開始する前に細胞が分裂にコミットするのに十分な栄養素を持っていることを保証します10。このチェックポイントは、細胞周期と相互作用する酵母交配プログラムを利用して、一倍体酵母で操作してG1停止を達成することができます。パン酵母(Saccharomyces cerevisiae)では、一倍体細胞は、交配型遺伝子座によって遺伝的に決定されるMATaまたはMATαの2つの交配タイプのいずれかを持っています。一方の交配タイプの酵母は、もう一方の交配タイプの交配フェロモンに感受性があり、最終的にCdk阻害剤Far1をリン酸化して安定化するMAPキナーゼシグナル伝達カスケードを活性化することによって応答し、Cln1 / 2-Cdk複合体に結合してその活性をブロックすることにより細胞周期の侵入を防ぎます11,12,13。交尾フェロモンに応答する細胞は、交尾突起またはシュムーの存在によって視覚的に決定できます(図1)。したがって、化学的に合成されたα因子をMATa細胞の培養物に添加して、G1停止を達成することができる。研究者が酵母細胞を同期させるためにターゲットにできるもう一つの細胞周期移行は、中期から後期への移行です。有糸分裂中、紡錘体アセンブリチェックポイント(SAC)は微小管への動原産体の付着を監視し、未結合の動原胞体が検出されたときに、その活性化因子であるCdc20を隔離することにより、後期促進複合体/シクロソーム(APC / C)を阻害します。APC/Cは、後期への進入に不可欠なE3リガーゼ複合体です。SACが満たされると、Cdc20はAPC / Cに結合し、APC / Cはいくつかのタンパク質、主にセキュリンとサイクリンBをユビキチン化し、分解を標的とし、染色体分離と有糸分裂の出口を促進します14,15。Cdc20自体はSACの成分ではありませんが、その阻害はSAC活性化の標的です。したがって、Cdc20の誘導性枯渇を利用して、中期の酵母培養を阻止することができます(図1)16。

このプロトコルは、酵母細胞周期操作の2つの方法、および各方法の適用例を網羅しています。最初の方法では、α因子を使用してG1の細胞を停止させ、続いて洗浄ステップを使用して細胞を停止から解放し、同期的な細胞周期の再突入をもたらします。同期された細胞は細胞周期全体を通じて継続されるため、研究者は各細胞周期段階の細胞を追跡および研究できます。この方法では、目的のGFPタグ付きタンパク質Stu2の動的局在が全体を通して監視され、有糸分裂紡錘体との関連が追跡されます。この方法は、タグ付き紡錘体(SPB)コンポーネントであるSpc110-mCherryも活用しており、有糸分裂紡錘体長の測定を可能にし、細胞周期進行の優れたプロキシです17。この方法は、細胞周期の停止と放出によって細胞集団の同期がどのように可能になり、細胞周期全体を通じてタンパク質またはその他の目的成分の研究が容易になるかを示しています。

2番目の方法では、オーキシン誘導性デグロン(AID)システム18を使用してCdc20の枯渇によって有糸分裂停止が達成される。TIR1 (植物由来の F ボックスタンパク質) を発現する細胞では、AID タグを持つタンパク質は、オーキシンを添加するとユビキチン化され、分解されます。ここでは、AIDタグ付きCdc20を使用して、Cdc20の誘導性分解を可能にし、それによって中期に停止させます。次に、この細胞集団は、タグ付き動原体タンパク質Mtw1-mCherryを基準マーカーとして使用して、タグ付きSAC成分Bub1-GFPの動原体への動員について監視されます。Bub1は動原体でSAC非依存的な役割を果たし、初期有糸分裂で動原体に局在しますが、停止した細胞におけるその持続的な動原体局在は、不適切な動原体-微小管の付着を知らせます19。これを、動原体と微小管の付着を破壊する微小管毒であるノコダゾールで細胞を処理することによって示しました。この実験は、高度に調整可能な停止方法を使用して、異なる細胞周期段階に特異的なプロセスを研究する方法を強調しています。さらに、オーキシンがcdc20-AID培養物から洗い流され、後期への放出と新しい細胞周期への参入を可能にすることを実証しますが、私たちの経験では、これらの培養物はα因子停止放出ほど同期して放出されません。これら2つの逮捕放出方法は、どちらも効果的であり、実装が容易であるが、異なる細胞周期段階20、21、22、23で細胞を停止するために、酵母の研究者が利用できる他の多くの方法がある。これらの方法の詳細については、ディスカッションを参照してください。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 細胞周期解析・イメージングのための菌株の構築

  1. プリングルタグ付けプラスミド(pFA6aプラスミド)24を使用して、目的の遺伝子をC末端にタグ付けするためのプライマーを設計します。つまり、pFA6aシリーズプラスミドと併用すると、酵母に直接形質転換して目的の遺伝子の「タグ付き」バージョンを生成できるPCR産物を生成できるF2およびR1プライマーを設計します。 表1 に含まれるプライマーペアとプラスミドを使用して、このプロトコルで目的の遺伝子にタグを付けます。酵母遺伝子のC末端タグ付けのためのプラスミドおよびプライマー設計戦略は、Longtine et al.24によって詳細に説明されています。
    注:この方法は、イメージング用の蛍光タグ付きタンパク質、または細胞周期停止および標的タンパク質の分解によって可能になるその他の実験を促進するためのオーキシン誘導性デグロン(AID)タグ付きタンパク質の生成に使用できます18。例えば、CDC20にAID(IAA7)タグを付けるために、フォワードタグ付けプライマーは、STOPコドン(5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
    CAGCCAATATTTGATCAGG 3')、およびプリングルプラスミドF2アダプター配列(5'cggatccccgggttaattaa 3')を3'末端に追加して最終プライマー配列(5'TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
    CAGCCAATATTTGATCAGG cggatccccgggttaattaa 3')。逆CDC20タギングプライマーは、STOPコドンの直後に25〜40塩基対の逆補体を含みます(5' ATTATATGCCTTGACATGAA
    CTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTA 3')およびプリングルプラスミドR1アダプター配列(5'gaattcgagctcgtttaaac 3')を生成して、最終プライマー配列(5' ATTATATGCCTTGACATGAACTTTTATT
    TTTTTTATTTTA gaattcgagctcgtttaaac 3')。また、40塩基対より短いPCRプライマーを使用すると、酵母ゲノムへの組み込み効率が低下することに注意することも重要です。
  2. 分子生物学グレードの水でプライマーを10μMに希釈します。
  3. 表2に含まれるサーマルサイクラープログラムに従って、標準的な方法を使用してF2およびR1プラスミドペアと適切なタグ付けプラスミドを使用してPCRを実行し、アガロースゲル電気泳動によってPCR産物のサイズを確認します。
  4. 酵母株を接種して、25 mLの酵母抽出物ペプトンアデニンデキストロース(YPAD)培養物に形質転換し、23°Cで一晩増殖させます。 cdc20-AID 酵母(オーキシンで処理するとCdc20を分解する)を構築するために、形質転換された株は、異所性遺伝子座から発現する OsTIR1 をすでに含んでいるか、または OsTIR1 が後期18で交配する可能性があります。
  5. 翌朝、オーバーナイト培養のOD600を確認します。培養ODが2.0<の場合は、手順1.6に進みます。OD>2.0の場合は、~0.2〜0.4に希釈し、2〜3サイクルの成長を可能にします。
  6. OD600 = ~0.4-2.0で細胞を採取し、対数成長期にあることを確認します。形質転換ごとに5 ODの細胞を採取します(例:5 mLのOD600 = 1.0)。同じ株を複数形質転換する場合、この段階で細胞を結合することができます。23°Cで3,000 x g で5分間遠心分離して細胞を回収します。
  7. 上清を廃棄し、細胞ペレットを25 mLの水で洗浄し、続いて3,000 x g で23°Cで5分間遠心分離します。
  8. 上清を廃棄し、細胞を1 mLの0.1 M酢酸リチウム(LiAc)に再懸濁し、1.6 mLチューブに移します。複数の形質転換を行う場合は、1 mLの再懸濁液を複数のチューブに分割します(たとえば、2回の形質転換では2x 500 μLを分割し、3回の形質転換の場合は3x 333 μLを分割します)。
  9. 細胞を1,000 x g で23°Cで2分間遠心分離し、上清を廃棄します。
  10. 細胞ペレットに以下を加えます(この順序で):i)240 μLのPEG(50%)、ii)36 μLの1.0 M LiAc、iii)20 μL = 50 μgのサケ精子DNAを5分間予沸騰させ、iv)54 μLの水。
  11. 10 μLのPCR産物(ステップ1.3で得られた)を細胞に加え、1分間ボルテックスし、すべてがよく混合されていることを確認します。
  12. 細胞を30°Cで30分間、暖かい部屋のローラードラムまたはサーモシェーカーで1000rpmでインキュベートします。
  13. 42°Cの水浴中で15分間熱ショックセル。
    注:最適なヒートショック時間は、酵母株の背景によって異なる場合があります。このプロトコルは、W303 株のバックグラウンドに最適化されています。
  14. 細胞を1,000 x g で23°Cで2分間遠心分離します。 上清を取り除き、100 μLの水に穏やかに再懸濁します。
  15. KanMXまたは他の薬物選択を使用した形質転換の場合は、YPADに細胞をプレートし、プレートを23°Cでインキュベートし、翌日プレートを薬物プレートに複製します。
    注:形質転換細胞における薬剤耐性遺伝子の発現を可能にするためには、YPADで1日の増殖を許可することが重要です。
  16. 栄養栄養要求性マーカー(URA、HISなど)を使用した形質転換の場合は、選択培地に直接細胞をプレートします。
  17. プレートを23°Cで3日間インキュベートし、酵母形質転換コロニーを増殖させます。
  18. ゲノムPCRまたはウェスタンブロッティングによって遺伝子の正しいタグ付けを確認します。これらの方法は、Burnette25 および Chu etal 26 によって詳細に説明されています。
    注:複数のタグ付き対立遺伝子を持つ株を産生する場合、形質転換は変異原性プロセスになる可能性があるため、バッククロスなしで形質転換を繰り返すことは推奨されません。たとえば、Stu2-GFPとSpc110-mCherryを含む株を作製するには、株を別々に形質転換してStu2-GFPとSpc110-mCherryを作製し、酵母交配、胞子形成、四重体解剖、および遺伝子型解析によってこれらの対立遺伝子を1つの一倍体株に結合することをお勧めします。酵母交配に関する詳細情報は、Stansfield and Stark27 および Morin et al.28 から入手できます。α因子停止放出を実行するには、利用される一倍体株が MATa でなければなりません。

2. 酵母培養と細胞周期の同期:α因子停止放出

  1. 酵母を23°Cで一晩25 mLのYPAD培養物に接種し、翌朝OD600 = 0.5-2.0にします。
    1. 朝に細胞がOD600 = 2.0を超える場合は、OD600 = 0.2-0.4に希釈し、少なくとも1細胞周期(23°Cで2〜3時間)成長させます。
  2. 細胞をOD600 = 0.5に希釈し、α因子を最終濃度1 μg/mL(DMSOでストック10 mg/mL)まで添加します。理想的には、細胞には bar1 変異( 例:bar1-1)があり、α因子に対してより敏感になります。 BAR1 野生型細胞はα因子に対する感度が低く、適切に停止するには少なくとも1桁高いα因子の濃度が必要であり、これは経済的ではありません。
  3. 逮捕後2.5〜3.5時間で、出芽していないシュムード細胞の割合を数えて停止の程度を確認します。細胞の90〜95%がシュムー化(G1で停止)されたら、放出に進みます。酵母株、増殖培地、温度によってタイミングが異なります。
  4. 遠心分離機で3,000 x g で23°Cで3〜5分間回転させ、上清を注ぎ出すことにより、細胞をα因子停止から解放します。
  5. ペレットを25 mLのYPAD + 1%DMSOに再懸濁して細胞を洗浄します。
  6. 手順2.4〜2.5を合計3回洗浄で2回繰り返し、最初の洗浄後に使用済みのチューブを1回交換します。
  7. YPADを細胞に加えて最終容量を25mLにし、細胞を新しいフラスコに移します。
    注:新しいフラスコを使用することは、リリースを妨げる可能性のある微量のαファクターを排除するために重要です。
  8. 時点(0分)を採取しますampおよび固定します(手順4.1〜4.4の固定手順を参照)。
  9. 23°Cで成長が起こる場合は、15分ごとに時点サンプルの採取を続けます。 このタイミングは、細胞の成長速度に基づいて、他の温度で変化します。
  10. 60分の時点で、光学顕微鏡で均一な小さな芽(芽のサイズ<母細胞サイズの25%)をチェックして、放出の同期性を判断します。
  11. オプション)放出後60分で、次の細胞周期への進行を防ぐために、α因子を最終濃度1μg/mLに再度添加します。添加前に均一な小芽の形態を検証することにより、同期細胞放出を確認します。
  12. 180分まで、または必要なだけ、時点サンプルの採取を続けます。23°Cでは、中期は放出後~45〜60分で発生し、後期は放出後~60〜90分で発生し、ほとんどの細胞は放出後120分までに新しいG1になります。

3.酵母培養と細胞周期の同期:Cdc20枯渇停止放出

  1. 翌朝、23°Cで酵母の一晩培養を接種して、OD600 = 0.5-2.0にします。
    1. 翌朝、細胞がOD600 = 2.0を超える場合は、OD600 = 0.2〜0.4に希釈し、少なくとも1細胞周期(23°Cで2〜3時間)成長させます。
  2. OD600 = 0.5に希釈し、オーキシンを1 Mストック(500倍)から最終濃度500 μMまですべての培養物に加えます。他の薬物(ノコダゾール)を投与された培養物の場合、適切な濃度(たとえば、~10 μg/mLのノコダゾール)でオーキシンと同時に添加します。
  3. 停止後2時間で、大きな芽の細胞の割合を数えて停止の程度を確認します(大きな芽は、母細胞サイズの25%>芽の存在として決定されます)。細胞の90〜95%が有糸分裂で停止したら、実験用途に応じて、サンプルの収集または停止から細胞を解放します。細胞の90%が停止していない場合は、培養物を増殖させ続け、15〜30分ごとにチェックします。酵母株、増殖培地、温度によってタイミングが異なります。
    注:長時間の停止は細胞の生存率を低下させる可能性があるため、解放する場合、停止を長時間(4時間以上)進行させることはお勧めできません。
  4. Cdc20枯渇停止から解放するには、23°Cで3000 x g で3〜5分間遠心分離して培養物を収穫します。
  5. ペレットを25 mLのYPAD + 1%DMSOに再懸濁し、23°Cで3,000 x g で3〜5分間遠心分離して回収して細胞を洗浄します。
  6. 手順3.4〜3.5を繰り返して、合計2回洗浄します。
  7. YPADを細胞に加えて最終容量を25 mLにし、細胞を新しいフラスコに移します。
    注:新しいフラスコを使用することは、放出を妨げる可能性のある微量のオーキシンを除去するために重要です。
  8. 時点0を取り、修正します(手順4.1〜4.4の固定手順を参照)。
  9. 10〜15分ごとに、希望する時間コースの長さの時間点をとり続けます。23°Cでは、ほとんどの細胞は50〜70分後に停止から解放されます。
    注:細胞は、α因子停止ほど、このCdc20枯渇停止から同期して放出されません。ただし、後期または有糸分裂の終了イベントを研究することは有用です。さらに、この停止放出の技術的な制限は、放出後の後の時点で、まだ放出されていない中期細胞と、より早く放出され、次の細胞周期の中期に達した細胞を区別することがより困難になることです。必要に応じて、生細胞イメージングを実行して、個々の細胞が停止から放出されるときに追跡するか、培養物にα因子を追加して(細胞が MATaであると仮定して)、有糸分裂終了後にG1の細胞を停止させることによって、これを克服できます。

4.酵母固定

  1. 1 mL(または0.5〜1.5 OD)の培養物を23°Cで最高速度(~20,000 x g)で1分間遠心分離します。
  2. 上清を吸引し、細胞を500 μLの固定液(0.1 Mリン酸カリウム(KPi)pH 6.4中の3.7%ホルムアルデヒド)に再懸濁します。
  3. 固定液中で細胞を2〜15分間インキュベートします。
    23°Cです。 時間経過実験では、サンプル採取時に細胞を遠心分離するタイミングを合わせるために、細胞を15分間固定することが一般的に推奨されます。
    注:固定タイミングは、特定の蛍光色素および目的のタンパク質に対して最適化する必要があります。
  4. 細胞を23°Cで最高速度で1分間遠心分離し、上清を吸引し、500 μLの0.1 M KPi(pH 6.4)に再懸濁します。KPiの細胞は、イメージングの準備が整うまで4°Cで保存できます。
    注:固定細胞蛍光シグナルは、蛍光色素にもよりますが、蛍光シグナルの定量化のために、7日以内に画像を収集します。

5. イメージング用のスライドの準備

  1. イメージングの準備が整ったら、細胞を23°Cで最高速度で1分間遠心分離し、上清を廃棄します。細胞を10〜100 μLのTriton / DAPI /ソルビトール溶液(1.2 Mソルビトール、1%トリトン、0.1 M KPi、pH 7.5、2 μg/mL DAPI)に再懸濁します。
  2. ~0.8 μLの細胞をきれいなカバーガラスに直接ピペットで移動させます。ピペットチップを使用して、細胞液滴をカバーガラスの中央にある約1 cm2 の円にそっと広げます。
  3. カバーガラスを顕微鏡スライドに置きます。Kimwipe を使用してスライドの周りを軽く押してサンプルを分散させます。
  4. カバーガラスの端をマニキュアで密封します。
  5. オプションで、イメージング前に冷暗所に最大4〜6時間保管して、細胞の落ち着きを助け、過剰な動きを防ぎます。

6. イメージング

  1. 60x/1.42オイル対物レンズと赤、緑、青、遠赤色レーザー、フィルターセットを備えた顕微鏡にスライドします。より高い倍率の対物レンズ(最大100倍)も使用できます。
  2. カバーガラスに付着した酵母細胞に顕微鏡の焦点を合わせます。
    注:酵母細胞が動きすぎる場合は、スライドを冷暗所に20〜60分間放置して沈殿させることがあります。
  3. 酵母に焦点が合ったら、各チャンネルの露光設定を調整して、少なくとも3:1の信号対雑音比を生成し、蛍光点が露出しすぎないようにします。
    注:たとえば、科学用CMOSカメラで使用するイメージングシステムでは、60x 550対物レンズと屈折率がn = 1.516の浸漬油を使用して、赤色チャンネルの最大信号を1000-2000 au、緑色チャンネルを3000 au、青色チャンネルを3000 au、DICチャンネルを4000-5000 auに設定すると、高品質の画像が生成されます。
  4. 取得設定を調整して、14-20個の0.2 μmZスタックを合計2-4 μmに広げます。
  5. 後処理モジュールを備えた顕微鏡の場合は、スタックごとに デコンボリューション と クイックプロジェクション を選択します。
  6. 細胞のZスタックを収集し、条件または時点ごとに~100〜200個の細胞をキャプチャするのに十分な画像を撮影します。
  7. イメージングソフトウェアのスクリーンショットを含むソフトウェア手順については、 補足ファイル1 を参照してください。

7. 画像解析

  1. ImageJで投影された画像を開き、明るさとコントラストを調整して、さまざまなチャンネルを表示します。イメージングに使用する顕微鏡に後処理モジュールがない場合は、この段階でZスタックの最大投影を実行します。
  2. 細胞周期の進行を判断するには、時点ごとに100個の細胞を数え、1つまたは2つの核を含むものとして分類します。または、スピンドルの長さまたはスピンドル極体間の距離を計算して、細胞周期の状態を定義します。Spc110病巣<1.5μmの距離は中期細胞に対応し、1.5μm>距離は後期細胞に対応します。
  3. タンパク質涙点の強度(Stu2-GFPなど)を計算するには、 フリーハンド選択ツール を使用して、目的のシグナルの境界の周りを描画します。この信号をROI(関心領域)マネージャーに追加するには、 T を押すか、 メニューを使用します。 ROI マネージャー で [測定] を選択して、選択した各パンクタの強度を計算します。時間の経過に伴う涙点信号の変化を表示するには、各時点の折れ線グラフに 95% 信頼区間で平均強度をプロットします。
  4. Bub1-GFP点を持つ細胞の割合を計算するには、緑色チャンネルの最小輝度と最大輝度の設定が異なる画像で同じであることを確認してください。Mtw1-mCherry涙点との重複を示すBub1-GFP涙点を持つ細胞は、動原体に局在したBub1としてカウントされます。それ以外の場合、セルは負としてカウントされます。条件ごとに~100個のセルをカウントします。Aravamudhan et al.29 には、動原体へのBub1局在化に関する詳細情報が含まれています。
  5. 大きな芽の単核細胞の割合を計算するには、集団内の大きな芽と1つの核(1つのDAPIシグナル)を持つ細胞の数を数え、細胞の総数で割ります。
  6. イメージングソフトウェアのスクリーンショットを含むソフトウェアの手順については、 補足ファイル1 を参照してください。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

蛍光顕微鏡による細胞周期依存性タンパク質局在の変化の分析は、ここで説明する方法を使用して容易に達成できます。私たちのグループは、有糸分裂紡錘体の動的調節と機能に長い間関心を持っていました。酵母では、紡錘体極体(成分Spc110でマークされる)は、微小管フィラメントが発出して有糸分裂紡錘体30の構造を作成する微小管組織化中心として機能します。微小管結合タンパク質Stu2は、微小管を重合させることにより紡錘体形成に役割を果たします31。Stu2はまた、動原体、紡錘体極体、微小管プラス末端など、多くの細胞位置で異なる役割を果たしており、細胞周期全体の局在の変化がこれらの機能を促進します32,33,34,35

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

出芽酵母の細胞周期同期を利用することで、さまざまな細胞プロセスの重要なメカニズムを研究することができます。α因子治療によるG1停止放出の使用は、細胞周期の段階を通じて細胞集団の同期進行を可能にし、示したように、Stu236のような細胞調節因子の動的な局在化パターンを明らかにすることができます。細胞周期の停止は、中期の細胞を停止するために使用されるCdc20などの細胞周期調節因子の枯渇 を介して 、遺伝的手段を使用して達成することもできます。これにより、紡錘体張力がない場合の動原胞へのBub1動員などの有糸分裂特異的プロセスの評価が可能になります37。

出芽酵母に細胞周期停止を引き起こす他の多くの遺伝的手段があります。cdc34の温度感受性変異体(ユビキチンリガーゼSCF複合体の成分)は、G1/S遷移に必要な細胞周期調節因子のプロテオソームを介したタンパク質分解をブロックすることにより、...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

デルタビジョン顕微鏡施設の維持管理に感謝します。この研究は、NIH助成金F31CA2717405(MGSへの)とT32GM141848(MGSおよびTCS)、5 For the Fight(MPM)、Pew Biomedical Scholars(MPM)、およびNIH助成金R35GM142749(MPMへの)によって部分的に支援されました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
。-因子ユタ大学コア合成施設シーケンス: WHWLQLKPGQPMY
1.5 mL エッペンドルフ管アクシゲンMCT-175-C
10mM dNTPミックスサーモ・サイエンティフィックR0193
50 mL円錐形チューブグライナー・バイオ・ワン227 261
5倍のPhusion HF反応バッファーニューイングランド・バイオラボB0518S
酢酸、氷河期フィッシャー・ケミカルBP2401C-212
アデニン・ヘミ硫酸塩シグマ・オルドリッチA9126-100G
寒天、顆粒状Apex Chemicals and Reagents20-275
アガロースエイペックス・バイオリサーチ・プロダクツ20-102GP
オートクレーブ Amsco センチュリー蒸気滅菌器ステリスSV-1262
オートクレーブ処理されたDI水
オーキシンシグマ・オルドリッチCat#I3750-5G-A;CAS: 87-51-4
カーギルレーザーリキッドカーギル研究所20130
D-ソルビトールシグマ・オルドリッチS1876-500G
DAPI(40 、6-ジアミジノ-2-フェニルリンドール、ジヒドロ塩)分子プローブCat#D1306
サーモン精巣からのデオキシリボ核酸ナトリウム塩シグマ・オルドリッチD1626
葡萄糖フィッシャー・ケミカルD16-10
ジナトリウムエチレンジアミン・テトラアセテートフィッシャー・ケミカルS811-10
DMSOサーモ・サイエンティフィック20688
FIJI/ImageJ2 と 2.14.0/1.54f の比較イメージJ2https://imagej.net/software/fiji/
固定速度渦ミキサーVWRhttps://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2
蛍光顕微鏡 DV Ultraライカhttps://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwEシリアル#:NV01063。サポート終了
ホルムアルデヒドフィッシャー・ケミカルカテゴリー#F79-500
ゲル装置サーモ・サイエンティフィックオウル・イージーキャスト B1
GeneRuler DNAラダーミックス発酵SM0333
ガラスビーズフィッシャー・サイエンティフィック11312A
ガラススライドVWR48300-026
イノバ2300プラットフォームシェイカーニューブランズウィックNB-2300
キムワイプズキムテック06-666
1.5 mLチューブ用の実験室遠心分離機エッペンドルフ2525
50 mLチューブ用の実験室遠心分離機エッペンドルフ5804
酢酸リチウム二水和物シグマ・オルドリッチL4158-250G
マスターサイクラーネクサスX2エッペンドルフhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586
マイクロピペットp2、p20、p200、p1000および対応するチップレイニンL-2XLS+R、L-20XLS-R、L-200XLS-R、L-1000XLS-R
顕微鏡カバーガラスフィッシャー・サイエンティフィック12541014
ノコダゾールカルバイオケム猫#487928;CAS: 31430-18-9;ロット#B35705
オレンジGシグマ・オルドリッチO7252
ペッグハンプトン・リサーチHR2-591
ペプトン顆粒化 フィッシャー・バイオリエージェントBP9725-5
フュージョンHF DNAポリメラーゼニューイングランド・バイオラボM0530L
ピペトXレイニンPX-100R
リン酸カリウム、二塩基サーモ・サイエンティフィック424195000
リン酸カリウム、単塩基サーモ・サイエンティフィック424200025
電源バイオ・ラッド23786
開始 取得 Ultra 1.2.2softWoRx CytivaDVウルトラで取得
トリス・ベースフィッシャー・バイオリエージェントBP152-10
トライトン X-100シグマ・オルドリッチ9002-93-1
チューブローテーターVWR10136-084
水浴VWRWBE10A11B
水、超純粋エイペックス・バイオリサーチ・プロダクツ18-194
粒状酵母抽出物フィッシャー・バイオリエージェントBP9727-5

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