2層マイクロ流体デバイスを用いた組織恒常性の電気機械制御の解明

サマリー

ここでは、上皮組織恒常性の電気機械的調節を研究するために、独自の2層マイクロ流体デバイスを製造するためのプロトコルを提示します。この装置は、組織面に垂直な静的な生理学的電流を印加し、細胞間の接着、増殖、および押し出しに影響を与えます。生細胞イメージングと機械的ストレス測定により、これらのプロセスのメカニズムが明らかになります。

要約

細胞の挙動と細胞の運命は、内因性または外部から印加された電流または磁場の影響を受けます。静電気信号は、カスタマイズされたマイクロ流体デバイスに適用して、発達、創傷治癒、恒常性などのゆっくりとした生理学的プロセスにおける電気環境を模倣できます。細胞電気研究の重要なクラスは、~0.1-1000 A / m²の電流密度で、巻線電流を模倣する単純なマイクロ流体チャネル内の静的面内ガルバニック電流による細胞移動の制御です。ただし、互換性のない形状のため、これらのデバイスは、細胞が根尖基底極性と経上皮電位差 (TEPD) を採用する組織恒常性における電気効果の研究には適していません。ここでは、コンフルエント上皮細胞層の平面に垂直な生理学的イオン電流を印加してTEPDを乱し、組織定常状態の電気的調節を調査する独自のマイクロ流体ベースのデバイスについて詳しく説明します。このセットアップは、選択した細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされた柔らかいポリアクリルアミドゲル基質を埋め込んだ2層のUV硬化性ポリマーから作られています。このマイクロ流体デバイスは、センチメトリックスケールの細胞層全体に比較的均一なイオン電流を誘導するために、正しい形状と透過性基板を提供します。このセットアップは、共焦点生細胞イメージングおよび牽引力顕微鏡と互換性があり、経上皮電流によって誘発される機械的ストレスを推測します。驚くべきことに、細胞の増殖、押し出し、および遊走は、イオン電流の方向に応じてコンフルエント上皮内で集合的に影響を受け、さまざまな細胞間相互作用の強さ、細胞イベント(死と増殖)、および組織構造を特徴とする新しい組織状態を誘発します。電気的に制御された細胞の挙動は、電気的に誘発された機械的ストレスと細胞応答として理解できます。この新しいマイクロ流体デバイスとプロトコルは、メカノバイオロジーおよび生物工学コミュニティが組織恒常性における電気的効果を研究し、新しい組織工学アプリケーションを開発するために必要なツールとドキュメントを提供します。

概要

生体電気信号は、細胞の挙動を支配する重要な生物物理学的要因です。最も有名な例は、ニューロンと心臓細胞の活動電位で、電気信号を長距離(最大1メートル)および高周波(最大数百ヘルツ)で伝達します¹。電極で印加された電気パルスは、活動電位の発火を刺激するために使用でき、研究および医療用途に役立ちます²。発達、創傷治癒、恒常性などの遅い生理学的プロセスにおける内因性生体電気信号 3,4,5,6,7,8 も、数時間から数日にわたって測定されています ^9,10。重要な例は、数ミリボルトから数十ミリボルトの範囲の経上皮電位差(TEPD)を積極的に維持するコンフルエント上皮層です^4,11。これらの合流層の切り傷または創傷は、組織の電気的活動によって駆動される短絡電流を生成します^12,13。最大数十μA/^cm2の巻線電流と最大数百mV/mmの電界が、さまざまな技術で報告されています。研究によると、これらの電気信号は、細胞が^{治癒プロセスにとって}重要な創傷または感染部位に向かって移動するための方向性の手がかりを生成することが示唆されています^3,6,14。一般に、静的(またはゆっくりと変化する)電気信号と高速で変化する電気信号の両方が重要であり、異なる細胞または組織の応答を引き起こします。

ゆっくりと変化する信号の領域では、重要な現象の1つが「ガルバノタキシス」と呼ばれる電気駆動の移動プロセスです。制御された面内ガルバニック電流は、単純なチャネルを備えたマイクロ流体デバイスに適用して巻線電流を模倣することができ、細胞移動は電流密度の関数として調査されます^15,16。0.1〜1000 V / m(対応する電流密度は0.1〜1000 A / m²)の電界は、このin vitro設定で多くの細胞型の細胞遊走を促進することがわかっています¹⁷、一方、PI3Kなどの走化性(化学勾配によって導かれる細胞遊移)に標準的なシグナル伝達経路は、ガルバノタキシスに関与しています^7,18.ガルバノタキシス研究用の「ベアボーン」マイクロ流体デバイスは、標準的なソフトリソグラフィーおよび微細加工技術で製造できます¹⁹。これらのデバイスは通常、スライドガラスに接着された単一チャネルのポリジメチルシロキサン(PDMS)基板で構成されます(チャネル断面積サイズ:数百マイクロメートル、長さ:センチメートル)。静電流を供給するために使用される電極は、セル領域から遠く離れた場所に設置され、ソルトブリッジの有無にかかわらず接続されます。ソルトブリッジ接続は、PDMS基板、マイクロ流体コネクタ、および寒天で満たされたチューブに穴を開けることによって行うことができます。チャネルの下にある単純なスライドガラス(通常厚さ170μm)は、ガルバノタキシス実験中の高解像度の生細胞イメージングもサポートしており、これはプロセスを研究する上で重要な機能です。

組織恒常性の維持における内因性電気信号の役割は、創傷治癒における役割よりもはるかに理解されていません。重要な理由の1つは、無傷の組織でこれらの効果を研究するための適切なツールが不足していることです。ガルバノタキシス用のマイクロ流体デバイスは、面内電流のみをサポートする形状のため、この目的には適していません。上皮恒常性の文脈では、コンフルエント上皮層を横切るTEPDまたは面外電流を制御および摂動するための新しいデバイスが必要です。単層全体に比較的均一なイオン電流密度を適用するという目的を達成するために、デバイスの形状、材料の使用、 およびその場生 体力学的^{測定機能に}革新をもたらしたマイクロ流体デバイスを設計および製造しました4。電気的効果は、この機能で研究できるバイオメカニクスおよびメカノバイオロジー経路との結合を通じて細胞の挙動に影響を与える可能性があるため、後者の機能は重要です。

この新しいデバイスは、複数の革新的な機能を示しています。ガルバノタキシスデバイスに見られる単一のチャネル(形状の革新)ではなく、2つの層で設計されており、電極チャンバーへの接続は後者と同様のままです。最初のマイクロ流体層には、イオン電流を組織領域に(または組織領域から遠ざける)ためのチャネルがあり、2番目の層には、この2番目のマイクロ流体層の上にある上皮を横切ってこの電流を垂直に導く開口部があります(図1A、B)。微細加工技術は、サンプルの厚さを増やすマイクロ流体層の積層にもかかわらず、高解像度の共焦点イメージングが可能になるように、十分に薄い層を生成するために使用されます。その他の重要なイノベーションでは、ポリアクリルアミド(PA)合成ヒドロゲルがデバイスの中央に組み込まれており、これが重要な役割を果たしています(図1A、B)。細胞外マトリックスタンパク質をコーティングするための利用可能な化学的性質、イオンへの透過性、および既知の弾性など、このゲルの物理化学的特性は、それぞれ細胞の付着と成長、面外電流の印加、および電気刺激中の機械的応力²⁰ の測定に不可欠です。バリア構造は、以前のマイクロ流体デバイス²¹ で行われたように、PAゲル前駆体溶液を閉じ込めるために組織領域の層1に組み込まれています(図1A、B)。最後になりましたが、PAゲル重合は酸素ガスを透過するPDMS表面で酸素阻害されるため、別の材料²² がデバイス製造に使用され、PAゲルの重合および緊密な結合を可能にすることができます。新しいデバイスが機能するには、すべての革新的な機能が不可欠です。

全体として、無傷の組織の恒常性における静的またはゆっくりと変化する生体電気信号の詳細な研究は、この新しいデバイスによって可能になり、そのプロトコルについては以下で詳しく説明します。ここで言及されているプロトコルと結果は、電流によって誘発される細胞イベント(増殖、死、押し出し、および遊走)および組織構造変化を含む、Madin Darby Canine Kidney II(MDCK II)上皮細胞株に焦点を当てています。これらの研究は、この技術を適用して、細胞層や初代細胞や2Dオルガノイドなどのより複雑なシステムにおける細胞イベントの電気的調節と細胞イベントの誘導、および細胞運命の変化を研究することに関心のある研究者にとっても有益です。

プロトコル

注:このプロトコルは、静電流を印加してコンフルエント上皮のTEPDを乱すセットアップを構築し、生細胞イメージングおよびメカノバイオロジー技術を通じてその効果を研究するためのステップを提供します(図1)。セットアップは、顕微鏡での多重実験用の複数のデバイスを収容するためにカートリッジ、インサート、およびホルダーに結合されたマイクロ流体チップで作られたデバイス、ソースメーターとデバイスに接続された一対の電極チャンバー、および適切な生細胞状態を維持するための生細胞チャンバーの蓋で構成されています(図1C)。カートリッジおよびセットアップのその他の重要なコンポーネントの設計原則とCADファイル図面は、 補足ファイル1にあります。手順には次のものが含まれます。1) PDMS ソフト リソグラフィー。2)チップ製造とデバイスアセンブリ。3) セットアップの完了。4)単層増殖と生細胞実験。このプロトコルで使用される試薬および材料に関する詳細情報は、 材料 表 に記載されています。

1. PDMSソフトリソグラフィ

注:このセクションでは、マイクロ流体チップのUV硬化型接着剤ベースの層を成形するために、SU-8ウェーハ(図2A、B)からPDMSエラストマーを製造する方法について詳しく説明します。

1. PDMSソフトリソグラフィ
   1. フォトリソグラフィ技術(補足ファイル2 および 補足ファイル3)を使用して、マイクロ流体層、レイヤー1および2ごとに個別のSU-8ベースのウェーハを製造します。
      注:微細加工/クリーンルーム施設にリクエストが送信された場合、ウェーハ製造には1か月かかる場合があります。ウェーハ製造用のシリコンエッチング技術も使用できます。
   2. シリコンウェーハをシラン化してPDMSの型外を可能にする¹⁹.
      1. 加圧窒素エアブローガンでウェーハを洗浄します。短い酸素プラズマプロセス(1〜3mbarの反応器圧力で20 sccm O₂ ガス流で30秒、30 W)を適用してウェーハの表面を活性化します²³。
      2. 200 μL のトリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル-1-トリクロロシランを清潔なプラスチックキャップ(直径 60 mm、高さ 15 mm)に入れてピペットで入れます。真空デシケーターのウェーハの横にキャップを置きます(シラン化のみ)。真空ポンプの電源を入れ、気化したシランがシリコンウェーハ上に単層として堆積するまで1〜2時間待ちます。
         注意: シランは腐食性と毒性があります。安全な操作を確保するために、手袋と安全ゴーグルを着用し、ヒュームフード内で操作してください。
         注:新しくシラン化されたウェーハを使用して、10〜20個のPDMS金型を製造できます。真空時間は真空ポンプの状態によって異なります。過度のシラン化は厚さに不均一を引き起こし、曇った外観になるため、避ける必要があります。ウェーハを使用しないときは、湿度管理されたチャンバーに保管してください。新しいウェーハから作られたPDMS構造は、走査型電子顕微鏡(SEM)を使用して確認できます。
   3. 十分なベースPDMS樹脂と架橋剤をペトリ皿(直径150 mm、高さ25 mm)で数分間(w:w = 10:1、および70〜80 g)完全に混合します。混合物中に小さな気泡が均一に形成され、良好な混合物であることを確認します。混合物を50 mL遠心分離管に移し、550 x g で3分間遠心分離して気泡を完全に除去します。
      注:PDMS液体は粘着性があり、洗浄が困難です。注ぐときは注意してください。ベンチの表面がこぼれたPDMS混合物によって汚染されている場合は、イソプロパノールで洗浄してください。
   4. 底が平らなプラスチックまたはガラスの皿(直径150 mm、高さ25 mm)のウェーハにPDMS混合物をそっと注ぎ、ウェーハを押し下げてウェーハの底からPDMSをパージします。真空ポンプによる脱気混合物。
      注:ウェーハの底から液体PDMSをパージすることが重要です。底部のPDMS層が厚いため、プラスチック皿からウェーハを取り外すことが困難になり、ウェーハが粉々になる可能性が高くなります。あるいは、ウェーハの端に沿ってPDMSを切断し、ウェーハをシャーレに保持することもできます。レイヤー1のPDMSの厚さを約1.5mmにして、後の製造ステップで金型の柔軟性を確保します。レイヤー 2 の PDMS の厚さを約 2.5 mm にして、後の製造ステップでたるみが発生する可能性を減らします。PDMSの厚さは、PDMS金型を必要な形状に切断した後、定規で測定されます。
   5. PDMSを80°Cのオーブンで2時間硬化させ、プロセス中に皿ができるだけ水平に配置されていることを確認します。PDMS金型とウェーハを室温まで冷却します。鋭利な手術用ブレードとパッド入りのピンセットを使用して、PDMSモールド全体をウェーハから慎重に取り外します。
      注:ウェーハの表面を傷つけないように注意してください。PDMSを剥がした際に、ウェーハ表面にPDMSの残骸が形成されていないか確認します。これは、ウェーハ表面を再シラン化する必要があることを示しています。
   6. PDMS金型を目的の機能を含むブロックに切断し、使用しないときはこれらのブロックを清潔なペトリ皿(直径150 mm、高さ25 mm)または真空チャンバーに保管します。重要な機能に触れることなくPDMS金型を操作します。

2. チップ製造とデバイス組み立て

注:低粘度のUV硬化性ポリマー(最大UV吸収範囲350〜380 nm)を使用して、PDMS成形を通じてマイクロ流体チップを製造します。UV硬化型接着剤は、ポリアクリルアミド(PA)ヒドロゲルを透明でイオン透過性のある弾性セル基質として統合することができます。PAゲルの特性は、生細胞イメージングと静電流刺激を可能にする組織機械的ストレスセンサーとしてサポートされています。チップは最終的に、培地を収容し、電極チャンバーに接続するカートリッジに取り付けられます。

1. ガラスカバーガラスベースの準備
   1. カートリッジの寸法に合わせて、ダイヤモンドカッターで必要な量の長方形ガラスカバーガラス(170 μm)を37 × 24 mm²のサイズにスコアリングします(補足ファイル4)。
      注:カバーガラスの厚さは170 μmで、高解像度イメージングに対応していますが、壊れやすいため、取り扱いには注意が必要です。手袋と目の保護具を着用してください。長方形のガラスカバーガラスの欠けは漏れる危険があるため、目に見える亀裂が現れた場合は、直ちに長方形のガラスカバーガラスを廃棄してください。または、カバーガラスメーカーに適切なサイズのカバーガラスを注文してください。長方形のガラスカバーガラスの表面に素手で触れたり、画像品質を低下させる可能性のある汚れを残したりしないでください。
   2. 長方形のカバーガラスを重ならずにきれいなペトリ皿に入れ、プラズマチャンバーに移します。真空状態を誘発しますが、最後に少し空気を入れます。エアプラズマを使用して長方形のガラスカバーガラスの表面を活性化します(30秒から5分、29.6 W、機器の状態によって異なります)。
      注:プラズマに完全にさらされた側面(つまり、上面)のみを、次のステップ(ステップ2.1.3)で使用する必要があります。血漿曝露後 30 分以内にステップ 2.1.3 を完了します。空気プラズマが生成されている場合、この段階でチャンバーはピンクパープルとして表示されるはずです。後者の結合ステップが成功した場合は、便宜上プラズマ持続時間を短縮します。
   3. 100%エタノールに溶解した0.3%酢酸と0.5%3-(トリメトキシシリル)メタクリル酸プロピルで作った表面処理液10mLを調製します。この溶液で長方形のガラスカバーガラスをペトリ皿(直径150 mm、高さ25 mm)でシェーカー上で5分間処理し、UV硬化型接着剤ベースのマイクロ流体層との良好な結合を可能にします。長方形のガラスカバーガラスが溶液に完全に浸され、両面が処理されていることを確認してください。
      注意: 表面処理液は腐食性があります。ドラフトで取り扱ってください。
   4. 長方形のガラスカバーガラスを100%エタノールで3回すすぎ、プロセス中に乾燥させないでください。長方形のガラスカバースリップを窒素ガスとブローガンで1つずつ乾燥させます。カバーガラスのベース表面から液滴をきれいに除去し、液体の汚れを防ぐ十分なブロー速度を確保してください。長方形のガラスカバーガラスを清潔なペトリ皿(直径150 mm、高さ25 mm)に保管します。
      注意: ブローガンを使用して、カバーガラスベースと平行に空気の流れを向け、メガネが飛散するのを防ぐために過度のブロー速度の使用を避けてください。
2. レイヤー 1 の製造(図 2C)
   1. きれいなレイヤー1PDMSモールドを表向きにして、清潔なプラスチック製のディッシュキャップ(直径60 mm、高さ15 mm)の上に置き、平らにします。500 μLの液体UV硬化型接着剤を金型にゆっくりとピペットでかけ、ヘラを使ってすべての突出した構造を慎重に濡らします。湿潤プロセスによる気泡を除去します。
      注:クリーンなPDMS金型は、テープを使用してほこりやUV硬化性接着剤の残留物を取り除くか、エタノールで洗浄することによって準備できます。追加の予防措置として、PDMS金型を使用しないときは真空チャンバーに保管してください。
   2. カバーガラスをPDMS金型にそっと押し下げます。UV硬化型接着剤の残りは、清潔で平らなカバーガラスを妨げる可能性があるため、過剰なUV硬化型接着剤がカバーガラスの上面を濡らすのを防ぎます。実験用ワイパーで余分なUV硬化型接着剤を取り除きます。
      注: UV 硬化型接着剤層に転写された PDMS 金型の機能が、接着されるカートリッジと一致することを確認することが重要です。これを行うには、カートリッジウェル(そのうちの3つ)の中心が配置される可溶性マーカーペンでカバーガラスに印を付けます。これらのマークを使用して、長方形のガラスカバーガラスを押し下げるときに、カバーガラスをPDMS金型の特徴に合わせます。
   3. 均一に照らされたUV光(363-370 nm、224 mW/cm²)で構造を10秒間部分的に硬化させます。後で75%エタノールで跡を拭き取ってください。構造を平らな面にしっかりと保持し、レイヤー 1 PDMS モールドをゆっくりと剥がします。
      注:部分硬化により、十分に固体のUV硬化性接着剤層が形成され、この段階でPDMS金型を剥がすことができます。これにより、2層のUV硬化型接着剤構造を製造するための後続のステップで、部分的に硬化したレイヤー2との接着も容易になります。厚さ1.5mm(ステップ1.2.4)で調製されたレイヤー1PDMS金型は、十分なPDMSの柔軟性を確保し、剥離プロセス中に薄いカバーガラスが粉々になる可能性を低減します。PDMS金型は最大10回から20回再利用でき、その後PDMS表面にUV硬化型接着剤の残骸が白っぽい層になり、構造の厚さが薄くなる場合があります。この場合、新しいPDMS金型を使用してください。
3. レイヤー 2 の製造(図 2D)
   1. きれいなレイヤー2 PDMS金型を下向きにして、平らなPDMSスラブ(スラブの厚さは>2.5mmで、高い剛性を確保します)の上に置きます。ピンセットを使用して、上から特徴を軽くたたきます。特徴の下のインターフェースの暗さや光学的コントラストを観察してください - これは適切な接触を示しています。
      注: 主な特徴 (2 つの丸い開口部とスリット) を囲む支柱は、PDMS 金型表面のたるみを防ぐために非常に重要です。
   2. PDMS金型とスラブの間のスペースを、毛細管現象により液体UV硬化型接着剤で埋めます。UV光(363-370 nm、224 mW/cm²)下で構造を10秒間部分的に硬化させます。
   3. 柔らかいパッド入りのピンセットで、複合UV硬化型接着剤層とPDMSモールドをPDMSスラブからそっと剥がします。必要に応じて、鋭利なハサミで UV 硬化型接着剤層の余分な端を切り取ります。
4. レイヤー1および2のボンディング(図2E)
   1. レイヤー1を長方形のガラスカバーガラスに取り付けて平らな面に置きます。レイヤー 2 (PDMS 金型に取り付けられたまま) をレイヤー 1 に合わせ、両方のレイヤーをしっかりと押して、フィーチャーの下に「影」が表示されるようにします。
   2. UV光(363-370 nm、224 mW / cm²)下で構造を10秒間硬化させ、マイクロ流体チップの2層構造を形成する層1と2を結合します。PDMSモールドをチップからそっと剥がします。
      注:チップからPDMSモールドを確実に剥がすには、ピンセットを使用して、ステップ2.4.1で各PDMSサポートピラーをUV硬化型接着剤層2から分離します。この作用は、剥離に重要な PDMS 金型とレイヤー 2 の間の全体的な接着を軽減するのに役立ちます。
5. ポリアクリルアミドゲルの統合(図2F)
   注:このセクションの前に、多重実験に必要な数のチップを準備してください。
   1. 選択²⁴ のPAゲル剛性に対応する、以下の表の成分を穏やかに混合して、PAゲル前駆体溶液を調製します( 表1を参照)。酸素はゲル化を阻害するため、ピペッティング中に気泡が入らないように注意してください。
      注意:TEMEDとAPSは有毒です。ドラフトで作業し、手袋を着用してください。
      注:少量の液体が関与するため、慎重なピペッティングと取り扱いが必要です(1 mLのPAゲル前駆体溶液に対して1 μL TEMED)。ゲルの剛性は、多くのメカノバイオロジー研究で示されているように、細胞の挙動に影響を与える可能性があります。実験に最も適した剛性を選択してください。蛍光ビーズは、ゲル変形と機械的応力推論の基準マーカーとして機能します。PAゲル前駆体溶液にピペッティングする前に、ビーズ溶液をボルテックスします。PAゲル前駆体溶液は、両方の開始剤が添加されるとゲル化し始め、この短い時間で少量の液体を完全に混合することが困難であるため、少量のTEMEDを最後に混合しないことをお勧めします。
   2. すぐに10 μLのPAゲル前駆体溶液を組織領域の中央とレイヤー2のスリットの上にピペットで入れます(図1B、2F)。丸いガラスカバーガラス(直径10 mm)でそっと押し下げて、平らなゲルを形成します。PA 溶液がスリットを通ってレイヤー 1 に流れ込み、バリア ピラーの列で停止するのを観察します。
      注:10 μLのPAゲル前駆体溶液は、レイヤー2の上に厚さ100 μmのゲルを生成します。必要なゲルの厚さに応じて、この量を変更します。開始剤が添加されるとPA溶液が重合し始めるため、できるだけ早くチップ上で溶液をピペットで移動します。溶液がバリアピラーを越えて溢れてチャネルを塞ぐのを防ぐために、適切な力で溶液を押します。チャネルがブロックされている場合は、チップを廃棄します。剛性が5kPa以下のソフトジェルの場合は、ガラス撥水剤を使用して丸いガラスカバーガラスを処理し、カバーガラスを疎水性にします。特に、カバーガラスをガラス撥水剤に5分間浸し、100%エタノールで3回すすぎ、窒素ガスで乾燥させます。これにより、後でゲルを破壊することなく、重合ゲルからカバーガラスを剥がすことが容易になります。
   3. マイクロ流体チップをUV光(363-370 nm、224 mW/cm²)下で5分間硬化させます。PAゲルが完全に固まるまで、少なくとも~1時間待ちます。
      注:これにより、重合したPAゲルが構造に結合しながら、チップが完全に硬化します。ステップ2.5.1、2.5.2、および2.5.3をすばやく連続して完了する必要があります。
   4. チップをHEPES(0.1 M、pH 7.4)で少なくとも1時間以上完全にインキュベートして、ゲルを濡らし、カバーガラスとゲルの間の接着を緩めます。鋭利なピンセットでカバーガラスをそっと取り外します。
      注:剛性が5 kPa以下の軟質ゲルの場合は、ゲル構造を損なうことなくゲルからカバーガラスをきれいに除去するために、シェーカーでインキュベーション期間を最大10時間延長します。場合によっては、長方形のカバーガラスベースとUV硬化型接着剤ベースのレイヤー1の間に数十〜数百マイクロメートルの構造パターンが形成されることがあります。これらのパターンは明視野イメージングを妨げる可能性がありますが、蛍光イメージングへの影響は最小限です。これは、ステップ2.1.2のように、長方形のカバーガラスのプラズマ活性化によって改善できます。
6. チップとカートリッジのボンディング(図2F)
   1. 洗浄した医療グレードのポリカーボネートカートリッジ(補足ファイル4)を平らな面に置き、底面を上にして置きます。チップ上のゲルを実験用ワイプで側面から乾かします。チップを下向きにしてカートリッジに合わせます。
      注: 新しいカートリッジ設計をテストする場合は、機械加工または 3D プリント方法を使用できます。デザインが決まると、射出成形を使用してカートリッジを大量に生産できます。
   2. チップとカートリッジの間の隙間にUV硬化型接着剤をピペットで入れ、毛細管現象によって充填します。UV光(363-370 nm、224 mW/cm²)で5分間硬化します。
      注意: UV硬化型接着剤がチャネルやカバーガラスベースの反対側に溢れないように注意してください。
7. 未重合PA溶液の除去
   1. PDMSストッパーとシリンジを使用して、老廃物除去チャネルから約5 mLのHEPES(0.1 M、pH 7.4)を引き出し、細胞に有毒な未重合のPAゲル前駆体溶液を洗い流します。
   2. デバイス内のゲルをデバイスあたり2 mLのHEPES(0.1 M、pH 7.4)とともにインキュベートし、シェーカーに1〜2日間置いて、未重合のPAゲル前駆体溶液を完全に除去します。

3. セットアップ完了

注:デバイスを作成したら、細胞播種用のECMタンパク質でPAゲルをコーティングし、電気刺激のためにデバイスを電極チャンバーに接続し、デバイスをインサート、ホルダー、および多重化された生細胞イメージング実験用の生細胞チャンバーの蓋に配置することにより、セットアップを完了します(図1C)。

1. 滅菌成分の調製
   1. デバイス(材料表)以外のセットアップのすべてのコンポーネントは、最初に石鹸水で30分間、次にMQ水で30分間、最後に75%エタノールで30分間超音波処理する必要があります。その後、60°Cのオーブンで乾燥させ、バイオセーフティキャビネット内で200〜280nmの紫外線で30分間処理して滅菌します。
2. ECMタンパク質によるPAゲル機能化
   1. バイオセーフティキャビネット内のUV光(200-280 nm)でデバイスを滅菌します。
   2. 必要な量の50 μg/mLコラーゲンIワーキング溶液を氷上の1x DPBSで調製します。
      注:ゲル化を防ぐために、コラーゲンIストックを氷の上に置いてください。ゲルを完全に浸すには、各デバイスに100〜150 μLのコラーゲンI作業溶液が必要です。繊維の形成を避けるために、コラーゲンI溶液をそっとピペットで入れます。
   3. 必要な量のスルホ-サンパ(SS)作業溶液を氷上で調製します。各ゲル処理には約 80 μL の SS 作業溶液が必要であり、2 μL の SS 原液 (無水 DMSO に溶解) を 80 μL の冷たい HEPES (4 °C 冷蔵庫、0.1 M、pH 7.4 から) で希釈します。
      注:SSは湿気に敏感です。開封前にストックバイアルを室温に平衡化させることで、製品への水分の結露を避けてください。最高のパフォーマンスを得るには無計量SSを使用し、無水DMSOでストックを調製します。お早めにご利用ください。SS作業溶液の準備として、SSの加水分解速度を低下させるために、低温HEPES緩衝液が使用されます。各ゲルは、PA ゲル表面が十分に機能化されるようにするために、SS 作業溶液による 2 回の処理が必要です。
   4. ゲルの端を実験用ワイプで軽くたたいて、デバイス内のゲルを乾燥させます。ゲル上に80 μLのSS作業溶液をピペットでかけ、ゲル表面がSS溶液に完全に浸漬されるようにします。ゲルをUV(363-370 nm、24.5 mW / cm²)で5分間処理してSSを活性化します。冷たいHEPES(0.1 M、pH 7.4)で3回すすぎます。
      メモ: SSが壁に引き寄せられないように、カートリッジウェルの中央でSSを慎重にピペットで入れてください。
   5. 手順3.2.4を繰り返しますが、最後に冷たい1x DPBSで3回すすいでください。
      注:SS加水分解を防ぐために、ステップ3.2.3から3.2.5を連続して実行する必要があります。SSによる表面活性化が成功した場合、この段階ですすぎたゲルは、より濃い赤色の色合いとして現れるはずです。
   6. 100 μLのコラーゲンI溶液をPAゲルにピペットで移動し、ゲルを完全に浸漬させます。室温で1時間インキュベートし、付着していないコラーゲンを1x DPBSで3回洗い流します。使用前にゲルを1x DPBSに浸漬してください。
      注:コラーゲンIコーティングされたサンプルは、4°Cの冷蔵庫で数日間保存できます。
3. 電極チャンバーへのデバイスの接続
   1. ネジを使用してデバイスをインサートに取り付けます(図1C、ネジタイプ:M3 X 10 mm)。次に、最大4つのデバイスインサートアセンブリを、顕微鏡ステージに取り付け用に設計されたホルダー(ネジタイプ:M3 X 5 mm)に固定します。
      注:最大数のデバイスインサートアセンブリを使用しない場合は、他のすべてのホルダースロットを空のデバイスで埋めてスペースを密閉し、後のイメージング実験のために良好な生細胞状態を維持できるようにすることをお勧めします。空のデバイスは、カートリッジをむき出しの長方形のガラスカバーガラスに接着するだけで簡単に作成できます。
   2. デバイスに培地(DMEM ++、各メインウェルに2 mL)を充填します。さらに、2 mLの培地を廃棄物除去チャネルに通して洗い流し、1x DPBSを交換します。
   3. 電極チャンバーとして機能するスルーホールのあるキャップ付きの50 mLチューブを2本用意します。白金電極とタイゴンチューブをしっかりとフィットさせるために、適切なサイズと量の穴を作り、電極チャンバーをデバイスに接続します。各電極チャンバーに45 mLの培地を入れます。
      注:鋭利な外科用ブレードを使用して、キャップに穴を簡単に開けることができます。
   4. 電極室とデバイス間の接続を準備する: 各デバイスに 2 つのチューブ コネクタを取り付けます。各Tygonチューブにチューブクリップを差し込みます(図1C)。シリンジで培地をチューブに通し、しっかりとクリップします。媒体で満たされたチューブの一方の端を電極チャンバーに接続し、もう一方の端をデバイスに接続します。
      注:予熱した媒体を使用するか、真空チャンバー内で媒体を脱気することにより、チューブ内に気泡が発生する可能性を減らします。Tygon チューブとチューブ コネクタの間の界面で気泡が形成されるのを防ぎ、チューブの端をつまんで媒体表面を膨らませてからチューブ内の媒体に浸すか、チューブ コネクタに物理的に取り付けます。
   5. ラボジャックを使用して、デバイス内の培地表面と電極チャンバーの間の相対的な高さを調整します。チューブクリップを解放し、すべての媒体表面を同じ高さまで平衡させます。
      注意: 液体があふれないように、セットアップ全体を移動するときは必ずチューブクリップを固定してください。
   6. 電源メーターを用いて各機器の抵抗を個別に測定し、品質管理を行います。
      注意: 抵抗を測定しているデバイスのチューブクリップのみを解放し、並列に接続された他のデバイスのクリップをしっかりと固定してください。

4. 単層増殖と生細胞実験

注:適切なコンフルエント単層を形成し、単層のコンフルエントと電気抵抗に依存する均一に分布した電流密度を達成するため。次に、顕微鏡で適切な生細胞の状態を確保し、長期イメージングおよび電気刺激実験を行います。

1. 単層成長
   1. トリプシンを使用して T25 フラスコから MDCK 細胞を分離します。遠心分離して、10万個の細胞を得るのに必要な培地量を数えます。この数の細胞を懸濁し、遠心分離管内の2 mL培地でよく混合します。
   2. 細胞を含んだすべての培地を組織領域のウェルにピペットで入れます。細胞を15分間沈殿させてから、セットアップ全体を組織培養インキュベーターにゆっくりと移します。
      注:各デバイスについて、10万細胞の播種密度は、1平方センチメートルあたり0.06万細胞(6×10⁴ 細胞/cm²)に相当します。この播種密度は十分にまばらであり、細胞はコンフルエント状態に達する前に2日間成長します。このプロセスにより、組織を乱す危険性のある過剰な未付着細胞を洗い流すことなく、適切に分極され均質な単層が保証されます。沈降ステップは、細胞の播種が均一になるように、邪魔されずに放置されることが重要です。
   3. 細胞をインキュベーター(37°C、5%CO₂、90%湿度)で72時間増殖させ、>~50細胞/ 100μm²の細胞密度に達します。位相差のある卓上顕微鏡で毎日チェックし、成長プロセスを監視します。
      注:この数の細胞を播種すると、MDCK細胞は24時間後に70%〜80%のコンフルエントに達し、48時間後に完全なコンフルエントに達し、さらに細胞密度が増加し、72時間まで組織が成熟します。24時間後、平均セル長は約10〜20μmです。48時間で、細胞間接合部と細胞体は位相差イメージング下で明確なコントラストを持っています。このコントラストは72時間後に大幅に減少します。
2. 生細胞イメージング
   1. 実験のニーズに応じて、落射蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を選択してください。細胞が発現したり、蛍光マーカーで染色されたりする場合は、細胞形状やゲル基質の変形を3次元で観察するために共焦点を選択してください。2次元観察には、光毒性の少ない位相差と落射蛍光を選択します。セットアップを顕微鏡に持ち込む1時間前にライブセルシステムの電源を入れ、顕微鏡ステージトップインキュベーターを37°C、5%CO₂、および90%湿度に安定させます。
      注:ライブセルシステムコントローラーは、ステージトップインキュベーターの状態を表示し、条件が最適ではないと警告を鳴らします。ステージトップのインキュベーターの蓋は、外側に伸びるデバイスチューブに対応する必要があるため、市販のものとは異なり、長時間(数日から最大1週間)の実験で良好な生細胞状態を確保するために、システムの再校正が必要です。校正はユーザーマニュアルに基づいて行うことができ、センサーの位置は実験でも校正条件と同じに保つ必要があります。ステージトップインキュベーター内の培地の蒸発速度と、フェノールレッド注入培地でのpH条件を確認します。
   2. 電極チャンバーを側面にして、セットアップを顕微鏡に取り付けます。顕微鏡の電子ステージが移動するのに十分なスペースがあり、電極チャンバーにぶつからないようにしてください。中程度の表面の高さが平衡であり、デバイス内の高さと電極チャンバー内の高さが同じであることを確認します。
      注:組織領域があるデバイスウェルの媒体表面(図1C)は、明視野および位相差イメージングに大きな影響を与えます。メニスカスは不要な光の集束を引き起こします。培地表面がウェルの縁で平らであることを確認しますが、生細胞チャンバー内の培地蒸発により、しばらくするとこの平らな表面が歪むことに注意してください。この問題を克服するための 1 つの解決策は、平らなガラスのカバーガラスを媒体表面に接触させてこの表面を平らにすることです。このカバーガラスは、細胞増殖に重要なガス交換を妨げないように、井戸よりも面積が小さくする必要があります。別のオプションは、培地に細胞培養グレードの鉱物油を層状にすることです。
   3. ソフトウェアをセットアップします。
      1. 落射蛍光顕微鏡による全組織イメージングには10倍または20倍の対物レンズを選択し、高解像度の共焦点イメージングには30倍の対物レンズ(WD 0.8 mm、NA 1.05)を選択してください。
      2. 全組織イメージングの場合、組織領域の長方形の領域をカバーするために複数の位置を選択します(図1A、たとえば、5行×5列、中央の列はスリットを覆い、他の列はスリットの外側にあります)。結果部分で使用する細胞株に応じて、蛍光チャネルと明視野チャネルを選択します(緑色蛍光の場合はチャネル488、赤色蛍光の場合はチャネル561)。この長期イメージング実験で光毒性を最大数日間軽減するために、1時間の時間間隔を選択します。
         注:組織全体のより大きなビューが必要な場合は、4倍などの他の対物レンズを選択できます。
3. 電気刺激
   1. 各デバイスのデバイス数、相対デバイス抵抗、および目標電流を確認します。セットアップ全体で、数時間から最大1週間供給する総電流を決定します。
   2. 電流クランプモードで電気信号をソースします。同じチャネル抵抗を持つ3つのデバイスの場合、1つのコントロールグループ(電流なし、チューブクリップが固定されている)、1つのアピカル-ベース(AtB)電流条件、および1つのベース-アピカル(BtA)電流条件(図1D)で、ソースメーターで合計20μAの電流を供給します。これにより、生理学的に関連する推定電流密度~10μA/^cm2 で、各デバイスに10μAが供給されます(詳細は説明で参照)。
      注意: 総電圧は、Tygonチューブの長さに応じて、約数十ミリボルトです。このような電流は、数日から最大1週間連続して供給することができます。フェノールレッドインジケーターは、電極チャンバー内で色が変化しますが(正極のあるチャンバーではより酸性になります)、十分に校正されたステージトップインキュベーターでは変わりません。生細胞の状態が十分に維持されている限り、細胞は健康なままです。研究者は、ステージトップインキュベーター内の培地を1日おきに交換し、電極チャンバー内の培地を数日に1回交換できます。電極チャンバーを切り替えるときは、媒体のオーバーフローを避けるためにチューブクリップを固定してください。手順 3.1.1 で説明したように、ホルダー スペースを覆う空のデバイスを忘れないでください。これにより、ライブセルチャンバーが適切な状態にあることが保証されます。

結果

ここで提示されたすべての結果は、以前の出版物⁴ から適応されています。詳細については、この出版物を参照してください。

このプロトコルにより、細胞または組織の平面に垂直な外部イオン電流または電場を印加することができます。この電気刺激は、内因性経上皮電位差 (TEPD) を乱し、組織の挙動の支配における TEPD の役割を研究することを可能にします。プロトコルに従って、野生型および遺伝子編集されたMDCK細胞(GFP-アクチン、H1-GFPおよびGFP-E-カドヘリンMDCK)をデバイスに播種し、コンフルエントまで3日間増殖させました。電流の方向の影響を研究するために、3つのデバイスをホルダーに配置し、同じ電極室と電源メーターに接続しました。1つのデバイスが制御として機能し(電流なし、タイゴンチューブがクリップ)、他の2つのデバイスは、電流の方向が互いに反対になるように反対方向に配置されました(BtA:基底から頂端方向を指す電流、およびAtB:頂端から基底方向を指す電流)。セットアップ全体を生細胞チャンバーを備えた共焦点顕微鏡に取り付け、...

ディスカッション

このプロトコルは、経上皮電位摂動実験を実行し、生細胞イメージングおよびメカノバイオロジー手法を通じて生体電気効果を研究するための新しいマイクロ流体デバイスを製造するための詳細な手順と設計ロジックを提供します。この方法の重要性は、他の関連方法と比較すると明らかです。たとえば、関連する方法の1つは、ガルバノタキシス(電流密度の関数としてのセル移動)を研究するために定常面内電流を印加するシングルチャネル設計の単純なマイクロ流体チップを使用します^15,16。どちらのチップ設計も、印加電流の対称性と電流によって制御されるセルの動作が大きく異なります。ガルバノタキシスを刺激する電流は、細胞の前後極性と細胞遊走に作用し、TEPDを乱す電流は、細胞の根尖基底極性と組織定常状態に作用します。このプロトコルで提示されたものに匹敵する別の方法は、流体ポンプおよび同様のマイクロ流体チップ形状²⁵を使用して、上皮の平面に垂直な流体の...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1x DPBS	ギブコ	14190144
3-(トリメトキシシリル)メタクリル酸プロピル、TPM	シグマ	2530850	開封後は窒素下で保管してください。
50 mL ファルコンチューブ	コーニング	430829	50 mLのファルコンチューブキャップに4つの穴を開けて、電極とチューブがキャップを通過して培地に浸すことができます。マイクロ流体デバイスのセットには、少なくとも2つのキャップが必要です。
酢酸	シノファーム	10000208
アクリルアミド溶液、40%	シグマ	79061	毒性
ポンプ座	OKOラボ	OKO-APの	顕微鏡ステージトップインキュベーターのコンポーネント
過硫酸アンモニウム、APS	アラジン	A112447
カートリッジ	-	-	カートリッジは特注品で、デザインは補助資料を参考にしています。原材料はPCマクロロン2858医療グレードで、詳細はこちらにあります https://solutions.covestro.com/zh/products/makrolon/2858_000000000000508397?SelectedCountry=US
クリップ	-	-	ロバート・クリップ、チューブ用 外径4.5mmの. https://item.taobao.com/item.htm?id=18717491819&pisk=gAsj0ailDjcjqv-tCE2rVYReT5-1h8rFWA9OKOnqBnKv6A1RBjpxDchRepvBWczD0Ft1wQS2gt-v6c1NQi5NBGJOfnjPucR4ih6OThNUTkrFntYBXWPETzI4tHpikchwH3nJbds8Mz2dntxMXYlT8aBmCOO1qfp968tJCdc9XKnte89wBdK9MFh-ypdJXhdvkYpJBpn9HCnYF3pDKKhv6qK-edJXXCC9X86JZdt96bH_3dwJgtw2FbzzkyxCHQitXiEMlB_i7ci1TKLfXtd5zaSWhEOpWac1uiCPBiSDrzgJjT7C1NCLaqRARp1W8ZNIc61DB6tV4jeJXFQP8E_7McOP0dTpXUMtXTtPPFsWvkhWEaBVWifjCcpc0M86tUwtjF-RYeQdGA2henpOsejatmAAB9jh8HZjtK_Rd3syxDRBL50sFem6FBy7FV0GhSGPYc782SYvEK__F8GxLEpkFBy7FV0MkLvf18wSMv5..&spm=a21xtw.29978518.0.0&skuId=3344063585144
コラーゲンI	コーニング	354236
DI Milli-Q 水	ミリQ	-
ダルベッコ修飾鷲培地、DMEM(高グルコース)	ギブコ	11965092	DMEM++はDMEMに10% を追加します。FBS(シグマ-アルドリッチ)、および100 単位/mL ペニシリン-ストレプトマイシン (Gibco)。
エンクロージャーブラックケージ	OKOラボ	H201	顕微鏡ステージトップインキュベーターのコンポーネント
落射蛍光倒立顕微鏡	オリンポス	IX83
エタノール無水	シノファーム	10009218
ウシ胎児血清	シグマ	F8318
蛍光ビーズ、0.1 &L、レッド(580/605)	熱	F8801
ガス室	OKOラボ	H201-PRIOR-SP200/400/600	顕微鏡ステージトップインキュベーターのコンポーネント
ガス手動ミキサー	OKOラボ	2GFミキサー	顕微鏡ステージトップインキュベーターのコンポーネント
ジェネチキン	ギブコ	10131027	GFP–アクチンとH1–GFP MDCKは、0.5&thinspを添加した培地を使用して維持されました。遺伝子発現を維持するためのmg/mLジェネチシン(Gibco)
ヘペス	シグマ	736459
イソプロパノール	シノファーム	80109218
キムワイプ	キンバリー・クラーク・プロフェッショナル	LH-70155	研究室用ワイパー
長いネジ	-	-	ニッケルメッキ丸頭十字精密小ねじ、M3 x 10 mm。 https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n
マイクロ流体コネクタ	-	-	ポリプロピレンストレートユニオンフィッティング、1/16 "-10-32UNF。 https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n
Sulfo-SANPAH、計量なし	熱	A35395	SSストック溶液:無水DMSO中20 mg / mL、2&μ;それぞれにL。SS作業溶液:HEPES中の0.5 mg / mL SS(0.1 M、pH 7.4)。
SYLGARD 184 シリコーンエラストマーキット	ダウコーニング	H052KCM147	最終製品はポリジメチルシロキサン、PDMSです。このキットには、ベースPDMS樹脂と架橋剤が含まれています。
温度単位	OKOラボ	H201-T-ユニット-BL	顕微鏡ステージトップインキュベーターのコンポーネント
テトラメチルエチレンジアミン、TEMED	シグマ	110189	毒性
タッチスクリーンディスプレイ	OKOラボ	オコタッチ	顕微鏡ステージトップインキュベーターのコンポーネント
トリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル-1-トリクロロシラン	シグマ	78560459
トリプシン-EDTA(0.25%)	ギブコ	25200072
タイゴンチューブ	タイゴン	AJK00002	外径(OD)=3.2mm、内径(ID)=1.6mm
超音波洗浄機	サプミール	KD-300DEシリーズ
UVLED硬化機	GHUV	GHS-MFLG	UV-LED光源、発光範囲:363–370 nm、最大出力密度:230 mW/cm2
振動のない加湿モジュール	OKOラボ	HM-VF型	顕微鏡ステージトップインキュベーターのコンポーネント
ビジビュー	ビジットロンシステムズGmbH	-	イメージングソフトウェア
ウェハ層1	シンガポール国立大学機械生物学研究所微細加工施設	-	ウェーハは特注で、デザインは補助材料を参考にしています。
ウェハ層2	シンガポール国立大学機械生物学研究所微細加工施設	-	ウェーハは特注で、デザインは補助材料を参考にしています。