アルシアンブルー染色時のゼブラフィッシュ頭蓋顔面組織の解剖

サマリー

ここで説明するプロトコルは、生後5日のゼブラフィッシュ幼虫の頭蓋顔面軟骨を染色および解剖するための簡単で従いやすい手順を示しています。さまざまな発達条件下でのこれらの構造の解剖学的構造、形状、サイズを研究するために使用できます。

要約

ゼブラフィッシュは、その光学的透明性を考えると、胚で頭蓋顔面軟骨が形成されるメカニズムを研究するための優れた脊椎動物モデルです。頭蓋顔面軟骨は、神経頭蓋と内臓頭蓋の2つのグループに大別でき、脳を支え、摂食装置や呼吸装置を構成するために必要な多数の軟骨グループに細分化できます。このプロトコルでは、最初に、これらの軟骨グループを視覚化するためのゼブラフィッシュの単純で確立された染色手順について説明し、次に神経と内臓頭蓋を解剖して分離する方法論について説明します。これらの解剖から、単純な形状とサイズの指標を簡単に取得でき、このプロトコルでは、これは、ヒトのほとんどの頭蓋顔面障害でしばしば影響を受ける組織である前神経頭蓋の一部である口蓋について実証されています。このプロトコルは、リソースが限られた環境でも簡単な方法で複製できるため、学部生が頭蓋顔面の形態学を学ぶための貴重な教育ツールを提供します。

概要

脊椎動物の頭蓋顔面軟骨は、頭蓋神経堤細胞^{と呼ばれる}多能性細胞集団から出現します1。これらの細胞は、初期胚の神経板の背側縁で最初に特定され、次に分化する前に頭蓋顔面領域と咽頭弓に到達するために長距離を移動します^2,3。この移動と分化を促進するシグナル伝達メカニズムは、脊椎動物の間で大部分が保存されています^4,5。それにもかかわらず、個々の軟骨要素の組織、サイズ、および形状は種によって異なり、多様な頭蓋顔面の形態を引き起こし^ます6。特にゼブラフィッシュは、幼虫の段階までの胚の透明な性質を考慮すると、頭蓋顔面の形態形成を研究するための強力なモデルシステムとして浮上しています。軟骨をマーキングするための簡単な染色手順を使用して、ゼブラフィッシュの多くの頭蓋顔面構造の形態は、シグナル伝達経路^7、8、9へのさまざまな摂動下で、および胚または幼虫が環境中に存在する一般的な汚染物質にさらされたときに特徴付けられました¹⁰。軟骨をマーキングするためにここで説明するアルシアンブルー染色は、Walkerと^Kimmel11によって標準化された非酸性条件の使用を含み、その後、頭蓋顔面の発達に取り組んでいる多くのゼブラフィッシュラボで使用されています5,12,13,14,15,16,17,18,19 、高校での使用説明を含む²⁰.無酸染色は骨構造を無傷で保存し、それぞれアルシアンブルーとアリザリンレッドを使用して軟骨と骨を一緒に染色することができます。しかし、染色および頭蓋顔面軟骨の正確な解剖を実行するための詳細なプロトコル、特にリソースが限られた環境で実施されるそのような研究を支援するためのプロトコルが欠けています。

ゼブラフィッシュの成体の顔面骨格構造は、43本の軟骨由来の骨からなるかなり複雑であるにもかかわらず²¹、摂食能力を獲得したばかりの受精後5日(dpf)の幼虫の頭蓋顔面軟骨は比較的単純であり、背側神経頭蓋と腹側内臓頭蓋に大きく分けることができます⁴.これらの構造は脳を支え、摂食装置に寄与し、鰓組織の軟骨を支えます。ここで説明するプロトコルでは、ゼブラフィッシュの軟骨をアルシアンブルーで染色し、その後、神経と内臓頭蓋を別々の構造に解剖するための詳細な手順が可能になり、最終的にはこれらの構造内のさまざまな軟骨の形状とサイズを注意深く特徴付けることができます。一例として、神経頭蓋の一部である篩骨板と呼ばれる口蓋の前部(口蓋)の寸法を測定します。

プロトコル

この研究で使用されたゼブラフィッシュの維持と実験手順は、施設の動物倫理委員会によって承認されており、参考文献 TIFR/IAEC/2023-1 を参照しています。

1. 試薬の調製

1. E3メディア:
   1. 3.25 gのリン酸二塩基性ナトリウム(0.458 mM Na₂HPO₄)、0.29 gのリン酸二水素カリウム(0.042 mM KH₂PO₄)、11.93 gの塩化ナトリウム(4.084 mM NaCl)、および0.48 gの塩化カリウム(0.128 mM KCl)を1 Lの蒸留水に混合して、50xストック1を調製します。
   2. 2.43 gの塩化カルシウム(0.33 mM CaCl₂)と4.07 gの硫酸マグネシウム(0.33 mM MgSO₄)を1 Lの蒸留水に混合して、50xストック2を調製します。
   3. 500 mLの1x E3培地を調製するには、480 mLの蒸留水に、ストック1と2(pH = 7.4)をそれぞれ10 mL加えます。
      注:これらの溶液の調製中は手袋を着用してください。
2. 1x PBS(リン酸緩衝生理食塩水)中の4%パラホルムアルデヒド(PFA):
   1. 100 mLの1x PBSを68°Cで予熱します。 4 gのPFAを加え、PFAが完全に溶解するまで定期的に混合しながら溶液を68°Cでインキュベートします。
      注:PFAは非常に有毒であるため、この試薬を調製するときは、できればヒュームフードの下で手袋とマスクを着用してください。
3. 0.05% MS-222 (通称トリカイン) 溶液:
   1. E3で4%トリカインストックを作り、4°Cで保存します。 10 mLのトリカインストックを作るには、7 mLのE3に0.40 gのMS-222を加えます。溶液の入ったチューブを軽く振って混合し、容量を10mLにします。50 mLの0.05%トリカイン溶液を製造するには、625 μLの4%ストックを49.375 mLのE3に加えます。
      注:この試薬を調製するときは、手袋とマスクを着用してください。
4. 70%エタノール中の0.4%アルシアンブルーストック溶液
   1. 2 mLのストック溶液を調製するには、8 mgのアルシアンブルーを1 mLの50%エタノールに溶解します。溶液を37°Cで15〜20分間加熱し、定期的に混合して溶解させます。染色が溶けたら、900 μLの100%エタノールと100 μLの蒸留水を加えて、溶液を70%エタノールに補う。
      注:原液は室温で最大2週間保存できます。
5. 染色液 -- 0.02% アルシアンブルー、200 mM 塩化マグネシウム (MgCl₂)、および 70% エタノール
   1. 5 mLのアルシアンブルー染色液を調製するには、1 mLの1 M MgCl₂、3.5 mLの100%エタノール、および250 μLの0.4%アルシアンブルーストック(2 mLの70%エタノールに8 mgのアルシアンブルー)を250 μLの水に加え、よく混合します。
      注:最良の染色結果を得るには、染色液を新鮮に調製してください。
6. 漂白剤溶液:
   1. 3%過酸化水素(H₂O₂)と2%水酸化カリウム(KOH)を等量混合します。2 mLの漂白剤溶液を作るには、1 mLの3%過酸化水素と1 mLの2%水酸化カリウムを混合します。
      注:このステップを開始する前に、この溶液を新たに準備してください。H₂O₂ は光に弱いので、できるだけ光にさらされないように保護してください。H₂O₂ および KOH を取り扱うときは手袋を着用してください。
7. 溶液I:20%グリセロール+ 0.25%KOH
   注:グリセロールは粘度が高いため、慎重にピペットを打ってください。これらの溶液を準備するときは手袋を着用してください。
   1. 5 mLの溶液Iを調製するには、2 mLの50%グリセロールと625 μLの2%KOHを2.375 mLの水に加え、よく混合します。
8. 溶液II:50%グリセロール+ 0.25%KOH
   1. 5 mLの溶液IIを調製するには、3.570 mLの70%グリセロールと625 μLの2%KOHを805 μLの水に加え、よく混合します。
9. 保存液:50%グリセロール+ 0.1%KOH
   1. 5 mLの保存液を調製するには、3.570 mLの70%グリセロールと250 μLの2%KOHを1.180 mLの水に加え、よく混合します。
10. 3%アガロース
    1. 3 gのアガロースを100 mLの蒸留水に溶解します。溶液が透明になるまで電子レンジで加熱します。
11. 0.1% PBST(1x PBSで0.1%トゥイーン20)
    1. 1 Lの1x PBSを作製するには、1,000 mLの蒸留水に8 gのNaCl、0.20 gのKCl、1.44 gのNa₂HPO₄、および0.24 gのKH₂PO₄ を加えます。溶液を混合し、pHを7.4に調整します。500 mLの0.1%PBSTを作るには、5 mLの10%トゥイーン20を495 mLの1x PBSに加えます。
12. 0.50 μg/mL DAPI 溶液
    1. 10 mg/mLのDAPIストックを1x PBSで作ります。10 mLの0.50 μg/mL DAPI溶液を作るには、0.50 μLのストックを10 mLの1x PBSに加え、DAPIが完全に溶解するように激しく振とうします。
       注意: これらの溶液を準備するときは手袋を着用してください。DAPIは光に敏感であるため、光から保護します。DAPIストックは、4°Cで1年以上保存できます。

2.胚の採取

1. 胚が必要な前夜に繁殖水槽にオスとメスのゼブラフィッシュのペアを設置し、オスとメスの魚をバリアで隔てます。
2. 翌朝バリアを取り除き、バリアを取り除いてから15〜20分以内に胚を採取します。
   注:バリア除去のタイミングは、ゼブラフィッシュの胚と幼虫の病期分類に役立ちます。
3. 胚を28.5°Cで5dpfに達するまで育てます。
   注:E3培地は、2日に1回、28.5°Cで予熱されたE3の新しいバッチと交換してください。

3.アルシアンブルー染色

注:この実験を行うときは手袋を着用してください

1. 20 mLの微量遠心チューブ(MCT)で0.05%トリカインを使用して、20〜25匹の5日齢ゼブラフィッシュ幼虫を麻酔します。
2. 幼虫が動きを止めた後(通常は4〜5分かかります)、麻酔薬を取り出し、室温(RT)で1.5 mLの4%PFAでロッカーで60 rpmで2時間固定します。
3. ピペットを使用してできるだけ多くの固定剤を除去し、1.5 mLの50%エタノールをサンプルに加えます。RTで60rpmで揺らしながら10分間インキュベートします。
4. ピペットを使用してできるだけ多くのエタノールを除去し、1.5 mLのアルシアンブルー染色液を加えます。
5. 固定幼虫を染色液中で18〜20時間、ロッカー上でRTで60rpmでインキュベートします。
   注:インキュベートを短時間または長期間インキュベートすると、軟骨の特定の領域がそれぞれ染色不足または過剰染色になる可能性があります。ここでは、生後5日の幼虫の神経と内臓頭蓋を明確に視覚化するために、18〜20時間の染色が最も効果的であるように思われました。
6. 染色液を取り除き、1.5 mLの蒸留水を加え、RTのロッカー上で1〜2分間インキュベートします。
   注:このステップで染色を停止して、解剖された軟骨の細胞境界を視覚化できます。ただし、後続のクリアリングステップを実行せずにこのステップで染色プロトコルを停止することの欠点は、神経と内臓頭蓋の境界がわずかにぼやけたままであり、解剖を正確に実行することがより困難になることです。
7. 漂白剤溶液1 mLをサンプルに加え、プレートまたはウェルに蓋をかぶせずに、屋外でRTで20分間インキュベートします。
   注意: 過酸化水素と水酸化カリウムの反応により酸素ガスが発生し、閉じるとカバーが飛び出す可能性があるため、このステップではMCTを覆わないでください。
8. 漂白剤溶液を取り除き、次の組織の透明化手順を実行します。
   1. 1.5 mLの溶液Iをサンプルに加え、RTで60 rpmで40分間ロッカーに置きます。
   2. 溶液Iを取り出し、1.5 mLの溶液IIをサンプルに加え、ロッカーを60 rpmでRTで2時間保持します。
      注:クリアリングステップは余分な汚れを除去するのに役立ち、サンプルの光学的透明度を向上させ、解剖を効率的に実行するのに役立ちます。溶液を変更するときは、損傷が将来の形態分析に影響を与える可能性があるため、サンプルの取り扱いには注意してください。
9. 溶液IIを取り出し、1.5〜2mLの保存溶液を加えます。グリセロールの存在により、染色されたサンプルは10分以内に徐々に底に沈みます。
   注:染色されたサンプルは、4°Cで1年以上保存できます。

4.頭蓋顔面骨格の解剖

1. 3%アガロース溶液を電子レンジで溶液が透明になるまで溶かします。
   注意: 溶液がフラスコから泡立つ可能性があるため、過熱しないでください。この手順を実行する間は、ソリューションを注意深くチェックしてください。
2. ペトリ皿の深さの3分の1が覆われるまで溶融アガロースを注ぎ、固化させることにより、90 mmのペトリ皿に3%のアガロースをコーティングします。解剖はこのペトリ皿で行われます。
   注:アガロースコーティングを施したペトリ皿は、1週間前に準備し、4°Cで保存できます。 アガロースコーティングは、鉗子を損傷することなく解剖を行うことができる、より柔らかい基質を提供します。
3. 使用する鉗子を70%エタノールで洗浄し、標準的なラボ用ティッシュペーパーの清潔な部分で拭きます。
4. パスツールピペットを使用して、3〜4匹の染色幼虫を0.5 mLの保存液とともにアガロースでコーティングされたシャーレに移します。
   注:ストレージソリューションは、E3で同じことを行う場合と比較して、解剖を実行するための光学的鮮明さを保証します。
5. 染色された幼虫をその側面に向け(図1A)、鉗子を使用して幼虫の体から卵黄を慎重にこすり落とします
   注: 図1B は、卵黄が除去された胚を示しています。周囲に浮遊する粘着性のある卵黄の塊が解剖を妨げないように、さらなる解剖手順に進む前に、卵黄を掻き取った胚を新しいペトリ皿に移すことをお勧めします。
6. 卵黄を取り除いた後、片方の鉗子で幼虫の尾部を持ち、もう一方の鉗子を使って慎重に目を取り除きます。
   注: 図1C は、卵黄と目を切除した胚を示しています。目は頭蓋顔面骨格に近接すると解剖が妨げられる可能性があるため、注意して取り除く必要があります。
7. 鉗子を使用して、脳や神経頭蓋の背側にある他の組織を慎重に引っ張ってつまみ取ります。一方の鉗子で幼虫を静止させ、もう一方の鉗子を使用して中央を切開し(図1C、赤い矢印)、続いて組織をつまみ取ります(図1D)。
   注:このステップを実行するときは、軟骨が剥がれる可能性があるため、神経頭蓋の最前方の領域に近い組織を除去するように注意してください。
8. 幼虫の頭を体の他の部分から分離します。このステップ後の頭部領域には、主に神経頭蓋と内臓頭蓋が2点(前端と後端)で互いに付着し、これらの頭蓋顔面構造に付着したいくつかの小さな染色されていない組織が含まれています(図1E)。
   注:神経頭蓋と内臓頭蓋に直接付着している染色されていない組織を完全に除去することは困難です。一部の残留組織は存在しますが、それらの存在は染色されていないため、下流の形状やサイズの分析には影響しません。
9. 神経頭蓋と内臓頭蓋の間の2つの接続を慎重に切断して分離します(図1F、赤い破線)。無傷の胚と解剖された胚の両方の神経頭蓋と内臓頭蓋の画像については、 図2 を参照してください。
10. きれいなスライドガラスに、100%グリセロールを1〜2滴加えます。鉗子の助けを借りて、解剖された神経頭蓋または内臓頭蓋をこのスライドに慎重に移します。鉗子を使用してこれらの組織にカバーガラスをそっと置き、気泡が形成されないようにし、すべてのスライドのカバースリップをマニキュアで密封します。
    注:これらのスライドは、汚れを失うことなく4°Cで1年以上保存できます。

5. 篩骨板の寸法の定量化

1. 実体顕微鏡に取り付けられたカメラを使用して口蓋の画像を取得します(図2D)。科学グレードのカメラがない場合は、標準的なスマートフォンを実体顕微鏡に取り付けて画像を取得します。
2. 定量化のために、口蓋の画像をFIJI²²にロードし、ラインツールを使用して篩骨プレートの幅と高さをミクロン単位で測定し(図3A-Cを参照)、カメラのピクセル解像度を使用して寸法を決定します。
3. 篩骨プレートの周りに輪郭を描き、 分析 |セット測定 | 篩骨プレートの面積を取得するための領域(図3D、E)。

結果

ゼブラフィッシュの頭蓋顔面骨格は、受精後5日(dpf)までに完全に軟骨であるため、軟骨に豊富に存在するグリコサミノグリカンに結合できる塩基性色素であるアルシアンブルーを使用して染色することができます²³。これにより、軟骨が青色に染色され(図1)、ほとんどの学部の研究室で利用可能な標準的な実体顕微鏡を使用して、幼虫に存在する他の組織と区別できます。卵黄をこすり落とし(図1B)、目を切除すると(図1C)、それぞれ頭の背側と腹側から見ると、神経と内臓頭蓋をはっきりと視覚化できます(図2B、C)。次に、神経と内臓頭蓋を分離し(図2D、E)、目的の個々の頭蓋顔面軟骨を解剖して、形状と寸法を特徴付けることができます。

ディスカッション

頭蓋顔面奇形は、ヒトのすべての先天性欠損症の大部分を占めており、多くの場合、乳児の死亡率につながります。しかし、ほとんどの頭蓋顔面異常の根本的な病因はまだ解明されていません²⁵。頭蓋顔面構造はどの脊椎動物でも複雑であり、したがって、学部生の設定の観点から、最初の要件は、頭蓋顔面領域の異なる構造の一般的な概要を学生に提供する教育ツールを持つことです。ただし、そのような環境で哺乳類の胚にアクセスすることは、ほとんどの状況で実現不可能です。一方、ゼブラフィッシュは、小さな施設²⁶で維持するのが容易なモデルシステムとして機能し、幼虫の初期段階4で比較的はるかに単純な頭蓋顔面解剖学的構造で透明であるという追加の利点を有^する。

この研究で説明されているプロトコルは十分に確立されており、頭蓋顔面の形態形成に取り組んでいるほとんどのゼブラフィッシュ研究室で使用されていますが、特に学部の研究...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アガロース	ロンザバイオサイエンス	50004	シャーレのコーティング用
アルシアンブルー8G	シグマ・アルドリッチ	A3157	軟骨の染色用
塩化カルシウム二水和物	シグマ・アルドリッチ	12022	バッファーを作るために
カメラ	オリンポス	DP28	画像取得用
DAPIの	ロシュライフサイエンス	10236276001	核の標識用
エタノール	ハネウェル	32221	アルシアンブルーステイン用溶剤
フィジー			バージョン: ImageJ 1.54f
鉗子	デュモン	デュモン	解剖を行うため
グリセロール	MPバイオメディカル	193996	洗浄およびサンプルの取り付け用
過酸化水素	MPバイオメディカル	194057	漂白剤溶液の製造に
塩化マグネシウム六水和物	SARD バイオサイエンス	SBRC0217	バッファーを作るために
硫酸マグネシウム七水和物	シグマ・アルドリッチ	M2773	バッファーを作るために
MS-222(トリカイン)	シグマ・アルドリッチ	A5040	幼虫の麻酔用
塩化カリウム	シグマ・アルドリッチ	P9541	バッファーを作るために
水酸化カリウム	シグマ・アルドリッチ	484016	バッファーを作るために
リン酸カリウム一塩基性	シグマ・アルドリッチ	P0662	バッファーを作るために
塩化ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S3014	バッファーを作るために
リン酸二塩基性ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	71640	バッファーを作るために
実体鏡	オリンポス	SZX61	解剖を行うため
トゥイーン-20	ヒメディア	TC287	細胞透過性に使用される界面活性剤