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研究記事

多血小板フィブリンの成長因子の概日変動の評価:パイロット研究

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DOI:

10.3791/68902

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2025年10月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Periodontology, Faculty of Dentistry, University of Çukurova, 2Private Practice, 3Department of Biology, Faculty of Medicine, University of Çukurova

この記事について

サマリー

この研究では、PRF ベースの再生手順のタイミングを最適化することを目的として、多血小板フィブリン (PRF) からの成長因子放出の概日変動を調べ、コルチゾール レベルとの相関関係を調査します。

要約

多血小板フィブリン (PRF) は、歯科、特に軟組織と硬組織の再生、抜歯窩の治癒、歯周欠損の治療、副鼻腔増強術、粘膜歯肉手術において広範な臨床応用があります。PRFは、血小板由来の成長因子が豊富な生体材料で、シングルステップの遠心分離プロトコル によって 調製されます。この研究は、PRF 由来の成長因子が朝と夕方の間に概日変動を示すかどうかを評価することを目的としていました。20 人の健康なボランティアが参加し、それぞれ 08:00 に 3 つ、20:00 に 3 つ、計 6 つの静脈血サンプルを提供しました。各時点で、1 本のチューブを全血球計算に、1 本を血清コルチゾール分析に、もう 1 本を PRF 調製に使用しました (708 x gで 12 分間遠心分離)。PRF中の成長因子(IGF-1、PDGF、FGFR、VEGF、TGFβ-1)をELISAを用いて24時間と72時間で測定した。それらのレベルは時点間で比較され、血清コルチゾールレベルと相関しました。FGFRレベルは、夕方のサンプルでは24時間よりも72時間で有意に高かった。しかし、朝と夕方の間でIGF-1、PDGF、VEGF、TGFβ-1に有意差は見られなかった。コルチゾールレベルは、朝のサンプルでは72時間のPDGFと負の相関があり、夕方のサンプルでは72時間のIGF-1と負の相関がありました。ただし、他の有意な相関関係は観察されませんでした。これらの発見は、採血のタイミングが PRF 成長因子含有量に大きな影響を与えないことを示唆しており、サンプルのタイミングに関する臨床プロトコルの柔軟性を示しています。

概要

多血小板フィブリン (PRF) は、その自家起源、調製の容易さ、および生物学的に活性な含有量により、再生歯科で一般的に使用される第 2 世代の血小板濃縮物です1。抗凝固剤を使用せずに全血を遠心分離することによって形成されるPRFは、血小板由来成長因子(PDGF)、トランスフォーミング成長因子-ベータ1(TGF-β1)、インスリン様成長因子-1(IGF-1)、血管内皮増殖因子(VEGF)、線維芽細胞増殖因子受容体(FGFr)などの成長因子を分泌する血小板と白血球に富むフィブリンマトリックスを提供します。これらの生体分子は、細胞増殖、血管新生、細胞外マトリックスリモデリング、および組織再生において中心的な役割を果たします2。抗凝固剤と外因性活性化を必要とする多血小板血漿 (PRP) と比較して、PRF は、白血球と血小板が閉じ込められた生理学的フィブリン足場を生成する、抗凝固剤を含まない単一ステップのプロセスによって生成されます。このアーキテクチャは、成長因子とサイトカインのよりゆっくりとした持続的な放出をサポートし、取り扱いの複雑さとコストを削減しながら、創傷の安定性と早期の組織修復を強化する可能性があります 1,2。さらに、抗凝固剤や活性化剤がないため、操作に関連したばらつきが最小限に抑えられ、ネイティブの血小板挙動をよりよく維持できる可能性があり、チェアサイドでの使用とオペレーター間の標準化に実用的な利点をもたらします2。

PRF の生理活性成分の広範な臨床使用にもかかわらず、時間的ダイナミクスは十分に理解されていません。固有の 24 時間の生物学的サイクルである概日リズムは、免疫機能、ホルモン分泌、血液学的パラメーターなどのさまざまな生理学的システムに影響を与えます 3,4。主要な概日ホルモンであるコルチゾールは、早朝にピークに達し、一日を通して徐々に減少します5.重要なことに、血小板活性、凝集能力、および数も概日メカニズムによって調節される可能性があり、凝固と創傷治癒に影響を与える可能性があることが研究で示されています6。

PRF は末梢血から直接由来するため、採血の概日タイミングは、血小板の活性化状態と、その後のフィブリン重合中の成長因子の放出に影響を与える可能性があります。多血小板血漿中の血小板数と成長因子の日内変動は、以前にAotoらによって分析されましたが7、一日の異なる時間帯に調製されたPRFが成長因子組成に測定可能な違いを示すかどうかを体系的に調べた研究はありません。したがって、このパイロット研究は、健康な人から朝夕に収集されたサンプルを比較することにより、PRF 由来成長因子の概日変動を調査することを目的としています。さらに、各時点での血清コルチゾールレベルを評価し、PRF成長因子放出との相関関係を調べました。このような時間的変動を理解することは、臨床プロトコルの最適化に役立ち、PRF ベースの再生治療の標準化に貢献する可能性があります。この研究の帰無仮説は、採血の概日タイミングは多血小板フィブリン (PRF) から放出される成長因子の濃度に有意な影響を与えないというものでした。しかし、血小板活性とホルモン分泌の既知の概日調節に基づいて、当初は採血時間 (朝と夕方) が PRF 成長因子含有量を変化させる可能性があるという仮説が立てられていました。臨床的観点からは、PRF成長因子含有量が概日変動に敏感かどうかを明らかにすることは、再生プロトコルの標準化にとって重要です。成長因子の放出が一日を通してほぼ安定している場合、臨床医は静脈穿刺のタイミングが治療結果に実質的な影響を与えない可能性があることを安心できるため、手順のスケジュールを柔軟に調整できます。逆に、血管新生や組織修復に関与する要因など、選択された要因に微妙な違いが現れた場合、たとえば治癒状態が損なわれている場合など、最大の再生能が望まれる場合に採血のタイミングを最適化できます。

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プロトコル

この研究は、トルコのアダナにあるチュクロワ大学歯学部歯周病学科で、20 人の健康なボランティアが参加して実施されました。含める前に、すべての参加者に研究の目的、方法論、および手順について知らされ、書面によるインフォームドコンセントが得られました。倫理的承認は、チュクロワ大学医学部臨床研究倫理委員会によって付与されました (承認番号: 125/55、日付: 2022 年 9 月 16 日)。ヒトの血液を取り扱うための重要なバイオセーフティガイダンスや、バイオハザード物質や化学試薬の廃棄物処理指示を含むすべての手順は、NIH-CDCガイドライン8に従って実施されました。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。

1. 参加者の選定

研究に含まれる参加者は、18歳から25歳までの健康な人で、既知の全身疾患がなく、処置中に適切な協力を示した人でした。全身疾患がある場合、妊娠中または授乳中である場合、または血液学的またはホルモンパラメーターに影響を与える可能性のある薬物またはホルモン剤を使用している個人は除外されました。

2. 採血とグループ割り当て

各参加者から合計 6 つの 10 mL 静脈血サンプルが採取され、朝 (08:00) に 3 つ、夕方 (20:00) に 3 つが採取されました。無添加ガラス (10 mL) の滅菌 PRF チューブが研究に使用されました。午前のセッションでは、チューブ 1 を全血球計算 (CBC)、チューブ 2 を血清コルチゾール分析に、チューブ 3 を PRF 調製に使用し、その後成長因子分析を行いました。夜のセッションでは、チューブ 4 を CBC、チューブ 5 を血清コルチゾール分析に、チューブ 6 を PRF 調製と成長因子分析に使用しました。採血時間に基づいて、サンプルは 2 つのグループに割り当てられました: グループ 1 は朝の血液 (08:00) から調製された純粋な PRF で構成され、グループ 2 は夕方の血液から調製された純粋な PRF で構成されていました (20:00)。

3. PRFの準備

血液サンプルを、40°固定角ローターと10 mLガラス管を備えた遠心分離機を使用して、室温で708 x g で12分間遠心分離しました。使用された装置は、ローター半径が88 mmから110 mmの間で調整可能でした。この研究では、プロトコルを標準化するために半径 88 mm が選択されました。処置中は抗凝固剤は使用されませんでした。遠心分離後、得られたPRFを肉眼的に評価して、滑らかで均質な表面、弾性のある円筒形、およびコンパクトでしっかりとした粘稠度を特徴とする適切な形成を確保しました。

4. 成長因子ELISA分析

PRF血栓は、滅菌ハサミを使用して赤血球層から慎重に分離されました。各血栓の重量を量り、RPMI-1640培地を重量(g = mL)に基づいて1:1の比率で添加して、すべてのサンプルにわたるインキュベーション環境を標準化し、PRFマトリックスからの可溶性成長因子の一貫した拡散を確保しました。この比率により、血栓サイズに基づく比例抽出が可能になり、血栓質量が等しくないことによる成長因子濃度の変動が最小限に抑えられます。サンプルをオービタルシェーカーで100 rpmおよび3°Cで24時間および72時間インキュベートし、PRFマトリックスから培地への成長因子の均一な拡散を促進しました。インキュベーション後、上清を回収し、分析まで-8°Cで保存しました。成長因子濃度は、製造元の調製プロトコル9,10に従って、FGFR、VEGF、IGF-1、PDGF、およびTGF-β1を含む市販のELISAキットを使用して定量しました。

5. ELISAステップ

標準物質とサンプル(各100 μL)をウェルに加え、3°Cで90分間インキュベートしました。次に、ウェルを洗浄バッファーで3回洗浄しました。次に、100 μLのビオチン標識抗体を各ウェルに添加し、3°Cで60分間インキュベートし、さらに3回洗浄しました。次に、100 μLの西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)溶液を加え、3°Cで30分間インキュベートしました。さらに3回洗浄した後、100 μLの基質試薬を添加し、15分間インキュベートしました。最後に、各ウェルに50 μLの停止液を加え、450 nmで吸光度を測定しました。

6. 統計分析

カテゴリ変数は頻度とパーセンテージとして表され、数値データは必要に応じて平均値±標準偏差または中央値(最小値-最大値)として表示されました。数値変数の正規性は、Shapiro-Wilk 検定を使用して評価されました。正規性の仮定を満たさない変数、特に成長因子濃度とコルチゾールレベルは、対応のある比較のためのウィルコクソン符号付き順位検定や関連性のためのスピアマンの順位相関係数などのノンパラメトリック検定を使用して分析されました。すべての統計分析は、IBM SPSS Statistics ソフトウェアを使用して実行されました。p 値 <0.05 は統計的に有意であると考えられました。すべての比較は、個人間のばらつきを対照する対象内で実施されました。

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結果

ボランティア参加者 20 人全員 (女性 10 人、男性 10 人、年齢は 18 歳から 25 歳まで) は、サンプルの損失なしに研究を完了しました。全血球計算の結果により、血小板および血液学的パラメーターがすべてのサンプルで正常な基準範囲内にあることが確認され、PRF 調製の信頼性が検証されました。

朝と夕方の血液パラメータの比較
コルチゾールレベルは、生理学的概日リズムを反映して、夕方と比較して朝のサンプルで有意に高かった(p < 0.001)。白血球数は夕方のサンプルで高かった(p = 0.001)、赤血球、HGB、およびHCT値は朝に有意に上昇しました(すべてでp <0.001)。(表1)PLTまたはPDW値に有意差は観察されませんでした。ただし、MPV(p < 0.001)、PLCR(p = 0.002)、およびPCT(p < 0.001)は、夜間のサンプルで有意に増加しました。

コルチゾール、白血球、および血小板指数で観察された有意な概日差は、全身の生...

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ディスカッション

血小板活性とホルモン分泌の既知の概日調節に基づいて、当初は採血時間 (朝 と夕方) が PRF 成長因子の含有量を変化させる可能性があるという仮説が立てられていました。この研究は、そのような時間的変動が存在するかどうか、また存在する場合は、血清コルチゾールレベルおよび血液学的パラメーターと相関するかどうかをテストすることを目的としていました。この研究は、PRF 由来の成長因子放出における概日変動を調査するためのパイロット調査として設計されました。したがって、正式なサンプルサイズの計算は行われませんでした。ただし、事後検出力分析は、現在のサンプル (n = 20) が将来の研究の効果量を推定するのに十分な予備データを提供することを示唆しています。

その結果、ほとんどの成長因子(IGF-1、PDGF、VEGF、およびTGF-β1)は朝と夕方のサンプル間で有意差がなかったのに対し、FGFRレベルは72時間後に夕方のサンプルで有意に増加したことが示されました。これらの結果は、PRF由来の成長因子の放出が一...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
遠心分離機デュオ913023410238
ELISAキットファインテスト、武漢ファインバイオテック株式会社 IGF-1 (カタログ番号:EH0165)
ELISAキットファインテスト、武漢ファインバイオテック株式会社 PDGF(カタログ番号:EH3531)
ELISAキットファインテスト、武漢ファインバイオテック株式会社 FGFR(カタログ番号:EH0715)
ELISAキットファインテスト、武漢ファインバイオテック株式会社 VEGF(カタログ番号:EH0327)
ELISAキットファインテスト、武漢ファインバイオテック株式会社 TGF-&ベータ;1(カタログ番号:EH0287)
PRFチューブfigure-materials-16370

参考文献

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