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方法論記事

患者由来前立腺癌オルガノイドの確立と維持:詳細な実験プロトコル

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DOI:

10.3791/68912

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2025年11月14日

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1Department of Urology, Jiangnan University Medical Center (Wuxi No. 2 People's Hospital), 2Wuxi School of Medicine, Jiangnan University

この記事について

サマリー

前立腺がんの不均一性と治療抵抗性は依然として課題です。主要な親腫瘍の特徴を保持する患者由来オルガノイド(PDO)を生成するためのプロトコルについて説明します。この標準化されたモデルは、薬物スクリーニングと精密医療の進歩をサポートします。

要約

前立腺がん (PCa) は非常に不均一な悪性腫瘍であり、男性のがん関連死亡の主な原因であり、治療抵抗性と疾患の進行に対処する上で重大な臨床的課題を抱えています。2次元(2D)細胞株や患者由来異種移植片(PDX)などの既存の前臨床モデルには、腫瘍の不均一性、アンドロゲン受容体(AR)依存性シグナル伝達、微小環境相互作用など、PCaの複雑さを忠実に再現する上で限界があります。このギャップに対処するために、この研究は、親腫瘍の遺伝的、表現型、および組織学的特徴を保存する患者由来オルガノイド (PDO) を確立するための堅牢で再現性のあるプロトコルを提示します。この方法は、局所的および進行したPCaの両方からオルガノイドの培養を可能にし、疾患メカニズム、薬物反応、およびバイオマーカーの発見を研究するための生物学的に関連するモデルを提供します。この結果は、さまざまな臨床検体からオルガノイドを生成するプロトコルの能力を実証し、ハイスループットの薬物スクリーニングや精密医療に応用できます。この研究は、主要な技術的課題に対処する標準化されたワークフローを提供することで、前立腺がん研究を推進し、より効果的な治療戦略を開発するための多用途ツールとしての PDO の重要性を強調しています。

概要

前立腺がん (PCa) は、依然として世界中の男性に最も多い悪性腫瘍の 1 つであり、がん関連死亡率では肺がんに次いで 2 番目です。最近の疫学研究によると、PCa の世界的な発生率は着実に増加しており、前立腺がんの年間新規症例数は 2020 年の 140 万人から 2040 年までに 290 万人に増加すると予測されています1。早期発見の進歩と、アンドロゲン除去療法 (ADT) や標的薬などの新しい治療法の開発にもかかわらず、前立腺がんは、その不均一な性質と、特に進行期における治療抵抗性の避けられない発症により、依然として重大な臨床的課題となっています2。ADT 失敗後に発症する去勢抵抗性前立腺がん (CRPC) は、生存転帰が低く、治療選択肢が限られていることを特徴とする致死的な形態の疾患です3。したがって、疾患の進行と耐性を促進する分子メカニズムを理解することは、新しい治療標的を特定し、患者の転帰を改善するために非常に重要です。

ヒト前立腺がんの複雑さを正確に模倣する前臨床モデルの開発は、この分野の研究を進めるために重要です。従来の2D細胞培養は広く使用されていますが、in vivoで観察された細胞の不均一性、腫瘍構造、および微小環境を再現できません4。その結果、これらのモデルの翻訳的有用性は、特に腫瘍の進行、薬剤耐性、およびがん細胞と腫瘍微小環境との間の動的相互作用を研究するための限界があります5。対照的に、患者由来の異種移植片(PDX)とオルガノイド培養は、従来の細胞株と臨床腫瘍の間のギャップを埋めるより洗練されたツールとして登場しました4,5,6。

オルガノイド培養システムは、がんモデリングに革命をもたらしました。これらの三次元(3D)構造は患者の組織に由来し、元の腫瘍7,8,9,10の組織学的、ゲノム的、および表現型の特徴を保持することができます。重要なことに、前立腺がんオルガノイドは、ARシグナル伝達、治療に対する耐性、ゲノムの不安定性など、疾患の不均一性の重要な特徴を保持しており、トランスレーショナルリサーチに理想的なツールとなっています11。PDX モデルと比較して、オルガノイドは費用対効果が高く、拡張性があり、遺伝子操作に適しているため、ハイスループットの薬物スクリーニング、バイオマーカーの発見、機能研究が容易になります。オルガノイドプラットフォームは、結腸直腸がん、乳がん、膵臓がんなどの他の悪性腫瘍においてすでに有望な結果を示しており、個別化された腫瘍学の可能性を強調しています4,12。

ただし、前立腺がんオルガノイド (PCO) の確立と維持には、特有の技術的課題があります。前立腺上皮は本質的にアンドロゲンシグナル伝達と細胞外マトリックス (ECM) のサポートに依存しているため、特殊な培養条件が必要です。さらに、前立腺がんは、限局性ホルモン感受性腫瘍から非常に攻撃的で治療抵抗性のCRPCまで、幅広い臨床挙動を示し、再現性のあるオルガノイドシステムの開発をさらに複雑にします11,12。PCO 生成のプロトコルを成功させるには、組織処理、酵素消化、ECM 包埋、重要な成長因子、ホルモン、低分子の補給などの重要なステップを最適化することにより、これらの生物学的複雑さに対処する必要があります。このようなプロトコルは、オルガノイドの親腫瘍に対する忠実度を確保し、下流の分析での応用を促進するために不可欠です。

この研究では、PDO の確立と長期維持のための詳細で再現性のあるプロトコルを提示します。当社のワークフローは、組織の取得と生検および手術標本の処理から、オルガノイド継代、凍結保存、蘇生まで、プロセス全体に及びます(図1)。このプロトコルは、前立腺がん組織の表現型とゲノムの完全性を維持するように最適化されており、ゲノムプロファイリング、薬物反応試験、機能アッセイなどの幅広いアプリケーションに適した堅牢な3D培養システムを可能にします。特に、私たちの方法は、オルガノイド培養の成功率の低さ、最適ではない増殖、その後の継代の困難など、一般的な技術的ハードルに対処し、標準化されたガイドラインを提供することで、ラボ全体の再現性を促進します。

信頼性の高い前立腺がんオルガノイドモデルの開発は、基礎研究とトランスレーショナル研究の両方にとって非常に重要です13。これらのシステムは、疾患のメカニズムを解読し、新しい治療標的を特定し、個々の患者に合わせた精密医療アプローチを推進するための強力なプラットフォームを提供します。既存の技術的ギャップに対処し、包括的なプロトコルを提供することにより、私たちの研究は、前立腺がん研究におけるオルガノイド技術の採用を加速し、この困難な疾患と闘うための世界的な取り組みを支援することを目的としています14。

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プロトコル

この研究は、無錫市第二人民病院の医療倫理委員会によって審査および承認されました (承認番号: Y-38 (2023))。すべての参加者は書面によるインフォームドコンセントフォームを提出しました。患者データは、倫理基準に準拠したプライバシー保護を確保するために匿名化されました。

1. サンプル採取

  1. 組織取得
    1. サンプリング前の準備
      1. 包含基準: すべての参加者が、病理学的または画像検査によって決定された前立腺がんの診断が確定していることを確認してください。外科的切除、生検、またはその他の臨床標本から腫瘍サンプルを抽出します。前立腺がんの研究における他のがんからの潜在的な干渉を排除するために、すべての参加者が 18 歳以上であり、他の悪性腫瘍を患っていないことを確認してください。すべての参加者から、研究に参加するための書面によるインフォームドコンセントを収集し、サンプルを科学研究に使用できるようにします。
      2. 除外基準: サンプルに培養または分析に十分な腫瘍組織が含まれていない患者を除外します。同意を撤回した患者、または研究中に必要なサンプルを提供できない患者を除外します。
    2. 前立腺コア針生検サンプル:特殊な針を使用して前立腺組織からサンプルを採取します。組織をすぐに保存溶液(アドバンストDMEM / F-12(adDMEM / F-12)培地+岩石阻害剤溶液(1:2000希釈))に入れ、氷上の実験室に輸送し、24時間以内に送達できるようにします。
      注:前立腺癌組織を正確にターゲットにし、異なる解剖学的領域にわたってマルチサイトサンプリングを実行します。サイトごとに1〜2回の穿刺を実行し、それぞれ1cmのコアサンプルを≥生成します。
    3. 根治的前立腺全摘除術サンプル:収集後、サンプルを保存液(adDMEM/F-12培地+岩石阻害剤溶液(1:2000希釈))にすばやく入れ、氷上に輸送し、24時間以内に実験室に確実に届けます。
      注:根治的前立腺全摘除術15によって、より多くの組織断片を得ることができます。
      直径1g(≈5mm)≥サンプルを採取し、正常組織による汚染を最小限に抑えます。術前に臨床医と調整して、1) 腫瘍コアを指定します。2) 腫瘍周囲組織;3)通常の制御。灰黄色の変色のある固い破片を優先します。存在しない場合は、体系的なランダムサンプリングを実装します。サンプル収集情報については 、表 1 を参照してください。
  2. サンプル処理
    1. ラベル付けと分類: 収集した組織サンプル (患者名、入院番号、組織名、組織部位、組織の種類を含む) に明確にラベルを付けます。
    2. 凍結保存:組織サンプルを直ちに処理します(収集後≤12時間)。サンプルを予冷(4°C)保存液(adDMEM/F-12培地+岩石阻害剤溶液(1:2000希釈))に入れ、4°Cで保存します。 最適な結果を得るには、4〜6時間以内にさらなる実験ステップを進めてください。
  3. 輸送と保管
    1. コールドチェーン輸送: 低温条件下で組織サンプルを実験室に輸送します。
    2. サンプル登録:検査室に到着したら、患者の基本的な個人情報、組織の種類、名前、サンプリング部位などのサンプル情報を詳細に確認し、登録します。
  4. 検査室の受領と検査:
    1. サンプル検査: バイオセーフティキャビネット内のサンプルを開き、紛失、汚染、目に見える異常がないか検査します。
    2. サンプルの解剖:サンプルを抽出し、培養皿に入れます。組織はさみまたはメスを使用してサンプルを小片(約1〜3mm³)に分割し、その後の実験で使用します。

2. 実験手順

  1. 初代組織細胞懸濁液の調製
    1. 保存: 収集した組織ブロックを 50 mL の滅菌円錐遠心チューブに入れ、組織がタイプ別に分類されていることを確認します。各チューブに適切にラベルを付けます。組織が完全に水没するまで、保存液(adDMEM/F-12培地+岩石阻害剤溶液(1:2000希釈))を各チューブに加えます。さらに処理するまで、サンプルを4°Cで保存します。
      注:組織の種類には、腫瘍組織と非腫瘍組織の両方を含める必要があります。サンプルラベルには通常、医療記録番号を含める必要があります。
    2. 組織分離:滅菌ピンセットを使用して、前立腺がん組織サンプルを中型の培養皿に移します。2 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(D-PBS)で組織を2〜3回洗浄し、血液と破片を取り除きます。先端の細いピンセットを使用して、脂肪組織、筋肉、その他の非上皮成分を慎重に除去し、上皮領域のみを保持します。続いて、洗浄した組織をはさみで約1〜3mm³の小さな断片に刻みます。
      注:間質組織または脂肪組織を汚染すると細胞単離の効率と特異性が低下する可能性があるため、非上皮成分の完全な除去は下流のアプリケーションにとって重要です。微生物汚染のリスクを最小限に抑えるために、手順全体を通して無菌状態を維持します。
    3. 組織消化:準備した組織片を組織処理チューブに移します。腫瘍組織消化液 (表2) を各チューブに加えます。酵素的機械的解離のための中硬組織解離プログラムを使用して、消化装置(単一細胞懸濁液調製装置)を活性化します。
      注:消化プロトコルは次のとおりです:200 rpmで3秒間正回転、200 rpmで3秒間逆回転、300 rpmで4秒間正回転、300 rpmで4秒間逆回転、600 rpmで5秒間正転、600 rpmで5秒間逆回転、400 rpmで3秒間正転、 400rpmで3秒間逆回転します。このシーケンスは1つのサイクルを構成し、3回繰り返す必要があります。最初の2サイクルを完了したら、20rpmで約25分間ゆっくりと回転を続けます。期間は実験条件に基づいて調整される場合があります。組織を37°Cで40分から1時間消化します。
    4. 消化終了:FBSを添加したadDMEM/F-12培地を等量または2倍の容量を細胞懸濁液に加えて、酵素活性を終了させます。
      注:未消化の残留物が残っている場合は、上清を収集し、残基に新鮮な消化酵素を加え、37°Cでさらに15〜20分間消化を続けます。プロセスを定期的に監視し、両方の消化ステップからの細胞懸濁液を組み合わせます。
    5. ろ過:100 μmの細胞ストレーナーを1 mLのadDMEM/F-12培地で予湿らせ、細胞懸濁液をろ過します。組織処理チューブと細胞ストレーナーを、ロックインヒビター溶液(1:2000希釈)を添加した5 mLのadDMEM / F-12培地で2回すすぎます。濾液を50 mLの滅菌コニカル遠心分離管に集めます。懸濁液を70 μmストレーナーに通し、すべての細胞懸濁液を新しい50 mLチューブに集めます。
      注:ろ過ステップの数とストレーナーの孔径は、サンプルの特性に応じて調整できます。
    6. 赤血球溶解:採取した細胞懸濁液を200× g で25°Cで5分間遠心分離します。 上清を慎重に廃棄し、細胞ペレットを2 mLの赤血球溶解バッファーに再懸濁します。懸濁液を氷上で2〜3分間インキュベートします。
      注:赤血球溶解のインキュベーション時間は、溶解の効率に基づいて調整できます。長時間のインキュベーションは、細胞死の増加につながる可能性があります。他の細胞型に過度の損傷を与えることなく赤血球が完全に溶解されるように、サンプルを顕微鏡で監視することをお勧めします。
    7. 溶解を終了する:ロックインヒビター溶液(1:2000希釈)を添加したadDMEM/F-12培地6 mLを細胞懸濁液に加えます。混合物を15 mL滅菌コニカル遠心分離管に移し、200 x g で25°Cで5分間遠心分離します。 上清を捨てます。細胞ペレットを同じ添加培地で1〜2回洗浄し、最終細胞懸濁液を1.5 mLのエッペンドルフチューブに移します。
    8. 生存率評価:10 μLの細胞懸濁液を同量のトリパンブルー溶液と混合し、顕微鏡下で細胞生存率を観察します。
      注:大量の死細胞または破片が観察された場合は、計数を続行する前に、50 x g で25°Cで5分間低速遠心分離を実行して除去します。
    9. 細胞計数:ペレットを1 mLのadDMEM/F-12培地に再懸濁し、必要に応じて懸濁液を希釈し(通常は1:20希釈)、希釈した懸濁液6 μLを血球計算盤に置いて顕微鏡下で細胞をカウントします。
    10. 細胞ペレットの収集:200 x g、25°Cで5分間遠心分離します。最終細胞ペレットを1.5 mLのEppendorfチューブに集めます。

3. 初代細胞懸濁液からのオルガノイドの確立

  1. 播種: 細胞数に基づいてマトリックスゲルの必要量を決定します。事前に冷却したピペットチップ(-20°Cで保存)を使用して、適切な量のマトリックスゲルを細胞ペレットに注意深く移します。細胞とゲルの混合物を氷上で穏やかに混合し、気泡の形成を避けて、均一な播種と最適なマトリックスゲルの完全性を確保します。
    注:使用前にマトリックスゲルを4°Cで一晩解凍してください。早期ゲル化を防ぐために、ピペットチップやチューブを含むすべての取り扱いツールが事前に冷却されていることを確認してください。
  2. プレーティング:細胞マトリックスゲル混合物を低接着性の24ウェル培養プレートに分注し、1滴あたり約30 μLを塗布します。効果的な3次元(3D)構造形成をサポートするために、各液滴に10,000を超える細胞が含まれていることを確認してください。
    注:マトリックスゲルの過度の希釈は避けてください。構造的完全性を維持し、3D培養形成をサポートするために、マトリックスゲルは混合物の総体積の70%以上を構成する必要があります。ヒト生検および前立腺切除標本に由来するオルガノイドは本質的に同等であり、主に生存細胞収量が異なり、同一の播種密度がこのプロトコルで適用された。
  3. インキュベーション:培養プレートを37°Cの加湿インキュベーターに5%CO2 で5分間置き、マトリックスゲルを予備的に固化させます。プレートを反転させ、マトリックスゲルを3D形状に保つために20分間放置します。800〜1000 μLの培地(表3)を各ウェルに加えます。培地は2〜3日ごとに交換してください。
    注:3D構造を維持するために、反転ステップ中にマトリックスゲルが乱れていないことを確認してください。

4.オルガノイド継代

  1. オルガノイドの収集と調製:事前に冷却されたピペットチップを使用して、マトリックスゲルを機械的に破壊し、オルガノイドクラスターを断片化します。各ウェルをadDMEM / F-12培地+ロックインヒビター溶液(1:2000希釈)で1〜2回すすぎます。断片化したクラスターを培地とともに15 mLの滅菌コニカル遠心分離管に移します。200 × g で25°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
    注:オルガノイドが直径100μmに達したとき(通常は培養14日目)。過剰な培地の量が機械的破壊を妨げる場合は、クラスターを分解する前に培地の一部を吸引します。プレート表面に付着した残留マトリックスゲルについては、ピペットチップで優しくこすり落とし、adDMEM/F-12培地+ロックインヒビター溶液(1:2000希釈)で2〜3回すすいでください。すべてのすすぎは、最大の収量を得るために、最初のコレクションとプールする必要があります。
  2. オルガノイド解離:得られたペレットを2 mLの予熱した組換えトリプシン様酵素溶液に再懸濁します。上下にピペットで解離を開始し、37°Cで15〜30分間インキュベートします。小細胞クラスター(クラスターあたり約5〜6個の細胞)がフィールドを支配するまで、5分ごとに顕微鏡下で解離を監視し、次のステップに進みます。
    注:消化をタイムリーに終了することは、過剰解離を回避し、細胞生存率を維持するために重要です。顕微鏡で頻繁に観察することで、クラスター形成に最適なタイミングで消化が停止します。
  3. 消化を終了する:酵素活性を消光するために、ウシ胎児血清(FBS)を添加した等量または2倍の容量のadDMEM/F-12培地を添加して消化を終了します。200 x g で25°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
  4. マトリックスゲルの除去:ペレットを2 mLの細胞回収溶液に再懸濁し、4°Cで20〜40分間インキュベートして、残留マトリックスゲルを溶解します。200 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄し、adDMEM/F-12培地で洗浄を2回繰り返して、残留マトリックス成分を除去します。最終ペレットを1.5 mL滅菌エッペンドルフチューブに移し、さらなる処理を行います。
    注:低温インキュベーションは、細胞の完全性を維持しながら効果的なマトリックスゲル解重合のために重要です。早期の再ゲル化を防ぐために、寒冷環境の外での時間を最小限に抑えます。
  5. 播種と培養:手順3.1〜3.3で説明した手順に従って、解離したオルガノイドクラスターの再播種を続行します。最適な3D構造改質のために、適切な細胞密度とマトリックスゲル比を確保します。
    注:オルガノイド凍結保存、解凍、再包埋、および組織学的処理に関する詳細なプロトコルは、ご要望に応じて利用できます。

5. オルガノイド凍結保存

  1. オルガノイド収集:培養プレートをインキュベーターから取り外し、事前に冷却されたピペットチップを使用してオルガノイドヒドロゲル凝集体を機械的に解離します。解離した凝集体を培地とともに15 mLの円錐形遠心分離管に移します。ウェルをadDMEM / F-12培地で2〜3回すすぎ、洗浄液と一次懸濁液を組み合わせます。200 × g で25°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
    注:最大の収量を確保するには、過度の損傷を引き起こさずにオルガノイド凝集体を穏やかに破壊します。すべての洗浄は、収集プロセス中のオルガノイドの損失を減らすために、一次収集と組み合わせる必要があります。
  2. 酵素解離:2〜4 mLの予熱した組換えトリプシン様酵素溶液を円錐形チューブ内のオルガノイドペレットに加え、懸濁液を穏やかに混合します。懸濁液を37°Cで15〜20分間インキュベートします。解離プロセスを5分ごとに顕微鏡で監視します。
    注:必要に応じて、穏やかにピペットで、大きなクラスターをより小さな凝集体(クラスターあたり約5〜6細胞)に分解します。凍結保存には、過剰解離や細胞生存率の喪失を防ぐために、より短い消化時間が必要です。頻繁に観察することで、オルガノイドの完全性を維持するために適切な段階で消化が終了することが保証されます。
  3. 消化終了:同量以上のFBS添加adDMEM/F-12培地を添加して、酵素活性を停止します。200 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
    注:ペレットに残留マトリックスゲルがない場合は、凍結保存のためにステップ5.5に進みます。マトリックスゲルの汚染が続く場合は、手順5.4に進みます。
  4. マトリックスゲルの除去(オプション):手順4.4で概説した手順に従って、マトリックスゲルを除去します。ペレットを2 mLの細胞回収液に再懸濁し、4°Cで20〜40分間インキュベートします。200× g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄し、洗浄プロセスを1〜2回繰り返して、マトリックスゲルを完全に除去します。
    注:残留マトリックスゲルの除去は、解離した細胞のみが凍結保存されるようにするために重要です。不完全なゲル除去は、解凍時のオルガノイドの生存率と構造的完全性に影響を与える可能性があります。
  5. 凍結保存:細胞ペレットを1.5 mLのオルガノイド凍結培地に穏やかなピペッティングで再懸濁し、均一な懸濁液を確保します。懸濁液をクライオバイアルに移し、短期保存のために-80°Cで保存します。24時間後、バイアルを液体窒素に移して長期保存します。
    注: 細胞損傷につながる可能性のある不均一な凍結を防ぐために、凍結保存培地が細胞と完全に混合されていることを確認してください。バイアルは、長期保存を確保し、細胞の劣化を防ぐために、短期保管期間が終わったらすぐに液体窒素に移す必要があります。

6. オルガノイドの回収

  1. 凍結保存されたオルガノイドの解凍:オルガノイドを含む凍結バイアルを液体窒素または-80°Cの保管から取り出します。すぐにバイアルを37°Cの水浴に浸し、内容物が完全に解凍するまで穏やかに攪拌します。解凍が完了したらすぐに、予冷(-20°C)ピペットチップを使用してオルガノイド懸濁液を15 mL円錐遠心チューブに移します。
    注:凍結誘発性細胞損傷を最小限に抑えるには、迅速かつ均一な解凍が重要です。予冷されたピペットチップを使用して、移送中の早期加温やマトリックスゲルの形成を防ぎます。
  2. 凍結保護剤の除去:円錐形チューブの壁に沿って1〜2 mLのadDMEM / F-12培地を慎重に添加し、凍結保護剤を徐々に希釈します。反転してやさしく混ぜます。200 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
    注:突然の浸透圧シフトや機械的ストレスがオルガノイドの生存率を損なう可能性があるため、この段階では激しいピペッティングやボルテックスは避けてください。ゆっくりとした希釈アプローチは、細胞ショックを最小限に抑えます。
  3. 洗浄および再懸濁:1 mLの新鮮なadDMEM/F-12培地をペレットに加えます。予冷(-20°C)ピペットチップを使用して細胞を穏やかに再懸濁し、マトリックスゲルの早期接着を防ぎます。懸濁液を1.5 mLの微量遠心チューブに移します。
    注:洗浄中に低温を維持することは、その後のオルガノイド再形成を妨げる可能性のあるマトリックスゲル成分の熱誘発性再組み立てを防ぐために不可欠です。
  4. 収集:200 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。洗浄ステップを2〜3回繰り返して、残留凍結保護剤と汚染物質を完全に除去します。
  5. 播種と培養:実験のニーズに応じて調製されたオルガノイド培地に最終細胞ペレットを再懸濁します。ステップ3.1〜3.3で説明したプロトコルに従って播種を進め、3D構造の再確立をサポートするために適切なマトリックスゲル比率と細胞密度を確保します。
    注:解凍後の細胞生存率と回復は、穏やかな取り扱い、凍結保護剤の適切な希釈、および支持的な3Dマトリックスゲル環境の即時再確立に大きく依存します。

7. オルガノイド特性評価のための分析前処理

  1. オルガノイド採取:オルガノイドの直径が70〜100 μmに達したら凝集体を機械的に解離し、その後の培養のために培地を含む15 mLの円錐形チューブに移します。ウェルをadDMEM / F-12培地で2〜3回すすぎ、洗浄液をオルガノイド懸濁液と組み合わせます。200 × g で25°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
    注:小規模な収集(1〜2ウェルなど)の場合は、1.5 mLの微量遠心チューブを使用して、効率的な取り扱いを確保し、サンプルの損失を減らします。解離中にオルガノイド構造を破壊しないように注意してください。
  2. 再懸濁:ペレットを1 mLのadDMEM/F-12培地に再懸濁し、1.5 mLの微量遠心チューブに移します。200 × g で 25°C で 5 分間遠心分離し、上清を廃棄します。
    注: 凝集を防ぎ、後続のステップで均一な処理を容易にするために、遠心分離前にペレットが完全に再懸濁されていることを確認してください。
  3. 洗浄と固定:1 mLのD-PBSをペレットに加え、ピペッティングまたは反転で穏やかに混合します。200 × g で 25 °C で 5 分間遠心分離し、上清を廃棄し、洗浄ステップを 1-2 回繰り返します。ペレットを1〜2 mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定し、4°Cで一晩インキュベートします。
    注意: 残留媒体やその他の汚染物質を完全に除去するために、洗浄手順を慎重に実行してください。パラホルムアルデヒドへの固定は、その後の分析のためにオルガノイドの形態を維持するために重要です。
  4. 固定後の洗浄:サンプルを200 × g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。固定サンプルをD-PBSで2〜3回洗浄し、指でフリックまたは穏やかに反転させて穏やかに混合して、洗浄バッファーの適切な分布を確保し、オルガノイドの損失を防ぎます。
    注:過剰なパラホルムアルデヒドを除去し、免疫組織化学などの下流アプリケーションにおけるバックグラウンド染色を減らすには、適切な固定後洗浄が不可欠です。
  5. エタノール再固定:ペレットを1 mLの70%エタノール混合物に指で軽くリピンさせ、室温で20分間インキュベートします。200 × g で 4 °C で 5 分間遠心分離し、上清を廃棄します。
    注:この段階でのエタノール固定は、オルガノイドの完全性を維持し、包埋またはさらなる処理のためにサンプルを準備するのに役立ちます。不均一な固定を避けるために、エタノールに均一に懸濁してください。
  6. マトリックスゲルクリアランス(オプション):残留マトリックスゲルがペレットに残っている場合は、ステップ4.4で説明したプロトコルに従って除去します。このステップでは、ペレットを細胞回収液に再懸濁し、4°Cで20〜40分間インキュベートし、その後遠心分離と複数回の洗浄を行い、ゲルを完全に除去します。
    注:マトリックスゲルの除去は、残留ゲルが組織の切片化と分析を妨げる可能性があるため、下流の組織学的分析またはイメージングに特に重要です。
  7. アガロース包埋:オルガノイドエタノール固定中に96°Cで溶融させて、約6mLの2%アガロースを調製します。溶融したアガロース100 μLをオルガノイドペレットと混合し、気泡の形成を最小限に抑えます。混合物を金型に移し、4°Cで固化させた後、パラフィン包埋加工を行います。
    注意: 目詰まりを防ぐために、ピペットチップ(端がトリミングされた)を予熱します。アガロース包埋は、オルガノイド構造の保存を促進しながら、取り扱いや切片化を容易にします。均一な包埋と最適な組織切片化を確保するために、混合中の気泡の形成を避けてください。

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結果

患者由来前立腺癌オルガノイドの形態学的および動的成長特徴
患者由来の前立腺がんオルガノイドは、臨床処置中に採取された新鮮な腫瘍組織から確立することに成功しました。最初のオルガノイド形成は通常、培養後5〜7日以内に観察されました(図2)。明視野顕微鏡下では、オルガノイドは明確な形態学的特徴を示し、コンパクトで明確に定義されたスフェロイドまたは腺様構造を形成しました。腺癌サンプルに由来するオルガノイドは、より規則的な上皮様組織を示しましたが、より攻撃的または低分化型の腫瘍由来のオルガノイドは、しばしば不規則で緩く凝集したクラスターを形成しました。

特に、オルガノイドは元の腫瘍の構造的特徴を保存し、組織切片に見られる腺構造を厳密に模倣しました。オルガノイドは、サイズと細胞密度の両方が測定可能な増加を伴い、時間の経過とともに安定した増殖を示し、 in vitroでの適応と増殖が成功したことを示しています。真...

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ディスカッション

PCa 用の PDO の確立は、前臨床モデリングにおける重要な進歩を表しており、従来の 2D 細胞培養や PDX に比べて大きな利点をもたらします16。この研究で提示された方法は、元の腫瘍の組織学的、遺伝的、および表現型の特徴を忠実に再現するオルガノイドの生成を可能にします。ARシグナル伝達や細胞構造を含む腫瘍の不均一性を維持することにより、オルガノイドは、前立腺がんの進行、治療抵抗性、および個別化された治療反応を研究するための、より生物学的に関連性の高いプラットフォームを提供します17。限局性前立腺がんと進行性前立腺がんの両方からオルガノイドを培養できるため、さまざまな疾患段階への適用性が保証され、現在の前立腺がん研究における満たされていないニーズに対処します18。

このプロトコルの主な利点は、その再現性と拡張性にあり、ゲノムプロファイリング、ハイスループット薬物スクリー...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者らは、中国国家自然科学基金(助成金第82172831号)および江蘇省衛生家族計画委員会の重点研究プロジェクト(助成金第X20240121号)の支援に感謝する。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
83-01トクリス2939
adMEM/F12ギブコ12634010
バイオセーフティキャビネット済南新北西バイオテクノロジー有限公司
セルリカバリーソリューションコーニング354253
遠心分離機深圳瑞沃德生命科技有限公司M1416R
遠心分離機管南京iResearchバイオテクノロジー有限公司
カルトレックス・パスクリア BMR&D3533-010-02
カルトレックス低減成長因子 BME、タイプ2R&D3533-005-02
培養容器(24ウェルの低接着プレート)熱力学Nunc-174930-ZX
DHTイソレアグ521-18-6
電子天秤南京iResearchバイオテクノロジー有限公司
胎児用牛血清ギブコ10099141
グルタミンプラス-200mMR&DB90210
ヘペスR&D1254/10
加湿細胞培養インキュベーター(37°C、5% CO2)上海和天科学機器有限公司HY-160SY
アイスボックス南京iResearchバイオテクノロジー有限公司
中型培養皿アブシンABS7005
N21-MAXメディアサプリメント(50X)R&DAR008
N-アセチルシステインシグマA9165-5G
ニコチナミドR&D3533-010-02
ノルモシンインビボジェンアント-NR-2
ピペット補助ピペッティング装置南京ホットスポット科学機器有限公司
ピペット南京ホットスポット科学機器有限公司
プリモシンインビボジェンANT-PM-2
rhEGFR&D236-EG-01M
rhFGFR&D233-FB-025
rhFGF-10R&D345-FG-025
rhNogginR&D6057-NG-100
rhR-スポンディン1R&D4656-RS-100
SB 202190トクリス1264
単一セル懸濁準備装置後輪駆動DSC-400
ティッシュハサミ/メス南京iResearchバイオテクノロジー有限公司
TryplEエクスプレスギブコ126A04013
腫瘍解離キット、ヒトミルテニ・バイオテック130-095-929
ピンセット南京iResearchバイオテクノロジー有限公司
水浴常州中傑実験機器製造有限公司HH-600
Y-27632ジヒドロクロライドR&D1254/10

参考文献

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患者由来オルガノイドオルガノイド培養腫瘍組織の消化マトリックスゲルへの埋め込みオルガノイドの維持薬剤スクリーニング精密医療アンドロゲン受容体発現バイオマーカー探索
患者由来前立腺癌オルガノイドの確立と維持:詳細な実験プロトコル
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