方法論記事

多点チオフラビンT蛍光を用いた変異P53 V157F乳がん細胞における凝集しやすい挙動の検出

DOI：

10.3791/68921

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2025年12月30日

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1School of Medicine, I-Shou University, 2School of Chinese Medicine for Post Baccalaureate, I-Shou University, 3Department of Medical Science and Biotechnology, I-Shou University, 4Department of Biomedical Engineering, I-Shou University, 5Department of Pathology, E-Da Hospital, 6Department of Physical Therapy, I-Shou University, 7Department of Occupational Therapy, I-Shou University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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p53 V157F変異を持つHs578T乳がん細胞は、MCF7細胞に比べてチオフラビンT蛍光が有意に高く、タンパク質凝集の強化を示しています。多点蛍光測定は、βシート豊富な集合体の検出精度と信頼性を向上させ、がん研究における凝集しやすいp53変異の重要性と治療戦略の開発を強調しています。

要約

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TP53遺伝子によってコードされる腫瘍抑制因子p53は、ゲノムの安定性維持において中心的な役割を果たします。TP53変異、特にホットスポット変異は、ヒトがんの約50%に見られ、腫瘍抑制機能の喪失や機能獲得特性の獲得、例えばプリオン様構造への凝集を引き起こす可能性があります。

本研究では、Hs578T乳がん細胞におけるp53 V157F変異の凝集傾向を野生型p53を発現するMCF7細胞と比較して評価しました。タンパク質凝集は、チオフラビンT(ThT)染色と蛍光定量を96ウェルプレートアッセイで評価しました。細胞はThT/Hoechst溶液で染色され、洗浄後、定義された励起/放出パラメータのもとマイクロプレートリーダーで解析されました。単点および4点蛍光測定を用いた定量解析の結果、Hs578T細胞はMCF7に比べてThT蛍光強度が3.20倍から4.26倍増加し、βシートリッチまたはアミロイド様集合体のレベルが有意に上昇していることが示されました。多点測定により、井戸表面全体に広範かつ一貫したタンパク質集合体の存在が確認されました。これらの発見は、細胞ベースのアッセイにおけるタンパク質凝集を正確に検出するために多点プレートリーディングを用いることを支持しています。

概要

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腫瘍抑制タンパク質p53をコードするTP53遺伝子は、ヒトがんの約50%で変異しています1,2。これらの変異はp53の腫瘍抑制機能を無効化するだけでなく、特定のホットスポット変異ではプリオン様集合体の形成も促進します3,4。これらの凝集型の変異体p53は、抗がん治療に対する耐性の増加を含む機能向上特性を頻繁に獲得します5,6。したがって、どのp53ホットスポット変異が凝集しやすいかを特定することは、p53変異がんにおける効果的な治療戦略の開発を導く上で極めて重要です。

以前の研究では、頭頸部扁平上皮がん(HNSCC)および乳がん細胞株における特定のp53変異が強いチオフラビンT(ThT)染色シグナルを示し、凝集タンパク質の存在を示すことを観察しました。ThTはベンゾチアゾール系染料で、βシート豊富なアミロイド構造に特異的に結合し、結合時に蛍光が強化されます。例えば、p53 R175H変異を持つデトロイト562 HNSCC細胞株は強いThT蛍光シグナルを示しました。同様に、他の2つのHNSCC細胞株、TW01とHONE-1もp53 R280T変異を有し、顕著なThT染色11を示しました。これらの場合、ThTシグナルはp53と共局所化し、p53の集約存在を支持しました。

乳がん細胞では、MDA-MB-231(p53 R280K変異)およびT47D(p53 L194F変異)も強いThT染色を示し、p53/ThTの共局在は明確でした。対照的に、野生型p53を発現するMCF7細胞とMDA-MB-468細胞(p53 R273H変異)はどちらも弱いThTシグナルのみを示しました12。同様に、p53 V173L変異を持つOECM-1 HNSCC細胞はThT染色の低レベルを示しました10。

フィルタートラップアッセイ、透過式電子顕微鏡(TEM)、または集合特異的抗体による免疫染色など、他のタンパク質凝集検出方法と比べて、ThT蛍光分析にはいくつかの利点があります。非破壊的で迅速、生細胞および固定細胞の両方に適用可能で、広範な処理を必要としません。フィルタートラップアッセイは不溶性集合体を効果的に捕捉しますが、激しい変性を必要とし、ライブセル使用には適していません13。TEMは線維形態の直接的な可視化を提供しますが、労働集約的かつ低スループットです14。集合体特異的免疫染色は立体構造依存抗体を用いた 現地 検出を可能にしますが、抗体の利用可能性や特異性は制限されることがあります。これに対し、ThT蛍光は特に多点プレート読み取りと組み合わせることで、βシート豊富な構造やアミロイド様構造を検出するためのシンプルで定量的かつ空間的に信頼性の高いアプローチを提供します。

再現性には実用的な考慮も重要です。ThT蛍光はアミロイド濃度と線形相関し、広い濃度範囲(0.2〜500μM)で、ピーク信号は通常タンパク質によって20〜50μMで達成されます。ただし、ThT自己蛍光は≥5μMで現れることがあり、濃度が高いと凝集速度論に影響を与えることがあります。したがって、感度のバランスを取りつつ凝集プロセスへの潜在的な影響を最小限に抑えるために、一般的に10〜20μMの作動ThT濃度が推奨されます16。私たちのプロトコルでは、1,000倍ThTのストック(12 mM)を1:1,000で希釈し、約12の作動濃度を得ます。これはこの推奨範囲内に含まれます。

ThTはアミロイド線維に特徴的なβシート豊富なアミロイド構造に優先的に結合します。この特異性は、染料がアミロイド線維の交β構造と相互作用することに起因し、β鎖によって形成された表面がThTの結合部位を提供します。したがって、ThTはこのβシート豊富な構造を示さない他の誤った折りたたみや非アミロイド集合体を効果的に検出できない可能性があります17。したがって、ThTはアミロイド線維同定に有用ですが、検出された集合体の同一性と特異性を検証するためには、p53免疫蛍光との共局在や生物物理学的手法などの補完的な検証手法を用いることが望ましいです。

構造予測研究は、p53 V157F変異が野生型タンパク質よりも凝集しやすい立体構造を採用することを示唆しています。本研究では、凝集しやすいp53 V157F変異を持つHs578T乳がん細胞と野生型p53を発現するMCF7乳がん細胞間のThT蛍光シグナルを比較しました。多点プレートリーダーを用いたThT染色アッセイを用いて、野生型p53と比較してp53 V157Fの凝集傾向を評価しようとした。

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プロトコル

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1. 細胞シーディング

  1. 細胞の生存可能性を評価するために、10μLのトリパンブルーと10μLの再懸濁細胞を1xのDulbecco's Phosphate Buffered Saline(DPBS)に混合し、マイクロ遠心分離機チューブ内で十分に混合します。
  2. 混合物を10μLのカウンタースライドに投入し、自動セルカウンターで生セル数をカウントします。
  3. 生存能力カウントに基づき、1ウェルあたり30,000個の生存可能な細胞を96ウェルの培養皿にシードし、1つのウェルを非染色対照として、残りの3つのウェルを染色に使用します。

2. 孵化

  1. 培養皿をCO2 インキュベーターに入れ、37°Cで12時間培養します。

3. 新しいThT染色材の準備(1,000回)

  1. ThT粉末0.02g(20mg)を重さにし、脱イオン水5.0mLに溶かします。粉が完全に溶けるまでよく混ぜます。
    注:この調製剤は、最終濃度4 mg/mL、1,000倍ThTのストック溶液を生成します。これは12.5 mMに相当します(ThTの分子量は~318.85 g/molです。4 mg/mLの溶液は4 g/Lに相当します。4 g/Lを318.85 g/molで割ると0.0125 mol/L、または~12.5 mMとなります。

4. 核酸化染色剤を用いたThT染色バッファーの準備

  1. 染色液は1mLの1x DPBSに加え、均一になるように優しく混ぜて準備します。
    1. 新たに調製された1,000倍ThTストックを1μL加え、最終ThT濃度は12.5μM(1x)となります。
    2. 1 μLの1 mg/mL Hoechst 33342ストック溶液を加え、最終濃度は~1 μg/mL(=1.6 μM)となります。

5. 染色

  1. 各ウェルから培地を取り除きます。各染色井戸に準備済みのThT/Hoechst染色バッファー100μLを加えます。染色されていない制御に1倍DPBSを100μL加えます。

6. 孵化

  1. 皿を室温(25°C)の暗い場所に30分間置きます。

7. 洗濯

  1. 各ウェルから染色液を慎重に吸引または捨て、細胞単分子層を乱さないように注意してください。
  2. 各井戸に1×DPBSを100μL加え、任意の穏やかな30秒浸漬を許可します。
  3. DPBS洗浄液は慎重に吸引するか捨ててください。
  4. 洗浄を繰り返し、各ウェルに新鮮な1倍DPBSを100μL加え、再度30秒間の優しく浸けてからDPBS洗浄液を廃棄します。
  5. 2回目の洗浄後、各ウェルに新鮮な1x DPBSを100μL加えます。

8. 蛍光測定

  1. 蛍光信号を読み取る前に、96ウェルプレートのキャップを外してください。蛍光の測定方法は、単点読み取りまたは四点読み取りのいずれかで測定します。
  2. 96ウェルプレートをマイクロプレートリーダーに置き、以下の設定で蛍光を測定します: ThT蛍光:450 nmで励起、490 nmで放出; Hoechst 33342蛍光:360 nmで励起、460 nmで放出;読者設定:震え:読書の5秒前; リード指示:トップリード; 積分時間:140 ms; 読み取り高さ:1.00 mm;1 ウェルあたりのポイント数:1(終点)または4(井戸スキャン); ウェルスキャン設定:(密度設定:2;ポイント間隔:2.5)。

9. データ分析

  1. タンパク質の凝集を次のように計算します:
    figure-protocol-1
  2. MCF7細胞の比率を1(ベースラインコントロール)に設定してThT蛍光強度を正規化します。

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結果

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乳がん細胞におけるβシート豊富なタンパク質集合体の存在を調べるため、MCF7およびHs578T細胞株にThT染色を施し、その後蛍光定量を施しました。 図1に示すように、細胞は96ウェルプレートの4つのウェルにシードされ、そのうち1つのウェルは染色されていない対照群として指定されました。残りの3つの井戸は標準プロトコルに従ってThTで染色されました。蛍光は2つの方法で測定されました。(1)各井戸の中心から単点読み取り、(2)空間変動を考慮して各井戸内の4つの異なる位置からの信号を平均して得る4点読み取りです。定量解析により、両細胞株間でThT蛍光に顕著な差があることが示されました(図2)。単点読み取り法を用いた場合、Hs578T細胞はMCF7細胞と比較してThT蛍光強度が3.20±0.05倍増加しました(補足表S1)。染色されていないウェルからの平均背景蛍光は、その後の4点測定で信号から差し引かれました(...

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ディスカッション

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96ウェルプレートにセルをシーディングする際、パネルを優しく振ったり叩いたりしてセルを広げるのは必ずしも現実的でないため、ウェル表面全体に均一な分布を得るのはしばしば困難です。この不均一な分布は、井戸全体で信号強度の変動を引き起こす可能性があります。多点蛍光の読み取りでは、同じ井戸内の異なる領域間で有意なばらつきが見られ、このバイアスと、単一点のみを測定した場合に誤解を招く結果の可能性が浮き彫りになりました。したがって、単一の中心点に依存すると、シグナルの異質性を過小評価し、細胞株や処理条件下間のThT蛍光の微妙な違いが見えにくくなる可能性があります。このようなバイアスは標準偏差(SD)推定値を低くし、精度の誤った印象を与えることがあります。より信頼性が高く客観的なデータを得るために、ThT蛍光測定には多点読み取りアプローチを強く推奨します。この手法はウェル全体の信号を平均化し、固有のデータ変動をよりよく反映し、薬物処理によるものを含むタンパク質凝集の控えめな変化の検出感度を向上させます。多点分析は、弱い凝集傾向の評価や凝集抑制化合物の有効性を評価する際に特に有用です。...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者には利益相反を主張するものはありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、易州大学医学部基礎医療コアラボからの技術支援に感謝の意を表します。この研究は、E-DA病院[EDAHJ114001 C.C.へ]および台湾国家科学技術委員会[NSTC 112-2813-C-214-032-BからB.-H.へ]からの助成金によって支援されました。C]

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
96井戸培養プレートただPC396-0100
カウンタースライドインビトロジェンC10228
Countess II FL 自動セルカウンターサーモ・フィッシャー・サイエンティフィック AMQAF1000
dPBSただCC704-0500
エッペンドルフ管ただPC101-5000
ホエヒスト 33342AATバイオクエスト17530
スペクトラマックス iD3分子デバイス735-0391 
チオフラビンTシグマ・オルドリッチT3516
トライパン・ブルーインビトロジェンT10282

参考文献

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タグ

P53 T TP53 Hs578T

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