継続的な皮膚温度モニタリングによるほてりを調査するためのトレッドミルベースのマウスモデル

サマリー

この研究では、卵巣摘出術と運動誘発性熱発生および継続的な高解像度尾皮膚温度モニタリングを組み合わせることにより、更年期ほてりのマウスモデルを確立します。

要約

ほてりは閉経期の女性の生活の質を著しく損ないますが、根底にある神経メカニズムと効果的な治療法はほとんど理解されていません。この分野における大きな課題は、信頼性の高い動物モデルと継続的な皮膚温度モニタリングのための非侵襲的な方法が不足していることでした。ここでは、ほてりを研究するために、卵巣摘出術と運動誘発性熱産生を組み合わせたマウスモデルが開発されました。3Dプリントされたテールスリーブで固定されたテレメトリックロガーを使用して、ストレスのない状態でテールスキンの温度を継続的に監視しました。さらに、赤外線カメラは熱の生成と放散を監視する補完的な方法を提供し、体温のより包括的な評価を可能にしました。このモデルを使用して、卵巣摘出マウスはより高い皮膚温度上昇と低い深部体温を示し、閉経期に観察されるほてりの表現型を効果的に模倣することが判明しました。このアプローチは、ほてりモニタリングの正確なモデルを確立し、体温調節、神経科学、臨床更年期研究の研究者にとって価値があります。

概要

ほてりは更年期障害の最も一般的で破壊的な症状の 1 つであり、生活の質を著しく損ないます¹。これらのエピソードは、皮膚温度の急激な上昇とそれに続く深部体温の一時的な低下² を特徴とし、多くの場合、心拍数の増加、不安、めまいを伴います³。その重大な影響にもかかわらず、効果的な治療法は依然として限られており⁴、その根底にあるメカニズムをより深く理解する必要性が強調されています。

ほてりの研究における重要なステップは、体温調節機能障害を正確に再現する信頼性の高い動物モデルの開発です。現在、主なアプローチには卵巣摘出術 (OVX) が含まれており、皮膚と深部体温の変化を誘発します⁵。ただし、これらの変化は、ストレスや周囲温度の変動によって混乱する可能性があるため、一貫性がない^{ことがよくあります6。}さらに、散発的なほてりのようなイベントをキャプチャすることは依然として困難です。代替方法では、げっ歯類の急性皮膚血管拡張を引き起こすために薬理学的薬剤(センクチド、カプサイシン、タモキシフェン、またはナロキソンなど)を使用します^7,8,9。これらの化合物は急速で測定可能な皮膚温度上昇を引き起こしますが、その侵襲的投与と用量依存的な効果により、体温調節反応の解釈が複雑になります。さらに、薬物誘発性血管拡張が自然なほてりの生理学的状態を完全に再現するかどうかは不明のままです。したがって、より洗練された信頼性の高い動物モデルが緊急に必要とされています。

運動は体温の調節因子としてよく知られており、ヒトのほてり誘発に関連しています¹⁰。いくつかの研究では、マウスの強制運動を利用して、ほてりに似た放熱パターンを模倣しています11,12,13。このアプローチは温度変動を引き起こす非侵襲的な手段を提供しますが、特に赤外線サーモグラフィーを介して活動マウスの皮膚温度を監視することは技術的に困難です。さらに、ほてりのような症状を包括的に評価するには、尾(皮膚)と深部体温の両方を継続的かつ長期的に記録する必要があります。

これらの制限を克服するために、卵巣摘出術とトレッドミル誘発運動を組み合わせて、ほてりのような体温調節反応を確実に誘発する最適化されたマウスモデルが開発されました。実験では、8〜10週間のC57BL / 6Jマウスを標準条件(12:12明暗サイクル、22°C±1°C、50%±10%湿度)で飼育しました。さらに、3Dプリントされたテールスリーブで固定された遠隔測定温度ロガーは、自由に動くマウスのストレスのない連続的な尾温度モニタリングを可能にするように設計されています。熱の生成と放散に関する補完的なデータを提供するために、赤外線サーモグラフィーも組み込まれました。このモデルは、ほてりのメカニズムを調査し、潜在的な治療介入を評価するための貴重なツールとして機能します。

プロトコル

これらの方法は、マウスモデル用に設計されました。マウス研究は、復旦大学の施設動物管理および使用委員会 (2021JS0040) によって承認されました。プロトコルの実施前は、動物は実験動物の世話と使用に関するガイドに従って飼育されていました。この研究では、体重20〜23 gの8〜10週齢の雌C57BL / 6Jマウスを標準条件(12:12時間の明暗サイクル、22°C±1°C、50%±10%湿度)で飼育しました。試薬と使用する機器の詳細は 、材料表に記載されています。

1. 実験準備

1. 標準的な条件(12:12明暗サイクル、22°C±1°C、50%±10%湿度)で飼育された10〜10週間齢の雌マウスを、 自由に 餌と水で調製します。
2. マウスをOVX群と偽群(n = 5 /グループ)にランダムに割り当てます。発情周期の同期を助けるためのグループハウス。
3. トレッドミルプロトコルのセットアップ
   1. 接続したパソコンでトレッドミル制御ソフトウェア「TSE TreadMill (USB) 5.1.7_2」を開きます(図1)。
   2. メニューバーから [ ファイル] > [新しいファイルを初期化 ] を選択して、新しい実験ファイルを初期化します。
   3. 実行プロトコルをプログラムします。
      1. 最初のセグメントを0-0.17 m/sの0-20秒の加速度に設定します。
      2. 2番目のセグメントを0.17 m/sで20〜150秒の一定速度に設定します。
      3. 3番目のセグメントを設定します:0.17-0.25 m / sから150-170秒の加速度。
      4. 最終セグメントを設定します:170-600秒の定速を0.25 m / s^10,12で設定します。
         注:余分なストレスを避けるために、この実験では電気刺激を使用しないでください。

2. 発情周期のモニタリング

1. ピペットを使用して100 μLの滅菌PBSでフラッシングすることにより、毎日同じ時間に染色スライドに膣スワブを8日間連続して塗抹します。
2. スライド上のサンプルをヒュームフード内で24時間自然乾燥させます。
3. サンプルを室温で100%メタノールに短時間浸します。
   注意: メタノールは、吸入、摂取、または皮膚接触によって有毒です。換気の良いヒュームフードで使用し、ニトリル手袋を着用し、火花や炎を避けてください。
4. 市販の20×ギムザ染料をPBSを使用して1×に希釈します。
5. メタノール固定スライドを暗闇で1×ギムザで1〜2時間染色します。
6. 膣細胞診を調べて、これらの研究に基づいて発情期を決定します^14,15。
7. マウスが発情前にあるときに実験を進めます(図2B)。
   注:ストレスによるサイクルの乱れを避けるために、マウスを優しく扱ってください。疑似妊娠を防ぐために、ピペットチップを深く挿入しないでください。

3.卵巣摘出手術

1. マウスの体重を記録し、イソフルランでマウスを麻酔します。手術中は、動物の体温を維持するために加熱パッドを使用してください。
2. 後ろ足の前に背外側の毛を両側に剃り、70%エタノールとヨウ素で交互に3回消毒します。
3. 皮膚に長さ1cmの傍脊椎切開を行い、先端が鈍い器具を使用して皮膚を下にある筋肉組織から分離します。次に、筋肉壁を切開します。綿棒で卵巣の脂肪パッドを露出させます。
4. 縫合糸で卵巣血管を結紮します。外科用ハサミで卵巣を切除する¹⁶.
5. 層、筋肉、皮膚の切開部を非吸収性縫合糸で閉じます。手術部位の周囲の皮膚を生理食塩水で優しく洗浄し、乾燥した血液や残留した消毒剤スクラブを取り除きます。
6. 偽のコントロールの場合は、卵巣に触れずに脂肪パッドの一部を切り取ります。
7. 手術後7日間、マウスの健康状態を毎日監視します。
   注:麻酔プロセス全体を通して、マウスを約35°Cの加熱パッド上に置いてください。

4. コア温度ロガーの埋め込み

1. ロガーのプログラミングと初期化(補足図2)。
   1. 温度ロガーをドッキングステーションに垂直に挿入します。
   2. ソフトウェアメニューバーの[ レコーダー]>[接続 ]をクリックします。
   3. メニューバーから[ Edit > New Measurement Seq. Def. ]を選択します。
   4. 録音モードオプションから[ 複数の記録間隔] を選択します。
   5. 設定パラメータ:開始日:[YYYY-MM-DD HH:MM]、終了日:[YYYY-MM-DD HH:MM]、録画間隔:5分
   6. シーケンスに間隔設定を追加します。
   7. [ レコーダー]をクリックして>新しい測定シーケンスを開始します。
2. 麻酔下で、腹部の皮膚を剃り、消毒します。
   注:この腹温ロガー移植手順は、複数の手術を避けるために、OVX手術と一緒に実行できます。
3. 横隔膜の約1cm下に2cmの正中線の皮膚切開を行います。
4. 白線に沿って切開部を伸ばして腹腔を開きます。
5. コア温度ロガーを矢状面に沿って腹腔にそっと挿入します。
   注意: 正確な温度測定値を得るには、適切な配置が重要です。周囲温度が測定を妨げる可能性があるため、皮膚の近くに表面的な位置を置かないでください。
6. 5-0 非吸収性縫合糸を使用して腹部切開部を縫合します。
7. ヨウ素溶液で腹部を消毒します。
   注:回復中は動物を注意深く監視してください。マウスが完全に目覚めるまで、加熱パッドを使用して暖かい環境を維持します。

5. テールマウント温度ロガーアタッチメント

1. ロガーのプログラミングと初期化(手順4.1の手順を参照、記録間隔を2分に変更します)。
2. エタノールスワイプでテールをきれいにします。3Dスリーブを70%エタノールで消毒し、温度ロガーをスリーブ内に固定します。
3. スリーブに速硬化性接着剤を塗布します。ロガーをテールベースから1cmの位置に配置します(図1A)。ロガーの検出面が皮膚に密着していることを確認してください。移動の負担を最小限に抑えるために、ロガーが尾の腹側に固定されていることを確認してください。
4. 圧力をかけて2分間所定の位置に保持します。正確な配置のために必要に応じて、簡単な麻酔を使用してください。
   注: 配置後の尾の腫れやロガーの剥離を毎日監視してください。適切に取り付けられたデバイスは、少なくとも 3 日間は正常に保たれます。

6.トレッドミルの実行とデータ収集

1. ステップ1.3のプロトコルを使用して、ライトフェーズ中にマウスを3日間トレッドミルに順応させます。
   1. マウスを固定トレッドミルベルトに個別に置きます。環境探索と慣れのために10分間待ちます。
   2. プロトコルを実行します。
      1. [ 測定] ボタンをクリックします。[ 開始 ]をクリックして、トレッドミルを初期化します。
      2. [ プロファイルの開始] を選択して、プログラムされた実行プロトコルを開始します。
2. 実験の24時間前にテール温度ロガーを取り付けて、良好な慣れを図ります(ステップ5を参照)。
3. 実験日の明るい段階で走るトレッドミル:
   1. 運動の 10 分前に赤外線カメラを使用して 30 秒間ベースライン温度を記録します。深部体温は、埋め込まれた腹部温度ロガーを使用して同時に記録されます。
   2. ステップ1.3のプロトコルに従ってトレッドミルでマウスを実行します。
      メモ:マウスが600秒間連続して実行されることを確認してください。マウスが走り止まった場合は、ヘアブラシを使用して動き続けることを優しく促します。
   3. トレッドミルを走らせた後、マウスを清潔なケージに移します。運動後0分、5分、10分、15分で赤外線サーモグラフィー で 尾の温度を測定します。

7. データ分析

1. 赤外線および中心温度データの場合:
   1. ベースラインを運動前の平均温度として計算します。
   2. 各時点の ΔT (運動後の温度ベースライン) をプロットします。
2. テール温度ロガーデータの場合:
   1. 運動前の 10 分間の平均をベースラインとして使用します。
   2. 運動後 15 分間、2 分間隔で ΔT を計算します。

結果

信頼性の高い体温調節モニタリングシステムの開発

体幹と皮膚の温度を測定するための信頼性の高いモデルを確立するために、カスタム3Dプリントされたテールスリーブが、テールの基部から1cmの温度ロガーをしっかりと取り付けるように設計され(図1A)、運動によって引き起こされるほてりの熱放散を継続的かつ正確に測定できるようになりました。

このシステムにより、24時間の連続したテール温度監視が可能になりました(図1B)。記録されたデータにより、活動期(夜間)の温度が低く、休息(日中)の温度が上昇することを特徴とする明確な日周リズムが明らかになりました。特に、尾の皮膚温度は深部体温と良好な負の相...

ディスカッション

この研究は、更年期のほてりを調査するための実用的かつ定量的なマウスモデルを確立し、この分野の重大なギャップに対処します。卵巣摘出術と運動誘発性熱産生の統合は、ヒトのほてりの中核的な特徴、すなわち尾の皮膚温度の急激な上昇とそれに続く深部体温の低下を首尾に再現しています¹⁸。このモデルは、温度変化を増幅し、ほてり誘発の正確な時間的制御を可能にすることで、既存のアプローチの長所を組み合わせて拡張します。そのため、閉経期の体温調節の根底にある神経生物学的メカニズムを調査し、潜在的な治療介入を評価するための堅牢なプラットフォームを提供します。

テールマウント温度ロガーは、^{以前の研究で}一般的に使用されていた従来の有線コア体温モニターと比較して、いくつかの重要な利点を実証しました^6,19。まず、3Dプリントされたホルダーを介して安全に取り付けられる...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
動物用埋め込み型温度ロガー	スターオッディ	DSTナノT
C57BL/6Jマウス	ジェムファーマテック	N000013
ギムザ染色液	ビヨタイム	C0133
赤外線熱画像	バリオカム	VC HDヘッド 980
トレッドミルシステム	東 証	Treadmill_6M