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研究記事

NF-κbシグナル伝達カスケード の調節による 低酸素再酸素化による心筋細胞損傷におけるクロトーの保護的役割

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DOI:

10.3791/68946

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2025年12月5日

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Jinan Lixia District People's Hospital, 2Department of Nuclear Medicine, Jinan Central Hospital, 3Department of Infectious Diseases, Jinan Central Hospital, 4Department of Coronary Heart Diseases, Jinan Central Hospital

この記事について

サマリー

本プロトコルは、分子および機能的アッセイを用いて、H9C2心筋細胞におけるKlotho過剰発現の保護的役割を評価します。

要約

本研究は、低酸素/再酸素化(H/R)損傷を受けた心筋細胞におけるクロトーの保護的役割を調査することを目的としました。H9C2ラット心筋芽細胞を用いて、クロトー過剰発現レンチウイルスベクターをトランスフェクトした in vitro H/Rモデルが確立されました。細胞は6つの実験群に分けられました:対照群、H/R群、陰性群(NC)、クロトー過剰発現群、PDTC(NF-κB阻害剤)、およびクロトーとリポ多糖(LPS)で処理された組み合わせ群です。クロトー発現レベルは定量的リアルタイムPCRおよびウェスタンブロッティングによって決定されました。細胞生存率はMTTアッセイ で 測定され、アポトーシスはフローサイトメトリーを用いて評価されました。NF-κBシグナル伝達経路に関与するタンパク質の発現はウェスタンブロッティングで解析され、炎症性サイトカインの細胞発現は免疫蛍光染色で評価されました。クロトー過剰発現はH9C2細胞内のクロトーレベルを有意に上昇させ、細胞の生存率の向上、アポトーシスの減少、炎症性サイトカインの細胞発現の低下をH/R群と比較して示しました。ウェスタンブロット解析により、クロトー過剰発現およびPDTC処理により、p-P65/P65比の低下とp-IκBα/IκBαのレベル上昇が示され、NF-κBB経路の活性化が抑制されることが示されました。これらの効果はLPSとの共同治療で部分的に逆転しました。これらの結果は、クロトがNF-κBシグナル伝達を調節し、炎症を減らし細胞生存を促進することでH/Rによる損傷に対する心防御効果をもたらすことを示唆しています。このプロトコルは、心筋虚血再灌流損傷の分子メカニズムや、心臓炎症におけるクロトーの治療的潜在力を研究するための再現可能な方法を提供します。

概要

急性心筋梗塞(AMI)は主に虚血と再灌流によって引き起こされ、心筋低酸素/再酸素化(H/R)損傷のメカニズムに関する広範な研究が促されています。心筋H/R損傷の重要な側面は細胞アポトーシスであり、これはAMI 4,5の病理進行に大きく寄与します。

最近の研究では、核因子カッパB(NF-κB)シグナル伝達経路が、リポ多糖(LPS)などの刺激に対する炎症反応の調節を通じて心筋H/R損傷に関与していることが示唆されています6,7,8。NF-κBの活性化は、標準経路と非標準経路の2つの異なるメカニズムを通じて起こります。標準経路では、活性化はカッパBα(IκBα)阻害剤のリン酸化誘導による分解に依存しています。しかし、NF-κBサブユニットp65のリン酸化が、IκBαの分解とは独立してアポトーシスを促進する可能性もあると報告されています。クロトーは単一通過の膜貫通タンパク質で、リン酸塩とカルシウムの代謝を調節し、インスリンシグナル伝達を阻害します。新たな証拠は、Klothoが腎臓、海馬、加齢細胞など多様な組織でNF-κBの活性化を抑制し、炎症や組織損傷を緩和することを示しています(15,16,17)。これらの進展にもかかわらず、AMIにおけるKlothoの役割や心筋H/R損傷におけるNF-κB経路との潜在的な相互作用は、依然としてほとんど解明されていません。

方法論的観点から、H9C2ラット心筋芽細胞を用いた in vitro H/Rモデルは、酸素張力の制御、再現性、変動性の低減など、動物モデルに比べていくつかの利点を提供します。さらに、レンチウイルス媒介のクロトー過剰発現は、遺伝子発現の安定かつ効率的な調節を可能にし、その機能的影響を直接調査することを可能にします。これらのアプローチにより、プロトコルは実用的でコスト効率が高く、機構研究に利用しやすくなり、生 体内 実験の倫理的・物流的課題も回避します。

実用的な観点から、H9C2細胞は多くの心筋細胞様の特性を保持しているものの、成熟した心筋細胞の表現型を完全に模倣するわけではないため、心血管研究で広く利用されています。選択されたH/R状態(5時間の低酸素状態の後に1時間の再酸素化)は、 in vitroでの虚血再灌流損傷モデル化に一般的に用いられる範囲内に収まります。同様に、感染多数(MOI)が約100のレンチウイルス伝達は、管理可能な細胞毒性で効率的な過剰発現を達成するための標準的なアプローチです。これらの特徴はプロトコルの適用性を高めますが、 生体内 環境の不完全な再現などの制限も認識されるべきです。したがって、本研究はKlothoがH/R損傷から心筋細胞をどのように保護するかを探り、NF-κBシグナル伝達との相互作用を評価する再現可能なプロトコルを確立することを目的としています。

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プロトコル

H9C2ラット心筋芽細胞株(ATCC、CRL-1446)に関するすべての手技は、機関のバイオセーフティ規制に準拠して実施されました。本研究に直接関与した動物や人間の被験者はいませんでした。 図1 は実験設計および解析パイプラインのグラフィカルなワークフローを示しています。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 細胞培養

H9C2ラット心筋芽細胞株(ATCC, CRL-1446)は、デュルベッコ改良イーグル培地(DMEM、高グルコース、4.5 g/L)に10%胎児用牛血清(FBS)および10%ジメチルスルホキシド(DMSO)を補う冷凍培地を用いて液体窒素で凍結保存されました。回収のため、凍結バイアルは37°Cの水浴で2〜3分間急速に解凍され、すぐに予熱されたDMEMに移されました。培養培地は10%FBS、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLのストレプトマイシン、3.7 g/L 重炭酸ナトリウム、1 mMのピルビン酸ナトリウムで調製されました。細胞は5%のCO₂を含む加湿インキュベーターで37°Cで維持されました。すべての実験では、6番から20番の間のH9C2細胞が使用されました。初期のパッセージ(P20)は、パッセージ関連の表現型ドリフトを避けるために使用されませんでした。

2. H9C2細胞におけるクロトーのレンチバイラル過剰発現

EF1αプロモーターの制御下で全長ラットのKlotho(Kl)遺伝子をコードする第3世代の自己不活化レンチウイルスベクターを用いて、H9C2細胞内で安定した過剰発現を確立しました。この構成体には、可視化用のP2A-EGFPレポーター、転写安定性のためのウッドチャック肝炎ウイルス後転写調節要素(WPRE)および転写本安定性のための中心ポリプリン路(cPPT)要素、そして選択用にPGKプロモーター駆動のプロマイシン耐性カセットが含まれていました。レンチウイルス粒子は、HEK293T細胞内で、トランスファープラスミドをpsPAX2(gag/pol/rev)およびpMD2.G(VSV-G)プラスミドと4:3:1の比率でポリエチレンイン(PEI)を用いて共トランスフェクトすることで作製されました。DNA:PEI = 1:3、w/w)。上清液は48時間と72時間で採取され、3,000 × g で遠心分離で10分間清算され、0.45 μmのPES膜でろ過され、4°Cで2時間間25,000 × g で超遠心分離で濃縮されました。 ウイルスペレットは1%の牛血清アルブミン(BSA)を含むPBSに再懸濁され、機能的滴価(TU/mL)は72時間後にEGFPの測定でHEK293T細胞の希釈感染制限を測定しました。H9C2セルは6ウェルプレートに2個×10個5 セルずつシードされ、トランスデュクション時には約60%のコンフルンスが得られました。レンチウイルス粒子は感染多数100で、感染効率を高めるためにポリブレン(8μg/mL)を補給した新鮮培地1mLに添加されました。接種は12時間後に取り除かれ、2mLの完全培地に置き換えられました。感染後72時間で、蛍光顕微鏡下のEGFP蛍光により伝達効率が検証されました。安定した細胞株の確立のために、感染後48時間から3〜5日間、48時間ごとに培地交換を行い、プロマイシン(2 μg/mL、事前滴定)を適用しました。クロトーの過剰発現はRT-qPCRおよび免疫ブロッティングによって確認されました。すべてのレンチウイルス施術はバイオセーフティレベル2(BSL-2)の封じ込め下で行われ、すべてのウイルス廃棄物は処分前に少なくとも30分間10%漂白剤で不活化されました。

3. 実験グループ

H9C2細胞は6ウェルプレート(成長面積9.6 cm²)に3つの× 10⁵セルでシードされ、24時間後に約70%〜80%の合流率を得ました。これは低酸素・再酸素化(H/R)処理およびその後のアッセイに必要な密度です。一晩の付着後、細胞は6つの実験群に分けられました:(1) 追加処理を受けていない対照群;(2) H/R群は、密閉されたモジュール式低酸素チャンバー内で低酸素/再酸素化(H/R)を受け、その後5時間の低酸素(1% O₂、94% N₂、5% CO₂)および1時間の再灌流(5% CO₂)にさらされた。前述の通り 18;(3) 陰性対照群(NC)群:H/R処理の24時間前に空ベクターで細胞をトランスフェクトしたグループ;(4) クロトー群(H/R処理の24時間前にレンチウイルスベクターをトランスフェクトした細胞)、(5) ピロリジンジチオカルバミン酸治療群(PDTC)、H/R治療19の24時間前に24時間にわたり200 mg/L NF-κB経路阻害剤PDTCで処理された。(6) Klotho + LPS群。細胞はKlothoをコードするレンチウイルスベクターをトランスフェクトし、その後1 mg/Lでリポ多糖で24時間処理した後、H/R処理20を行った。

4. qRT-PCR

H9C2セルは6ウェルプレートに1ウェルあたり1個×10⁶セルの密度でシーディングされました。処理後、フェノール-クロロホルム抽出プロトコルを用いて全RNAを単離しました。簡単に、1井戸あたり1mL試薬を加え、その後クロロホルム抽出、イソプロパノール沈殿、75%エタノール洗浄が行われました。RNAペレットは空気乾燥させられ、RNaseフリーの水に溶かされました。RNA濃度と純度は分光光度測定法で決定されました。cDNA合成では、メーカーのプロトコルに従い、市販の逆転写キットで全RNA1μgを逆転写し、ゲノムDNA除去やランダムヘキマープライミングも含まれていました。定量的リアルタイムPCRは、SYBRグリーン化学を用いたリアルタイムPCRシステムで以下の条件下で実施されました:95°Cで30秒の初期変性、その後95°Cで5秒、60°Cで30秒の40サイクル。プライマー配列はPrimer-BLAST(NCBI)を用いて設計され、商業サプライヤーによって合成されました:(1) Klotho: F 5′-TAAGGTTCAAGATGGAGAC-3′, R 5′-GGGCGTTCACACTTATTAT-3′;(2) βアクチン(内部制御):F 5′-TGTCACCAACTGAGGACGATA-3′、R 5′-GGGGTGTGAAGGTCTCAAA-3′。相対発現レベルは2^-ΔΔCT法を用いて計算され、増幅特異性は単一の融解曲線ピークによって確認されました。

5. ウエスタン・ブロット

H9C2細胞からタンパク質は、放射免疫沈殿アッセイ(RIPA)バッファー(6ウェルプレートのウェルあたり200μL)と、氷上のプロテアーゼ阻害剤カクテルを補足して抽出しました。タンパク質濃度はビシンコニン酸(BCA)アッセイで測定され、1レーンあたり同量(20〜30μg)を10% SDS-PAGゲルに負荷して電気泳動分離を行いました。タンパク質は、100 Vの湿式トランスファー系で4°Cで90分間、ポリビニリデン二フッ化物(PVDF)膜に移されました。 膜はTBSTで調製した5%無脂肪ミルクで室温で1時間ブロックし、その後4°Cで一晩、Klotho(1:500)、リン-p65(1:500)、p65(1:500)、リン-IκBα(1:500)、IκBα(1:500)、β-アクチン(1:1000)に対する一次抗体とともに培養しました。TBSTで3回洗浄した後、膜はホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体(1:1000)で室温で1時間培養しました。タンパク質バンドは強化された化学発光検出システムで可視化され、信号強度はImageJソフトウェアで同一の閾値設定で定量されました。

6. MTTアッセイ

H9C2細胞は、1ウェルあたり2×10³の密度で、100μLの完全な培地で96ウェルプレートにシードされ、付着を確保するために一晩培養されました。各ウェルに10μLのMTT溶液(PBS中の5 mg/mL)を加え、5% CO₂の加湿条件下で37°Cで4時間培養しました。培養後、上澄液を慎重に除去し、100μLのジメチルスルホキシド(DMSO)を加えてホルマザンの結晶を溶解させ、その後室温で10分間優しく振って培養しました。その後、マイクロプレートリーダーを用いて490 nmの吸収を測定しました。予想される視覚的結果は、DMSO添加前の生存細胞内に紫色のフォルマザン結晶が現れ、溶解後は均質な紫色溶液が現れることでした。

7. フローサイトメトリー

細胞は処理後24時間でトリプシン化で採取され、1,500 × g で遠心分離法で4°Cで5分間採取されました。 細胞ペレットは100 μLの1×結合バッファー(10 mM HEPES、140 mM NaCl、2.5 mM CaCl₂、pH 7.4)に再懸濁されました。アネキシンV-APCとヨウ化プロピジウム(PI)を1:2の比率で混合し、15μLの染色溶液を製製し、これを細胞懸濁液に加えました。混合物は室温の暗い環境で10分間培養されました。インキュベーション後、同じ結合バッファー400μLを追加し、サンプルはすぐにフローサイトメーターで分析されました。1サンプルあたり合計10,000件の事象が収集されました。データはFlowJoソフトウェアを用いて分析されました。細胞はまず前方散乱(FSC)と側散乱(SSC)に基づいて破片を排除し、その後、生存可能な細胞(Annexin V-/PI-)、初期アポトーシス細胞(Annexin V+/PI-)、後期アポトース/壊死細胞(Annexin V+/PI+)を区別するために、アネクシンVとPIの四分円ゲートが行われました。アネクシンV陽性/PI陰性染色は早期アポトーシスを示し、Annexin V/PIの二重陽性染色は後期アポトーシスまたは壊死を示しました。

8. 免疫蛍光

H9C2細胞は、6ウェルプレートの無菌ガラスカバースリップに1ウェルあたり1 ×10⁵セルの密度で播種され、処理を受けました。細胞は室温で4%パラホルムアルデヒドで15分間固定され、PBSで0.1%トリトンX-100を10分間透過させ、室温でPBSで30分間ブロッキングされました。コバースリップは4°CでTNF-α(1:200)、IL-1β(1:200)、IL-6(1:100)に対する一次抗体とともに一晩インキュベートされました。PBSで3回洗浄した後、細胞はフィコエリスリン(PE)標識された二次抗体(1:500)と共に室温暗い環境で1時間インキュベートされました。核はDAPIで5分間カウンターステインしました。カバースリップはアンチフェードマウントメディウムを用いたガラススライドに取り付けられ、蛍光顕微鏡で蛍光信号を可視化しました。画像はImageJ(バージョン1.54)で解析されました。赤色蛍光はサイトカイン発現を示し、青色蛍光は核を示しました。

9. 統計分析

すべてのデータはSPSSソフトウェアで解析されました。結果は少なくとも3つの独立した実験からの平均±標準偏差(SD)として表されます。複数群比較では、一方移動分散分析(ANOVA)とTukeyの事後検定を適用しました。 P値は0.05<統計的に有意とされました。

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結果

クロトー過剰発現は細胞生存率を向上させ、NF-κB介在性炎症損傷を軽減します

遺伝子送達の効率を確認するために、クロトー発現をmRNAおよびタンパク質レベルの両方で定量化しました。クロトー過剰発現細胞は、低酸素/再酸素化(H/R)および陰性対照群と比べて強く増加した(p < 0.05; 図2A、B)。機能的には、クロトーの過剰発現はH/R損傷後の細胞生存率を有意に高めました(p < 0.05; 図2C)そして、フローサイトメトリー(p < 0.01)で示されたように、著しくアポトーシスが減少していることが示されています。 図2D)。さらに免疫蛍光染色により、H/RはTNF...

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ディスカッション

本研究では、低酸素症/再酸素化(H/R)損傷にさらされた心筋細胞におけるクロトーの保護的役割が調査され、クロトーの過剰発現が細胞生存率を有意に改善し、アポトーシスを減少させ、炎症性サイトカイン発現を抑制することが明らかになりました。これらの効果はp65のリン酸化の減少とIκBαのリン酸化の強化を伴い、NF-κBシグナルの阻害が保護表現型に寄与していることを示唆しています。PDTCによるNF-κBの薬理学的阻害はKlothoの過剰発現と同様の効果をもたらし、一方でLPSによる刺激はKlothoの効果を部分的に逆転させ、KlothoとNF-κB調節の機構的関連をさらに支持しました。これらの発見は、他の組織での21,22,23,24,25の報告と一致しており、クロトが心筋保護に果たす可能性を拡張しています。

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開示事項

著者には利益相反を主張するものはありません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4% パラホルマルデヒドバイオシャープXG1050
Annexin V APC/PI 染色ソリューションエラブサイエンスE-CK-A217
cDNA合成キットキアゲン205410
DAPIソリューションバイオフロックス1155MG010
ダルベッコ改良型イーグル中型(DMEM)ハイクローンSH30243.01B
ECL検出試薬キットメイルンビオMA0186-1
電気泳動電源(POWER PAC 200)バイオ・ラッドパワーパック200
胎児用牛血清(FBS)ビバセルC04001-500、C04002-500
フローサイトメーター(ガリオス)ベックマン・カウルターガリオス
蛍光顕微鏡(BK6000)重慶オプテックBK6000
フォルマザン溶剤ソーラービオM1020
HRP結合ヤギ抗ウサギIgG抗体ベチルA120-101P
LPS(NF&カッパ;B パスウェイ アゴニスト)シグマ・オルドリッチL2630
マイクロプレートリーダー(モデルK3)熱力学K3
モジュール式インキュベーターチャンバー(低酸素チャンバー)ビラップス・ローテンベルクMIC-101
MTTソリューションケイマン21795
PDTC(NF&カッパ;B経路阻害剤)シグマ・オルドリッチP8765
PE結合ヤギ抗ウサギIgG抗体バイオスbs-0295G-PE
ポリブレン(ヘキジメトリン・ブロミド)インビトロジェンX2351
PVDF膜メルクISEQ00010
ウサギ抗ネズミIL-1&β;抗体バイオバイトオーブ378927
ウサギ抗ネズミIL-6抗体ゼンバイオ384702
ラビット・アンチ・ラットI&カッパ;Bα抗体バイオバイトorb223182
ウサギ抗ネズミクロトー抗体バイオバイトオーブ333711
ウサギ抗ラットp65抗体バイオバイトORB229138
ラビット・アンチ・ラット・ホスフォ・I&カッパ;Bα抗体バイオバイトオーブ223035
ラビット・アンチ・ラット・リン・NF-&カッパ;B p65抗体バイオバイトオーブ304662
ラビット・アンチ・ラットTNF-&α;抗体バイオバイトオーブ106548
ウサギ抗ネズミ抗体&βアクチン抗体華比オET1702
リアルタイム定量PCRシステム(LightCycler 96)ロッシュライトサイクラー96
RIPA溶解バッファームレダMO52447
SDS-PAGEジェル調製キットエラブサイエンスE-IR-R305
トリゾル試薬キットライフ・テクノロジーズ15596-018

参考文献

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