高密度リポタンパク質特異的リン脂質流出アッセイ

サマリー

本明細書では、ヒト血漿または血清全体に存在する高密度リポタンパク質(HDL)によって脂質ドナー粒子から特異的に除去された蛍光リン脂質の量を測定するためのプロトコルについて説明します。HDL 機能のこの指標が心血管疾患の発生を予測することを示しました。

要約

高密度リポタンパク質 (HDL) コレステロール (HDL-C) の血漿レベルは、現在、心血管疾患 (CVD) リスクの臨床評価の重要な指標です。HDL を介した細胞からのプラーク脂質の除去および動脈壁の細胞外沈着物は、CVD リスクとの逆相関を説明する可能性のある HDL のいくつかの抗アテローム発生機能の 1 つです。HDL を介した細胞性コレステロールの in vitro 除去 は、HDL-C よりもさらに優れた CVD リスクの予測因子であることが最近証明されています。

HDLは、さまざまな機能を実行する不均一な粒子集団で構成されています。アテローム性動脈硬化性プラーク脂質の除去に関与するHDL粒子には、交換可能なアポリポタンパク質(主にアポリポタンパク質A-I)が含まれており、粒子から解離してプラーク脂質を除去します。新生HDLは、HDL由来の交換性アポリポタンパク質によるABCA1生成細胞原形質膜ドメインからのリン脂質とコレステロールの両方の可溶化と除去によって形成されます。このプロセスは、アテローム性動脈硬化性プラークの予防と退行の両方において重要な役割を果たします。

ここでは、無細胞HDL特異的リン脂質流出(HDL-SPE)アッセイのプロトコルについて説明します。このアッセイは、脂質供与粒子からの非交換性蛍光リン脂質のHDLアポリポタンパク質を介した除去を具体的に測定します。私たちの症例対照臨床研究では、HDL-SPEアッセイは、放射性コレステロールを頻繁に利用する手間がかかり、技術的に複雑なアッセイである「ゴールドスタンダード」の細胞ベースのコレステロール排出能力アッセイと同等、あるいはそれ以上に優れた性能を発揮することが確立されています。

このプロトコルの目的は、基礎研究者と臨床研究者が同様に、シンプルで標準化された無細胞ハイスループットアッセイを使用して、脂質動員におけるHDLの機能を評価できるようにすることです。このアッセイは、基礎研究者がHDLを介した脂質流出の根底にあるメカニズムの洞察を得たり、HDL機能を強化する新しい治療薬をスクリーニングしたりするために使用できます。HDL-SPE は、CVD リスク評価のための臨床検査診断アッセイとしても機能します。

概要

高密度リポタンパク質特異的リン脂質流出(HDL-SPE)アッセイは、HDL機能を測定し、生物医学研究および臨床診断検査室で使用して、(i)アテローム性動脈硬化病変からのHDLを介した脂質除去の根底にあるメカニズムについてさらなる洞察を得ること、(ii)臨床CVDリスク評価を改善するための新しいプラットフォームとして機能し、(iii)心血管疾患を治療するための新しい治療法を開発することを目的としています。

HDL コレステロール (HDL-C) は CVD リスク¹ の重要な決定要因ですが、HDL-C レベルの上昇 (>80 mg/dL) が CVD リスクの増加と関連している限り、その有用性は損なわれます 2,3,4,5。HDL-C レベルの上昇は、動脈プラーク脂質を除去する能力が低下した機能不全の HDL の蓄積を表している可能性があります⁶。

細胞性コレステロール排出能力 (CEC) アッセイは、HDL 機能を測定するために開発された最初の in vitro アッセイです。このアッセイでは、通常、³Hコレステロールまたは蛍光ボディコレステロールで標識された培養マクロファージ(マウスまたはヒト)を、apoB枯渇血漿または血清でインキュベートします。コレステロール流出率は、細胞および培地に関連する蛍光/^放射能の量に基づいて計算されます^7,8,9。CEC アッセイは、HDL-C⁷ よりも CVD の発生予測因子として優れていることが示されています。CECアッセイは、主に細胞培養の要件と長期(日数など)のため、日常的な臨床診断アッセイへの変換には適していません。さらに、CECアッセイは、その固有の変動性(例えば、異なる種類の細胞、標識技術、およびHDL組成を変化させるβリポタンパク質のPEG枯渇)によって制限されます¹⁰)。

いくつかの研究グループは、HDL機能に関する新しい洞察を得るためのツールとして使用し、CVDリスクをより適切に評価するための臨床診断アッセイへの変換の可能性のために、無細胞HDLコレステロール流出アッセイを開発しました^11,12。これらの流出アッセイは通常、複数のステップを含み、蛍光コレステロールで標識された脂質ドナー粒子を使用し、CECアッセイと同様に、血漿HDLコレステロール流出を測定するために、βリポタンパク質の枯渇、または抗アポA-I抗体を使用してアポA-I含有粒子の捕捉が必要です。これらの代替アッセイは、CVD リスクとさまざまな程度で関連していることが検証されていますが、現在までに、apoA-I 交換レートを評価する^{13 の 13} のみが、CVD リスクの発生を予測することが示されています¹⁴。興味深いことに、血漿HDLのオンおよびオフのapoA-I交換の動態は、CEC¹⁵と独立して関連しており、急性冠症候群の患者では著しく減少することが示されています¹⁶。さらに、いくつかのHDL交換性アポリポタンパク質は、in vitroでABCA1発現細胞からコレステロールとリン脂質の両方を媒介することが示されています¹⁷。

HDL 機能を評価するための代替アプローチを開発しました¹⁸。ここで説明するシンプルで迅速で信頼性の高いアッセイは、ヒト(または動物)の血漿または血清サンプル全体(新鮮または凍結融解)と、蛍光脂質でコーティングされたドナー粒子の2つの成分のみを必要とします。このアッセイは、脂質でコーティングされたドナー粒子¹⁸ から非交換性のヘッドグループタグ付き蛍光ホスファチジルエタノールアミン(PE)を除去する全血漿/血清中のapoA-Iおよびその他のHDL関連交換性アポリポタンパク質の能力を測定します(図1)。

このアッセイのドナー粒子は、コレステロール、リン脂質ホスファチジルコリン(PC)、および蛍光PEでコーティングされたケイ酸カルシウム水和物結晶(CSH)で構成されています。HDL粒子から放出される交換可能なHDL関連アポリポタンパク質(主にアポA-I)は、ドナー粒子に結合し、蛍光PEを含むドナー粒子の脂質とともにドナー粒子から解離します。このようにして、全血漿/血清中に存在する他のリポタンパク質ではなく、HDLはドナー粒子から蛍光PEを特異的に獲得する^18,19。全血漿/血清を蛍光脂質でコーティングされたケイ酸カルシウム水和物(LC-CSH)ドナー粒子および生理食塩水とともに37°Cで1時間振とうしながらインキュベートします。LC-CSHは水の約2倍の密度であるため、低速遠心分離によりドナー粒子を血漿から容易に分離できます。

臨床試験で測定された % PE 流出量は、通常、臨床サンプルの反応混合物の上清中の HDL によって取得された PE 蛍光の値で、参照対照ヒト血漿中の HDL によって得られた値で割ることによって正規化されます。試薬調製の変動を補正するために、参照血漿への正規化が実行されます。研究用途では、上清PE蛍光を全蛍光で割った値(上清PE蛍光+LC-CSH蛍光)を計算することで、PE流出率を決定できます。上清蛍光測定値をスプレッドシートファイルのテンプレートに貼り付けて、%PE Effluxを計算します(3回測定の場合は補足表1、重複測定の場合は補足表2)。スプレッドシートでこれらの計算を実行するための手順は、補足ファイル(補足ファイル1、補足ファイル2、補足ファイル3、補足ファイル4、補足ファイル5、補足ファイル6、補足ファイル7、および補足ファイル8)として提供され、計算例は補足表3として提供されています。

図1:HDL-SPEアッセイ。 HDL特異的リン脂質流出は、96ウェルプレートでアッセイされます。非交換性リサミネルホダミン標識ホスファチジルエタノールアミン(LRh-PE;赤色膜層)を含む脂質(LC-CSH)でコーティングされた生理食塩水、ケイ酸カルシウム水和物結晶(灰色)、および最大30個の全血漿/血清サンプル(黄色、3回)を96ウェルプレートにロードします。サーモミキサーで37°Cで1時間混合した後、プレートを短時間遠心分離してLC-CSHドナー粒子をペレット化します。LRh-PEで特異的に標識されたHDLを含む上清のアリコートを、界面活性剤(Lh-Rh-PEを可溶化するため)と生理食塩水を含む黒いプレートに移します。次に、蛍光計でPE蛍光を測定します。生理食塩水(陰性対照;NC)、バックグラウンド補正、およびプールされた健康なヒト血漿 (ポジティブ コントロール;PC)を、最後のウェルセットにサンプル血漿/血清の代わりにロードします。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコル

採血は、2013 年に改訂された 1975 年のヘルシンキ宣言 (https://www.wma.net/what-we-do/medical-ethics/declaration-of-helsinki/) の規則に従って行われ、インフォームド コンセントに関する機関のガイドラインに準拠する必要があります。

1. 蛍光リン脂質標識ドナー脂質粒子の調製

1. 脂質膜の形成
   注意: 化学フードでストック溶液を調製して分配します。白衣、手袋、保護メガネを着用してください。クロロホルム溶液は有機化学廃棄物に、Triton X-100溶液(プラズマなし)は化学廃棄物に、プラズマ含有溶液はバイオハザード/医療廃棄物に廃棄します。
   1. クロロホルムの脂質原液をベンダーから購入するか、ラボで製造します。
      25 mg/mL: 1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (DMPC):
      10 mg/mL: コレステロール
      1 mg/mL: 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(リサミネルホダミンBスルホニル)[LRh-PE]
      注意: スクリュートップの気密ガラス管を使用してください。テフロンテープでキャップをシールします。
      -20 ^°Cで保管します。
   2. 必要なLC-CSHの量を決定し、適切な数のガラス管を準備します。
      化学ヒュームフードで、各10 mm 150 mmホウケイ酸ガラス管に以下を加えます:472 μLのDMPC原液(17.7 μmol、11.8 mg)、339 μLのコレステロール原液(8.8 μmol、3.39 mg)、および305 μLのLRh-PE(200 nmol、0.305 mg)。ボルテックスは一瞬混ぜます。
   3. 化学ヒュームフードで、ガラス管内の脂質混合物をN₂ の穏やかな流れの下で1時間乾燥させ、チューブの底に乾燥した脂質膜を形成します。
      注:N₂ の流れは、流体表面にわずかな波紋を引き起こすだけです。
   4. 数日または数週間にわたって複数の 96 ウェルプレートを必要とするアッセイの場合は、チューブに分注できる LC-CSH を大量に作成するか、すぐに使用できる LC-CSH プレートの作成に使用して、-20 °C または -80 °C で保存します。 以下の手順 2.2.1 から 2.2.2 を参照してください。
2. ケイ酸カルシウム水和物の蛍光脂質膜コーティング
   注意: ケイ酸カルシウム水和物を取り扱うときは、白衣、手袋、フェイスマスク、保護メガネを着用してください。
   1. 乾燥脂質の入ったガラス管に計量紙コーンを挿入します。計量ペーパーコーンを使用して80 mgのケイ酸カルシウム水和物(CSH)粉末(脂質除去試薬)をガラス管に加え、粉末をチューブの底に向けます。乾燥脂質とCSHの入ったガラス管にすぐに生理食塩水2mLを加えます。チューブの上部をパラフィルムで覆います。
   2. ガラス管の底から脂質の大部分を取り除くために手でボルテックスします。ボルテックスの上部に取り付けられた発泡スチロールのプラットフォームに開けられた穴にガラス管を挿入します。強化テープを使用してチューブをボルテックスプラットフォームに固定します。
      注:混合物がガラス管の約半分まで上昇できるように、渦速度を事前に調整します。
   3. 10分間ボルテックスします。ボルテックス後、チューブの壁に脂質が残っていないことを確認します。必要に応じて、脂質が残らなくなるまで、必要に応じて手動でボルテックスします。1 mLピペットを使用して、ガラス管内の総容量を15 mLの円錐形プラスチックチューブに移します。ガラス管の壁を3 mLの追加生理食塩水で洗浄し、同じ15 mLの円錐形のプラスチックチューブに移します。
3. LC-CSHの洗浄
   1. 脂質でコーティングされたCSH(LC-CSH)を含む15 mLのプラスチックチューブを4°Cで935 × g で2分間遠心分離し、ドナー粒子をペレット化します。長くて非常に細いピペットチップを使用して真空吸引により、上清を慎重に除去します。
   2. 上清の上部から始めて、ピペットチップをチューブの側面に沿ってゆっくりとスライドさせながら、上清が除去されるときにチューブを傾けます。ペレットからのLC-CSHの偶発的な吸引を防ぐために、少量(≈200 μL)の生理食塩水を残します。総量を5mLにするのに十分な生理食塩水を加えます。
   3. 手順 1.3.1 から 1.3.2 を 4 回繰り返します。最終洗浄後、最終容量を2.5mLにするのに十分な生理食塩水を加えます。
      注:LC-CSH調製物で4°Cで2週間、または-20°Cまたは-80°Cで最大6か月間保存してください。
4. すぐに使用できるLC-CSHプレートの大容量バッチ前処理
   注:このアプローチにより、同じLC-CSHバッチから均一な試薬組成の測定プレートを調製できるため、プレート間の測定ばらつきを最小限に抑えることができます。
   1. 上記の手順1.1.1〜1.3.2で説明したように、12本のLC-CSHチューブ(2.5 mL x 12本のチューブ)を準備します。12本のチューブすべての内容物を50 mLの円錐形のプラスチックチューブ(総容量30 mL)に結合します。慎重にボルテックスしてLC-CSH粒子の均一な分布を取得し、6 mLを15 mLのプラスチック製円錐チューブに分注します。4回繰り返して、それぞれに6 mLのLC-CSHを含む合計5本のプラスチック製コニカルチューブが得られます。
   2. 各チューブは、すぐに使用できる 5 枚の LC-CSH プレートを作るのに十分な LC-CSH を提供します (1 つのプレートに 96 ウェルすべてでウェルあたり 50 μL を含む)。以下の手順 2.2.1 から 2.2.2 を参照してください。

2. 血漿/血清サンプルと蛍光リン脂質標識ドナー脂質粒子(LC-CSH)のインキュベーション

1. すぐに使用できる個別のプレート。
   1. アッセイするサンプルセットに必要な数のウェルを使用して、0.3 mL 96ウェルプレートの各ウェルに75 μLの生理食塩水をピペットで移します。100 μLの生理食塩水を3回のネガティブコントロール(NC)ウェルにピペットで、75 μLの生理食塩水を複製したポジティブコントロール(PC)ウェルにピペットで入れます(図2)。マルチウェルピペットを使用して分注します。
   2. LC-CSHを分注する前に、15 mLのプラスチックストックチューブを3回、それぞれ10秒ずつボルテックスします。シングルウェルピペットを使用して、生理食塩水を含むウェルの右側に沿って50 μLのLC-CSHを分注します。それぞれ50 μLを3ウェルのみに迅速に分注します。LC-CSHを次の3つのウェルに分注する前に、ボルテックスプロトコルを繰り返します。
      注:この手順は、自発的に沈殿物を沈殿させる重いLC-CSHが均一に懸濁され、各ウェルに同量の分注が可能になるようにするために重要です。
   3. 96ウェルプレートを180°回転させて、ウェルの左側が右側になるようにします。ウェルの右側に沿って25 μLの血漿/血清サンプルをピペットで移動します(図2)。PCウェルには、25 μLの参照標準ヒト正常脂質血症血漿/血清を追加します。アッセイのウェルあたりの総容量は150 μLです。
      注:この手順は、血漿/血清がウェルの反対側に沿って分注されるため、LC-CSHによる血漿/血清の相互汚染を防ぎます。
   4. プレートを粘着フィルムでしっかりと密封します。密封された96ウェルプレートをサーモミキサーで37°C、1200rpmで暗所で1時間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、プレートをサーモミキサーから取り出し、氷の上に置きます。プレートを4°Cで2分間遠心分離し(転写反応を停止するため)、ドナー粒子をペレット化します。
2. すぐに使用できるLC-CSHプレート
   1. 使用するには、冷凍Ready-To-Useプレート(プレートの調製については手順1.4.1〜1.4.2を参照)を低温(4°C〜10°C)で2時間(または必要に応じて一晩)解凍します。4°Cで935×gで2分間遠心分離し、 すべての材料(125 μL)を一緒に収集します。ウェルの中身が飛び散らないように、粘着フィルムを慎重に取り除きます。
   2. 25 μLの血漿/血清サンプル、生理食塩水、および参照ヒト血漿を3回に分けて、Ready-To-Useプレートの適切なウェル(図1)に氷上で分注し、粘着フィルムで密封します。密封された96ウェルを暗所で37°C、1200rpmで1時間インキュベートします。サーモミキサーからプレートを取り出し、氷の上に置きます。プレートを4°Cで2分間遠心分離し(転写反応を停止するため)、935× g(ドナー粒子をペレット化するため)。

図2:クロスコンタミネーションのないウェルへの試薬の分注。 血漿/血清とLC-CSHをウェルの反対側の壁に分注します。LC-CSHを最初に分注した後、プレートを180°回転させると、クロスコンタミネーションが最小限に抑えられます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. 血漿/血清HDLへの蛍光リン脂質流出量の測定

1. ブラックプレートへの移送と蛍光測定
   1. LC-CSHペレットを乱さないように、粘着フィルムを慎重に剥がしてください。
      注:ペレットの破壊が発生した場合は、再度遠心分離してください。
   2. 蛍光測定のために、96ウェル反応プレートから96ウェルの黒色ポリスチレン平底プレートのウェルに50 μLの上清を移します。マルチウェルピペットを使用してください。
      注:LC-CSHを吸引しないでください。これが発生した場合は、ウェルに注入し、再度遠心分離します。
   3. リザーバーに生理食塩水を入れます。マルチウェルピペットを使用して、各ウェルに50 μLの生理食塩水を加えます。
   4. 125 mLのプラスチック三角フラスコに10 mLの10%Triton X-100ストック溶液に90 mLの蒸留水を加えて、1%TX-100を調製します。リザーバーに1%Triton-X 100を入れます。
   5. 室温で100 μLの1%Triton X-100を各ウェルに加え、マルチウェルピペットを使用して上下に2〜3回穏やかにピペッティングして混合します。気泡の形成を避けてください。3 mLトランスファーピペットからの空気で泡をはじきます。
   6. 蛍光計(励起540nm/発光600nm)でリサミンホダミンの蛍光を測定します。
2. %PE流出量の計算
   1. PE流出量の計算
      1. %PE 流出量 = ([総上清血漿または血清 FLU - 上清 NC FLU]/総 FLU)) × 100
         FLU = 蛍光単位;NC = ネガティブコントロール。ウェルあたりの蛍光測定には、上清反応混合物150 μLのうち50 μLのみを使用するため、次のように修正する必要があります。
      2. 総上清 FLU/ウェル = 測定された FLU 50 μL (黒色プレート) × 3
      3. 150 μL 反応混合物/ウェルあたりの総 FLU = 50 μL の LC-CSH から放出される総 FLU。
         注:LC-CSH蛍光は、以下で説明するように計算されます(ステップ4.2.5)。
   2. 正規化された%PE流出量計算
      1. 正規化された%PE流出量を使用して、異なる条件下で実行されたアッセイ間の変動を補正します(つまり、異なる日に実施された実験、バッチの違い)。
      2. この式を使用して、正規化された % PE 流出量を計算します。
         正規化された %PE 流出量 = サンプル上清 %PE 流出値 (FLU)/ポジティブ レファレンス コントロール上清 %PE 流出 FLU 値。
      3. 正常な脂質プロファイルを持つ健康なドナーからの同一のプールされたヒト血漿を、参照対照として使用します。この値はサンプルと参照の両方で同じであるため、総上清 FLU/ウェルを計算する必要はありません。
      4. 3 回のサンプルの場合は、手順 3.1.6 で得られた生データをスプレッドシートに貼り付けます (補足表 1)。重複サンプルの場合は、手順3.1.6で得られた生データをスプレッドシートに貼り付けます(補足表2)。

4. LC-CSH標準曲線

注:LC-CSH標準曲線は、ウェルあたりのLC-CSHのアリコートに存在するPE蛍光シグナルの量を計算するために使用されます。通常、50 μLのLC-CSH/ウェルが使用されます。この値を使用して、反応混合物中に存在する総FLU(ステップ3.2.1を参照)に正規化されたサンプルのHDLへのPE流出率を計算できます。

%PE 流出量 = ((上清サンプル蛍光単位 [FLU] - 上清生理食塩水 FLU)/(総 LC-CSH FLU)) x 100。

1. LC-CSHの連続希釈
   1. ストックLC-CSHの10倍および100倍希釈液を調製します(ステップ1.1.1〜1.3.3で調製)。
      10倍希釈:LC-CSH 100 μL + 1% Triton X-100 900 μL
      100 倍希釈:10 倍希釈 LC-CSH 100 μL + 1% Triton X-100 900 μL
   2. 10倍および100倍に希釈したLC-CSHの3回サンプルを、標準曲線の96ウェルインキュベーションプレートに分注します( 図3を参照)。
   3. LC-CSHを含むウェルに十分な容量の1%Triton X-100を加えて、最終容量を200 μLにします( 表1を参照)。
2. 蛍光測定のためのLC-CSHの可溶化
   1. プレートを粘着フィルムで密封し、1200 rpmで振とうしながら24°Cで1時間インキュベートします。プレートを4°C、935×gで2分間遠心分離します。粘着フィルムを慎重に剥がします。
   2. マルチウェルピペットを使用して、上下に2〜3回ピペッティングしてサンプルを混合します。マルチウェルピペットを使用して、ウェルあたり100 μLのLC-CSHを蛍光測定用の96ウェル黒色ポリスチレン平底プレートに移します。
   3. マルチウェルピペットを使用して、室温で1%Triton-Xのウェルあたり100 μLを各ウェルに加えます。上下に2〜3回ピペッティングして混合します。
   4. 蛍光計で蛍光を測定します(励起540nm/発光600nm)。
   5. 蛍光計を使用して測定した蛍光値を、補足ファイル3に示されているように、補足表1の線形回帰分析テンプレートに貼り付けます。標準曲線測定プレート中のLC-CSHの最終濃度を表2に示します。

図 3:LC-CSH 標準曲線のプレート。 図のように、連続希釈したLRh-PE標識LC-CSHを96ウェルプレートに分注します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

最終濃度	10倍希釈	100倍希釈	1% トリトン X-100	トータル
LC-CSH	LC-CSH	LC-CSH	洗剤	容積
(μL/ウェル)	(μL)	(μL)	(μL)	(μL)
10	100	0	100	200
5	50	0	150	200
2.5	25	0	175	200
1	0	100	100	200
0.5	0	50	150	200
0.25	0	25	175	200

表1:LC-CSH標準曲線のインキュベーションプレートのウェルに添加された試薬の量。

可溶化	塩田	トータル	追加	測定
LC-CSH	容積	容積	LC-CSH	LC-CSH
(μL)	(μL)	(μL)	(μL/ウェル)	(μL/ウェル)
100	100	200	10	5
100	100	200	5	2.5
100	100	200	2.5	1
100	100	200	1	0.5
100	100	200	0.5	0.25
100	100	200	0.25	0.125

表2:LC-CSH標準曲線の測定プレートのウェルに添加された試薬の量。

結果

分析方法

前述のように、HDL-SPEサンプル分析は、以下に示すように、さまざまなアプリケーションに合わせて変更できます。研究サンプルで研究を行う前に、必要な技術を習得するために、まずLC-CSH標準曲線の検証、再現性、および血漿濃度アッセイが実行されます。まず、LC-CSH 標準曲線分析を実行して、LC-CSH 調製物の品質を評価します。次に、再現性アッセイを行います。最後に、血漿線量アッセイを実行して直線性を確認する必要があります。再現性アッセイでCV%≤5が確立されると、臨床研究または調査研究を実施できます。LC-CSH 標準曲線分析を習得することは、% 蛍光 PE 流出アッセイ(サンプル PE 蛍光を LC-CSH PE 蛍光に正規化)を実行するための準備にも役立ちます。臨床アッセイ、特に長期にわたる複数のアッセイを必要とする大量のサンプルを含む場合、サンプルPE蛍光をポジティブコントロール(すべての96ウェルプレートに使用されるプールされたヒト血漿)に単純に正規化すること...

ディスカッション

HDL-C は、心血管疾患 (CVD) のリスクを臨床的に評価するために使用される重要な決定要因であり、したがって脂質低下またはその他の潜在的な予防タイプの治療の必要性を評価します¹。in vitro での 細胞性コレステロール流出における HDL の機能は、HDL-C⁷ よりも心血管疾患の発生のさらに優れた予測因子であることが示されています。残念ながら、この細胞アッセイは、アッセイの実行に長い時間がかかり、細胞培養が必要であるため、日常的な診断検査用のハイスループット臨床検査アッセイへの変換には適していません。ただし、細胞ベースのCECアッセイは、研究室で実施される研究に依然として有用です。このアッセイは、J774細胞(%CV < 4)を使用することでより信頼性が高く、放射性コレステロール⁹の代わりに蛍光コレステロールを使用するとよりユーザーフレンドリーです。ただし、細胞培養の維持と 96 ウェル プレートの...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン	アヴァンティ・リサーチ	850345	14:0 PC(DMPC)クロロホルム ソルイトン
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノラミン-N-(リサミン・ロダミンBスルフォニル)(アンモニウム塩)	アヴァンティ・リサーチ	810150-C	クロロホルム溶液LRh-PE
接着膜	応用バイオシステム	4306311	マイクロアンプ透明接着フィルム
ベイ・コーポレーション高密度テフロンテープ 1/2インチ x 520	医療検査ソリューション	86732
ホウケイ酸ガラス管は20mmで鋭く、150mm	フィッシャー・サイエンティフィック	14-961-33
遠心分離機	サーモ・サイエンティフィック	ソーヴァルXプロシリーズ
クロロホルム	シグマ・オルドリッチ	366927	HPLCに適しており、99.8%
コレステロールパウダー	シグマ・オルドリッチ	C8667	3&β;-ヒドロキシ-5-コレステン、5-コレステン-3&β;-オール
グラッシン計量紙	コール・パーマー	UX-01338-02	LC-CSHの取り扱いについて
インキュベーションプレート	USA Scientific	1402-9700	TempPlate 96 ウェルセミスカート 0.2mL PCRプレート
脂質除去剤(LRA)	スペルコ	13358-U	LC-CSH
計測板	Greiner bio-one	655076	マイクロプレート、PS、96ウェル、Fボトム(煙突井戸)、黒色;フルオトラック、メッドバインディング
Microsoft Excel	Microsoft 365 MSO	バージョン2507
マルチフレックスピペットチップ	フィッシャー・サイエンティフィック	50-550-206	LC-CSH洗浄中の上澄液検査について
マルチラベルプレートリーダー	パーキン・エルマーとnbsp;	1420-050	Victor3 Wallac1420マルチラベルカウンター
生理食塩水	高品質な生物学的	114-055-101	複数回使用する場合、nbsp;
パラフィルム	コール・パーマー	HS23452	渦巻き時にガラス管トップを覆うために
ポリカボネート・エルレンマイヤーフラスコ	フィッシャー・サイエンティフィック	10-041-8	10%トリトンX溶液の場合
プールされたヒト血漿(血液由来)リチウムヘパリン)	イノベーティブ・リサーチ社	イプラウブリフ	参照プラズマ、陽性対照(PC)およびnbsp;
Surfact-Amps X 100	サーモ・サイエンティフィック	28314	10%トリトンX-100、蒸留水で10倍に薄めて
サーモミキサー	エッペンドルフ	5382000023	96ウェル熱ブロックを備えたサーモミキサーC
サーモミキサー・スマートブロック	エッペンドルフ	5306000006	96井戸スマートブロック
トランスファーピペット(3 mL、Falcon)	フィッシャー・サイエンティフィック	13-711-9CM	井戸の上部から泡を取り除くために
ボルテックスミキサー	ダイガー	3030A	上部のガラス管用アフィックスホルダー