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方法論記事

データに依存しない取得プロテオミクスと機械学習を使用した自閉症スペクトラム障害における免疫関連分子バイオマーカーの同定

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DOI:

10.3791/68949

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2025年9月26日

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1College of Life Sciences, Hunan Normal University, 2Changsha Maternal and Child Health Hospital, Affiliated to Hunan Normal University, 3Changsha Central Hospital, Affiliated to University of South China, 4Shanghai Bioprofile Technology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、酵素結合免疫吸着アッセイによって検証された、自閉症スペクトラム障害の早期診断のための正確なバイオマーカーとして8つの免疫関連タンパク質を同定した、データに依存しない取得質量分析と機械学習を使用したプロトコルを提示します。

要約

この研究は、機械学習 (ML) と組み合わせたデータ非依存取得 (DIA) 質量分析を使用して、自閉症スペクトラム障害 (ASD) に関連する血清タンパク質バイオマーカーを特定するための再現性のあるプロトコルを提示します。DIAは、サンプル間の再現性を確保しながら、低存在量タンパク質を含む血清プロテオームの偏りのない高分解能プロファイリングを可能にします。MLアプローチを適用して、診断的に有益なタンパク質パネルを選択し、モデルの堅牢性を向上させました。分析には、ASDの99人の子供と70人の年齢が一致した対照の血清が含まれていました。存在量の高いタンパク質を枯渇させ、標準化された消化および分画手順を使用してペプチドを調製し、高分解能質量分析計でDIAを実行しました。データ処理と定量化により、機能濃縮分析を受けた差次的に発現するタンパク質が同定されました。8つの免疫関連タンパク質がバイオマーカー開発の有力な候補として浮上しました。これらのタンパク質でトレーニングされたロジスティック回帰モデルは、交差検証で 95.27% の精度、0.9025 の Kappa 値、1.000 の AUC を達成しました。これらの発見は、機械学習と組み合わせたDIAベースのプロテオミクスが、ASDにおけるバイオマーカーの発見およびより広範な臨床研究への適応のための堅牢なフレームワークとしての可能性を示しています。

概要

自閉症スペクトラム障害 (ASD) は、病因と臨床症状の不均一性を特徴とする早期発症神経発達障害のグループです。中核となる特徴には、社会的コミュニケーションや相互作用における持続的な欠陥、制限された反復的な行動、興味、または活動が含まれます。米国では、有病率は 8 歳児で約 2.3%、成人で約 2.2% であり、公衆衛生への影響が強調されています 1,2,3,4。危険因子は、遺伝的素因、免疫調節不全、出生前の環境曝露など多岐にわたります 5,6,7。早期診断と介入は発達転帰を大幅に改善できるため、客観的で信頼できるバイオマーカーの特定が ASD 研究の主要な焦点となっています 8,9,10。このプロトコルは、データに依存しない取得 (DIA) プロテオミクスと機械学習を適用して、免疫関連タンパク質を早期 ASD 診断の潜在的なバイオマーカーとして特定した以前に発表された研究に基づいています11。

広範な努力にもかかわらず、臨床的 ASD 診断のための特異的で普遍的に検証されたバイオマーカーは現在存在しません12。腸内細菌叢の変化 13、インターロイキン 6 (IL-6)14 の上昇、脳由来神経栄養因子 (BDNF)15 の変化、グルタチオン16 などの酸化ストレス マーカーなどの提案された候補は暫定的なままであり、臨床使用の再現性に欠けています。プロテオミクスは、疾患特異的な分子シグネチャを特定するための有望なアプローチとして浮上しており、いくつかの研究で、差次的に発現するタンパク質 8,17,18,19,20,21,22 についてさまざまな生物学的サンプル (血液、唾液、尿、PBMC) が調査されています 8,17,18,19,20,21,22 .たとえば、Bao らは、Olink プロテオミクスによって同定された炎症性タンパク質が ASD の早期診断に役立つ可能性があることを実証しましたが (17)、他の研究では、ASD の遺伝的不均一性にもかかわらず、共有されたプロテオミクスおよび代謝経路が堅牢なバイオマーカーを生み出す可能性があることが示唆されています23。

DIA質量分析は、その包括的で再現性のあるタンパク質プロファイリングでますます注目を集めています。最も強いイオンを選択的にフラグメント化する従来のデータ依存取得(DDA)とは異なり、DIAは事前定義されたm/zウィンドウにわたってすべての前駆体イオンをフラグメント化します。これにより、プロテオームのカバレッジが深まり、大規模コホート全体での再現性が向上し、臨床比較の重要な利点となります14。ベンチマーク研究では、DIAはDDAよりも定量可能なペプチドを検出し、特に存在量の少ないタンパク質について、ラン間変動が少ないことが示されています14。

これらの進歩に基づいて、高存在量タンパク質の枯渇後のASDの99人の子供と70人の対照の血清サンプルにDIAベースのプロテオミクス分析を適用しました。私たちの発見は、早期 ASD 診断の分子マーカーとしての免疫関連タンパク質の可能性を強調し、厳密な方法論と組み合わせた場合のバイオマーカー発見における DIA ベースのプロテオミクスの価値を実証します11。

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プロトコル

プロトコルはヘルシンキ宣言に従って実施され、プロトコルは長沙母子保健病院の治験審査委員会によって承認されました。被験者からインフォームドコンセントが得られました。

1. DSM-5による自閉症児の同定

  1. 病歴と背景情報の収集
    1. 発達歴
      1. 言語、社会、運動能力の進歩など、患者の初期発達に関する情報を収集します。
      2. 発達の遅れや異常(言語の遅れ、社会的相互作用の困難など)に注意してください。
    2. 家族の歴史
      1. 自閉症やその他の神経発達障害の家族歴について問い合わせてください。
    3. 現在の機能レベル
      1. 学習、仕事、社会的交流、自立した生活スキルなど、日常生活における患者のパフォーマンスを評価します。
  2. DSM-5 診断基準の使用
    1. 社会的コミュニケーションと社会的相互作用における持続的な欠陥
      1. 次の 3 つの基準のうち少なくとも 2 つが満たされていることを確認します。
        1. 社会的・感情的相互性の欠陥は、通常のアイコンタクト、顔の表情、ボディランゲージの欠如、年齢に応じた友情や人間関係を形成するのが難しいことの原因です。
        2. 非言語的コミュニケーション行動の欠陥 - ジェスチャー、顔の表情、または声のトーンを使用して感情を伝えることに課題があり、他者からの非言語的合図の理解が限られていることがわかります。
        3. 人間関係の発展、維持、理解の不備 - さまざまな社会的状況に適応することの難しさ、仲間への関心の欠如、または想像力豊かな遊びに参加できないこと。
    2. 制限された反復的な行動、興味、または活動のパターン
      1. 次の 4 つの基準のうち少なくとも 2 つが満たされていることを確認します。
        1. ステレオタイプまたは反復的な運動運動 (例: 手の羽ばたき、体の揺れ、または反復的な物体の使用)。
        2. 同一性や儀式化された行動パターンにこだわる - 日常生活の小さな変化に対する極度の苦痛を探します。
        3. 高度に制限され、固執した興味 - 特定のトピックや活動に異常に集中する傾向があります。
        4. 感覚入力に対する過敏性または低反応性 - 音、光、触覚などの感覚刺激に対する非定型反応を探します。
  3. 症状の発症と重症度の評価
    1. 症状のタイミング - 症状が幼児期 (通常は 3 歳以前) に存在していたことを確認します。
    2. 症状の影響 - 症状が社会的、職業的、またはその他の重要な機能領域に重大な障害を引き起こすことを確認します。
    3. 重大度レベル
      注: DSM-5 によると、ASD の重症度は 3 つのレベルに分類されます (補足表 S1)。
      1. 患者が軽度のサポートのみを必要とする場合は、レベル 1 として分類します。
      2. 患者が実質的なサポートを必要とする場合は、レベル 2 として分類します (中程度)。
      3. 患者が非常に実質的なサポートを必要とする場合 (重度) は、レベル 3 として分類します。
  4. その他の潜在的な原因の除外
    1. 健康診断 同様の症状を引き起こす可能性のある他の状態 (遺伝性症候群、聴覚障害、知的障害など) を除外するために、必要な医学的評価 (遺伝子検査、脳画像検査など) を実施します。
    2. 併存疾患の評価: 併存疾患 (注意欠陥多動性障害、不安障害、うつ病、てんかんなど) の存在を評価します。

2. DIA質量分析のためのサンプル前処理

  1. 倫理的コンプライアンスとサンプル収集
    1. 自閉症スペクトラム障害(ASD)と診断された3〜7歳の子供の両親または法定後見人からインフォームドコンセントを得る。
    2. 自閉症のアメリカのDSM-5に概説されている診断基準に従って、患者を重症度レベル1から3に分類します(ステップ1.3.3)。
    3. 参加者から血清サンプルを収集します。タンパク質の分解を防ぐために、採血後 4 時間以内にすべてのサンプルを処理してください。処理中はサンプルを氷上に保管してください。
  2. 高存在量タンパク質の除去
    1. 市販のキットを使用して、製造元の指示に従って、サンプルあたり60 μLの血清から存在量の多いタンパク質を枯渇させます。簡単に言えば、枯渇カラムを結合バッファーで平衡化し、血清サンプルをロードし、重力流下でカラムを通過させます。低存在量のタンパク質画分を含むフロースルーを収集します。
    2. BCAアッセイを使用して総タンパク質濃度を測定します。溶液中消化の前に、すべてのサンプルを最終濃度0.5〜1.0 μg/μLに正規化します。その後の分析のために、各サンプルに少なくとも100μgのタンパク質が含まれていることを確認してください。
  3. タンパク質の消化
    注:タンパク質消化は、Wisniewskiらによって記述されたFASP法を使用して実行されました24。
    1. 界面活性剤、ジチオスレイトール(DTT)、ヨードアセトアミド(IAA)をUA(尿素緩衝液)バッファーに添加して、還元システインをブロックします。
    2. タンパク質懸濁液をトリプシンで50:1の比率で37°Cで一晩消化します。
  4. ペプチドの脱塩、クリーンアップ、および高 pH 逆相分別
    1. ペプチド混合物を16,000 × g で°Cで15分間遠心分離し、不溶性の破片を除去します。
    2. 上清(消化されたペプチドを含む)を新しい低結合マイクロ遠心チューブに移して、吸着損失を最小限に抑えます。
    3. .100%メタノール(20 μL)でプレコンディショニングし、水中で0.1%(v/v)トリフルオロ酢酸(TFA)で平衡化することにより、C18マイクロカラム(C18樹脂を社内で充填)を調製します(バッファーA; 20 μL)。
    4. ペプチドサンプルをマイクロカラムにロードします。カラムを20 μLのバッファーAで洗浄し、塩、界面活性剤、および非ペプチド性汚染物質を除去します。
    5. 精製ペプチドを0.1%TFAを含む80%アセトニトリル20 μLで溶出します。
    6. 溶出したペプチドを遠心真空濃縮器を使用して真空下で乾燥させます。乾燥ペプチドは、さらに使用するまで-8°Cで保存してください。
    7. LC-MS/MS分析の前に、乾燥ペプチドを0.1%ギ酸で再構成します。
    8. 2.4.8.正確な定量のために、トリプトファンとチロシン残基からの寄与を考慮して、分光光度計を使用して280 nm(OD280)での吸光度を測定することにより、ペプチド濃度を定量します。
      高 pH 逆相 HPLC を使用してペプチド混合物を分別するには、C18 カラム(3.5 μm、2.1 × 150 mm)を HPLC システム上で、流速 0.3 mL/min、移動相 A:10 mM ギ酸アンモニウム水溶液、pH 10(水酸化アンモニウムで調整)、移動相 B:10 mM ギ酸アンモニウム、90% アセトニトリル溶液、pH 10 で使用します。グラジエント溶出を実行して、サンプルあたり60フラクションを~60分間にわたって収集します。
    9. 冗長性を減らすために 3 分ごとに結合し、サンプルごとに 20 のプール画分になります。プールされた各画分を真空下で乾燥させ、下流の分析を行います。
      注:得られたペプチド画分は、 ナノLC-MS/MS分析の準備が整いました。

3. DIA質量分析への提出

  1. DIA質量分析
    1. HPRP 画分から iRT 標準ペプチドを含むデータ依存性取得(DDA)ペプチドをスパイクし、カラム(75 μm x 150 mm、2 μm C18 ビーズ、120 Å)を備えたナノ HPLC システム上で逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)を使用して分離し、移動相 A:0.1% ギ酸水溶液、 移動相 B:0.1% ギ酸、95% アセトニトリル中。
    2. 次のように設定されたバッファーBの線形勾配でペプチドを60分間溶出します:0〜2分、2%〜5%の緩衝液Bの線形勾配。2 - 42 分、5% から 20% バッファー B までの線形勾配。42 - 50 分、20% から 35% バッファー B までの線形勾配。50〜52分、35%〜90%バッファーBの線形勾配。52〜60分、バッファーBは90%に維持されます。
    3. 溶出したペプチドを基準質量分析計で分析します。HCDフラグメンテーションのサーベイスキャン(350 - 1500 m/z)から最も豊富な前駆体イオンを動的に選択する、データ依存のtop20メソッドを使用してMSデータを取得します。
    4. ペプチド認識モードを有効にして装置を実行します。質量校正の内部標準として 445.120025 Da のロック質量を使用します。MS/MSスキャンでは、m/z 200で70,000、m/z 200で17,500の分解能でフルMSスキャンを取得します。最大注入時間を MS の場合は 50 ms、MS/MS の場合は 30 ms に、正規化された衝突エネルギーを 28 に、分離ウィンドウを 1.6 Th、動的除外時間を 30 秒に設定します。
  2. データに依存しない取得(DIA)のためのLC-MS/MS分析
    1. 各サンプルからペプチドをiRTで均等かつ個別にスパイクします。
    2. ナノHPLCシステムと組み合わせた四重極質量分析計でLC-MS/MSを実行します。上記のDDA法と同じ方法でLC条件を設定します。400〜1,200 m/zの測量スキャンを解像度60,000で、AGCターゲットは3E6、注入時間は30 msです。DIA MS/MSスキャンを分解能15,000で、20 m/zの分離ウィンドウ、1E6のAGCターゲット、50 msの注入時間で取得します。正規化された衝突エネルギーを 30 に設定します。
    3. フルMSスキャンとDIAスキャンのスペクトルを、それぞれプロファイルタイプと重心タイプで記録します。
  3. シーケンスデータベース検索
    1. DIAソフトウェアを使用してDDA MSデータを分析します2。
    2. 11のiRTペプチド配列からなるタンパク質をスパイクしたUniProtKBヒトデータベース(合計186,532エントリ、2019年10月にダウンロード)に対してMSデータを検索します。
    3. 消化酵素としてトリプシンを選択します。データベース検索のために、最大 2 つの欠落切断部位と、前駆体イオンで 4.5 ppm、フラグメントイオンで 20 ppm の質量許容差を定義します。システインのカルバミドメチル化を固定修飾として定義し、タンパク質 N末端のアセチル化とメチオニンの酸化をデータベース検索のための可変修飾として定義します。
    4. データベース検索結果をフィルタリングし、ペプチドスペクトルマッチングレベルとタンパク質レベルでそれぞれ<1%の誤発見率(FDR)でエクスポートします。
  4. 生データ処理の実行
    1. DIAの分析MSデータは、検索結果からスペクトルライブラリを生成するために、DIAソフトウェア[34、35]で分析されました。検索と動的 iRT のデフォルト設定を使用して、保持時間の予測を行います。MS/MS スキャンの干渉補正が有効になっていることを確認します。
    2. ペプチドレベルで<1%FDRで結果をエクスポートします。

4. タンパク質の差動分析

  1. http://www.omickits.com/open/tooldetail?id=70 で倍数変化 (FC) と組み合わせたスチューデントの t 検定を使用して仮説検定を実行します。
    1. クラウドプラットフォームにログインし、 仮説検定分析 ツールに移動します。前処理されたタンパク質定量データファイル(CSVまたはTXT形式など)をアップロードします。
    2. パラメータ設定で、統計的手法としてスチューデントの t検定を選択し、p値0.05<有意性しきい値を選択します。倍数変化しきい値を FC > 1.5 または FC < 1/1.5 として定義します。 [分析の実行] をクリックし、結果が生成されるのを待ちます。
    3. 各タンパク質のp値、log2(FC)、および有意性ステータスを含む出力ファイルをダウンロードします。
      注:この二重基準アプローチは、統計的有意性と生物学的関連性のバランスをとり、差次的に発現するタンパク質(DEP)の堅牢な同定を保証します。

5. 信号経路解析

  1. 火山プロットの視覚化
    1. http://www.omickits.com/open/tooldetail?id=63 のツールに移動し、 次に [火山プロット] ツール ページに移動します。
      1. セクション4からDEP解析結果ファイルをアップロードします。
      2. 視覚化パラメータの設定: X 軸: log2(Fold Change) - 変化の方向を示します。Y軸:-log10(p値) -統計的有意性を反映します。色分け: 赤 :有意にアップレギュレートされたタンパク質(p < 0.05およびFC > 1.5)。 青 :タンパク質が大幅にダウンレギュレーションされました(p < 0.05およびFC<0.667)。 グレー :有意でないタンパク質(p ≥ 0.05または1/1.5 ≤ FC≤1.5)。
      3. [ 画像の生成] をクリックし、公開用の高解像度画像 (PDF/SVG 形式) をダウンロードします。
  2. 階層クラスタリングヒートマップ
    1. http://www.omickits.com/open/tooldetail?id=17 でツールに移動します。
      1. クラスタリングヒートマップツールにアクセスします。
      2. フィルター処理された DEP 式マトリックスをアップロードします。
      3. 次のパラメータを設定します。 正規化方法:スケールの違いを排除するための行ごとのZスコア。 距離メトリック:ユークリッド距離。 クラスタリング方法:完全なリンケージ階層クラスタリング。オプション: サンプルのグループ化に応じて、列クラスタリングや行クラスタリングを有効にします。
      4. [ 実行] をクリックしてヒートマップを生成します。
      5. ヒートマップをダウンロードして、公開可能な画像として保存します。
        注:ヒートマップは、サンプル間のタンパク質発現パターンの類似性と発散を視覚的に表します。
  3. GO機能アノテーションとエンリッチメント分析
    1. 必要な R パッケージをインストールして読み込みます。
      ライブラリ(clusterProfiler)
      ライブラリー(org.Hs.eg.db)
      ライブラリ(ggplot2)
    2. タンパク質ID(Uniprotや遺伝子シンボルなど)をEntrez IDに変換します。
      entrez_ids <- bitr(diff_proteins、fromType = "UNIPROT"、toType = "ENTREZID"、OrgDb = org。Hs.eg.db)
    3. GOエンリッチメント分析を実行します。
      go_enrich <-enrichGO(遺伝子= entrez_ids$ENTREZID、OrgDb = org。Hs.eg.db、keyType = "ENTREZID"、ont = "BP")
    4. ドットプロットを使用して結果を視覚化します。
      1. ドットプロット(go_enrich、表示カテゴリ = 20)
        式：
        リッチファクター=(a/b)/(c/d)
        どこ：
        a = 用語に注釈が付けられた DEP の数。
        b = DEP の総数。
        c =用語に注釈が付けられたバックグラウンドタンパク質の数。
        d =バックグラウンドタンパク質の総数。
  4. KEGG経路のアノテーションと濃縮解析
    1. KEGG濃縮分析を実施します。
      kegg_enrich <-エンリッチKEGG(遺伝子= entrez_ids $ENTREZID、生物=「持っている」)
    2. KEGG経路の結果を視覚化します。
      barplot(kegg_enrich, showCategory = 20)
    3. 出版物の書式設定にggplot2を使用してプロットをカスタマイズします。

6. ROC曲線分析によるタンパク質の初期スクリーニング

  1. データ準備:自閉症スペクトラム障害(ASD)および対照群から同定されたすべての差次発現タンパク質(DEP)を含むプロテオミクスデータセットをロードします。データセットに両方のグループのタンパク質発現値が含まれ、ASDとコントロールサンプルを示す明確なラベルが付いていることを確認します。
  2. ROC曲線解析を実行します。
    1. RのpROCパッケージを使用して、各タンパク質のレシーバー動作特性(ROC)曲線解析を行います。
    2. 曲線下面積 (AUC) を計算することにより、ASD 群と対照群を区別する各タンパク質の能力を評価します。
      AUC = 0.5: 差別なし(ランダムチャンスに相当)。
      0.7 ≤ AUC < 0.8: 許容される差別。
      0.8 ≤ AUC < 0.9: 優れた識別力。
      AUC ≥ 0.9: 顕著な差別。
      注:AUCは、ASDグループからランダムに選択された個人が、対照グループからランダムに選択された個人よりもタンパク質レベルが高い確率を表します。AUC が高いほど診断性能が優れていることを示し、0.8 を超える値は一般にバイオマーカー研究で臨床的に意味があると考えられています。
    3. すべてのタンパク質のAUC値を記録します。
  3. 候補バイオマーカーを選択します。
    1. AUCが0.7を超えるタンパク質をバイオマーカー候補として同定します。
    2. さらなる分析のために、候補バイオマーカーのリストをエクスポートします。
  4. 結果を視覚化します。
    1. R の ggplot2 パッケージを使用して、パフォーマンスの高いタンパク質の ROC 曲線の視覚化を作成します。
    2. わかりやすくするために、プロットの凡例にAUC値を含めます。

7. ランダムフォレストを用いた二次スクリーニング

  1. 入力データを準備します。
    1. ROC分析から得られた候補バイオマーカーのリストを、ランダムフォレスト分析の入力として使用します。
    2. データセットが適切にフォーマットされ、行はサンプルを表し、列はタンパク質発現値を表すことを確認してください。
  2. ランダム フォレスト モデルをトレーニングします。
    1. R の randomForest パッケージを使用してランダム フォレスト アルゴリズムを適用します。
    2. ツリーの数 (ntree) を 500 に設定し、各分割でランダムにサンプリングされる変数の数 (mtry) を特徴の総数の平方根に設定します。
    3. 特定の特徴が削除されたときのモデル精度の低下を測定する MeanDecreaseAccuracy メトリックを使用して、特徴の重要度を評価します。
    4. R の randomForest パッケージを使用してランダム フォレスト モデルをトレーニングします。
      R. ライブラリ(ランダムフォレスト)
      # 例:タンパク質レベルを使用したグループ(ASDと対照など)の予測
      rf_model <-ランダムフォレスト(x = protein_data、
      y = as.factor(グループ)、
      importance = TRUE, # 特徴量の重要度を計算するために必要
      ntree = 500) # 木の数
    5. importance() 関数を使用して特徴の重要度メトリックを抽出します。
      R. importance_scores <- 重要性(rf_model)
    6. MeanDecreaseAccuracy 値を取得し、降順で並べ替えます。
      R. mean_dec_acc <- importance_scores[ , "平均減少精度"]
      importance_rank <- sort(mean_dec_acc、減少 = TRUE)
    7. 組み込みの varImpPlot() 関数を使用して特徴の重要度を視覚化します。
      R. varImpPlot(rf_model, main = "特徴量の重要度(平均精度低下)")
      注: MeanDecreaseAccuracy メトリックは、各特徴量がモデルの予測パフォーマンスにどれほど重要であるかを反映しています。除去時の精度の大幅な低下は、重要度が高いことを示します。このアプローチは、グループ間の識別力が最も強いタンパク質または遺伝子に優先順位を付けるのに役立つため、バイオマーカーの発見に特に役立ちます。
    8. レポートまたはダウンストリーム分析のために重要度スコアをエクスポートします。
      R. importance_table <- data.frame(
      機能 = 名前 (importance_rank)、
      平均減少精度 = importance_rank
      )
      write.csv(importance_table, "feature_importance.csv", row.names = FALSE)
    9. MeanDecreaseAccuracyスコアに基づいてタンパク質をランク付けします。
    10. MeanDecreaseAccuracyスコアが最も高い上位15個のタンパク質を、後続のモデリングの最も重要な特徴として選択します。
    11. これらのタンパク質のリストをエクスポートして、さらに検証します。
      注:MeanDecreaseAccuracy値が低いタンパク質は、削除した場合、モデルのパフォーマンスへの影響を最小限に抑える可能性があります。
    12. 選択されたタンパク質、特に ASD に関与する免疫機能または経路に関連するタンパク質の生物学的関連性を強調します。

8. 最終的なバイオマーカー選択のために結果を組み合わせます。

注: R が pROC、randomForest、および ggplot2 のパッケージとともにインストールされていることを確認します。分析前に、プロテオミクスデータセットが前処理され、正規化されていることを確認してください。候補バイオマーカーと視覚化プロットのリストは、参照用に別のファイルとして保存します。

  1. 調査結果を統合します。
    1. ROC分析とランダムフォレストスクリーニングの結果を相互参照して、重複するタンパク質を特定します。
    2. 両方の分析で信頼性の高い候補バイオマーカーとして現れるタンパク質を優先します。
    3. LEOCV(leave-one-out cross-validation)などの追加の検証ステップを実行して、選択したバイオマーカーの堅牢性を確認します。
    4. ロジスティック回帰モデルを使用して、組み合わせたバイオマーカーセットの予測精度を評価します。
    5. ggplot2パッケージを使用して、バイオマーカーの最終セットのROC曲線と精度再現率プロットを作成します。
    6. AUCや精度再現率などの指標を含めて、選択したバイオマーカーの診断可能性を実証します。

9. 双方向特徴量の選択

  1. データを準備し、モデルを定義します。
    1. タンパク質発現値と対応するラベル(ASDとコントロールなど)を含むデータセットをロードします。データセットが前処理され、正規化されていることを確認します。
    2. 初期モデルを定義する: 分類には、二項族を持つ一般化線形モデル (GLM) を使用します。
    3. AIC を評価メトリックとして使用して、特徴量選択時にモデルを比較します。
  2. 順方向の特徴選択を実行します。
    1. 切片項のみを含む空のモデルから始めます。
    2. AIC の最大の削減に基づいて、一度に 1 つの特徴を追加します。
    3. 加算ごとに AIC 値を記録します。AICのさらなる減少が観察されない場合は停止します。
  3. 後方特徴選択を実行します。
    1. 使用可能なすべての特徴を使用してモデルをトレーニングします。
    2. AIC の最小の増加に基づいて、一度に 1 つの特徴量を削除します。
    3. 各削除後に AIC 値を記録します。AICのさらなる減少が観察されない場合は停止します。
    4. 前進ステップと後退ステップを組み合わせます。
  4. 順方向と逆方向の選択を交互に行います。
    1. 順方向の特徴選択を 1 ラウンド実行し、その後すぐに後方特徴選択を 1 ラウンド実行します。AIC の改善が見られないまで、このプロセスを繰り返します。
    2. 別のアプローチ: 逆方向の特徴選択から始めて、順方向の特徴選択を実行します。以前に削除したフィーチャをモデルに再度追加した場合の効果を評価します。
  5. 選択したフィーチャを確定します。
    1. 選択した特徴量とそれに対応する係数の最終リストをエクスポートします(補足図S1)。

10. リーブワンアウト法によるロジスティック回帰を用いた双方向特徴選択のクロスバリデーション

注: R が caret、pROC、および ggplot2 のパッケージと一緒にインストールされていることを確認します。プロテオミクスデータセットは、分析前に前処理および正規化する必要があります。混同行列、ROC 曲線、およびモデルの概要を、参照用に別のファイルとして保存します。

  1. データを準備し、モデルを定義します。
    1. タンパク質発現値と対応するラベル(ASDとコントロールなど)を含むデータセットをGLMSTEP/bothFitModel.txtファイルからロードします。データセットが前処理され、正規化されていることを確認します。
    2. 分類に二項族を持つ一般化線形モデル (GLM) を使用して初期モデルを定義します。
    3. 精度とカッパ係数を評価指標として使用して、交差検証中にモデルのパフォーマンスを評価します。
  2. リーブ ワン アウトのクロス検証を実行します。
    1. R のキャレット パッケージを使用して相互検証を初期化し、リーブ ワンアウト クロス検証 (LOOCV) を実装します。
    2. 選択した 8 つの特徴量を使用してロジスティック回帰モデルをあてはめます。
    3. 交差検証の各反復の精度と Kappa 係数を記録します。
  3. 交差検証の結果を分析します。
    1. 結果を要約する。
      注:LOOCVプロセスの結果は、(この研究のように)次のようになります:一般化線形モデル、169サンプル、8つの予測変数、2つのクラス:「A」、「B」、リサンプリング:リーブワンアウトクロスバリデーション、サンプルサイズの概要:168、168、168、168、168、168、...、リサンプリング結果:精度カッパ0.9526627 0.9024531。
    2. メトリックを解釈します。
      注:ここで、モデルは0.9527の精度と0.9025のカッパ係数を達成し、予測結果と観察結果の間の優れた一致を示しています。
      1. カッパ係数を調べて、モデルの予測力を測定します。カッパ係数の範囲は -1 から 1 で、0 はランダム予測を示し、1 は完全な一致を示します。
        注:この研究では、0.9025のKappa値は、モデルの強力な予測力を反映しています。
  4. モデル係数を評価します。
    1. ロジスティック回帰モデルの係数を調べて、各特徴の寄与度を理解します。ヌル逸脱、残差逸脱、AIC を評価して、モデルの適合度を確認します。
      注:たとえば、この研究では、168自由度でNull逸脱:2.2928e + 02、160自由度で残差逸脱:2.2378e-07、AIC:18、Fisher Scoring反復回数:25を取得しました。
  5. 結果を視覚化します。
    1. 混同行列を作成して、モデルの予測パフォーマンスを視覚化します。
    2. 受信者動作特性 (ROC) 曲線をプロットして、モデルの分類パフォーマンスを評価します。
    3. 結果を解釈します。曲線下面積(AUC)を計算して、モデルの分類性能指標を求めます。
      注: ROC 曲線は、真陽性率と偽陽性率の間のトレードオフを示しています。曲線下面積(AUC)は1に近い必要があり、優れた分類性能を示します。ROC 曲線は、さまざまなしきい値におけるモデルの真陽性率と偽陽性率の変化を反映しています。AUC 値が大きいほど、モデルのパフォーマンスが向上します。

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結果

この研究には、ASDの99人の子供と70人の年齢が一致した対照(3〜7歳)が含まれ、バランスの取れた性分布が行われました(補足表S2)。血清は、標準化されたプロトコルを使用して一晩絶食した後に採取されました:血液を血清分離チューブに採取し、室温で30分間凝固させた後、1,500 × g で4°Cで10分間遠心分離しました。 上清を分注し、さらなる処理まで-80°Cで保存しました。高存在量のタンパク質(アルブミン、IgG、ハプトグロビンなど)を枯渇させて、検出感度を高めました。タンパク質濃度はBCAアッセイによって測定され、サンプルは消化前に0.5〜1.0μg/μLに正規化されました。トリプシン/LysC消化を行い、C18カートリッジを用いてペプチドを脱塩し、24を凍結乾燥した。

LC-MS/MS 分析では、サンプルあたり約 2 μg のペプチドを、ナノ ...

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ディスカッション

この原稿に記載されているプロトコルは、データに依存しない取得 (DIA) 質量分析および機械学習技術を使用して、自閉症スペクトラム障害 (ASD) における免疫関連分子バイオマーカーを特定するための包括的なアプローチを概説しています。プロトコル内の重要なステップにより、信頼性と再現性のある結果が保証されると同時に、変更やトラブルシューティングが必要な領域も強調表示されます (表 2)。

プロトコルの重要なステップの 1 つは、血清サンプルの収集と取り扱いです。血清は、遠心分離または血栓活性化チューブを使用して収集できます。血液サンプルは、下流の分析を損なう可能性のあるタンパク質の分解を防ぐために、収集から4時間以内に処理することが不可欠です。タンパク質の完全性を維持するために、処理は氷上で行う必要があります。遅延は、バイオマーカーの発見において最も有益であることが多い、存在量の少ないタンパク質の損失につながる可能性があります。処理が遅れた場合は、プロテアーゼ阻害剤を直ちに添加するか...

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開示事項

著者には宣言すべき利益相反はありません。

謝辞

中央研究室のメンバーの皆さん、そしてこのプロジェクトに協力してくださった方々に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬および化学物質アセトニトリル(HPLCグレード)フィッシャーサイエンティフィックA18-50
試薬および化学物質重炭酸アンモニウム(NH?HCO?シグマ・アルドリッチ38939
試薬および化学物質ギ酸アンモニウムシグマ・アルドリッチ90265
試薬および化学物質ウシ血清アルブミン(BSA)サーモフィッシャーサイエンティフィック23212
試薬および化学物質ジチオスレイトール(DTT)シグマ・アルドリッチ43815
試薬および化学物質ギ酸(0.1%)サーモフィッシャーサイエンティフィック28905
試薬および化学物質ヨードアセトアミド(IAA)シグマ・アルドリッチI1149
試薬および化学物質メタノール(HPLCグレード)フィッシャーサイエンティフィックA452-4
試薬および化学物質トリフルオロ酢酸(TFA)シグマ・アルドリッチT6508
試薬および化学物質尿素シグマ・アルドリッチU5378
キットおよび特殊試薬BCAプロテインアッセイキットサーモフィッシャーサイエンティフィック23227
キットおよび特殊試薬C18 Sep-Pak カートリッジ水WAT023590
キットおよび特殊試薬C18 StageTips(自家製)3M Empore™
キットおよび特殊試薬高存在量タンパク質枯渇キットミリポアシグマ122642
キットおよび特殊試薬iRT標準ペプチドバイオグノシスAG
キットおよび特殊試薬リゾチームELISAキット武漢ファインバイオテック株式会社 株式会社
キットおよび特殊試薬トリプシン/LysC酵素ミックスプロメガV5071
Equipment遠心機エッペンドルフ5430R型
EquipmentEasy-nLC 1200システムサーモフィッシャーサイエンティフィック
EquipmentNanodrop One分光光度計サーモフィッシャーサイエンティフィックND-ワン-W
EquipmentQ Exactive HF-X質量分析計サーモフィッシャーサイエンティフィック
EquipmentSpeedVacコンセントレータサーモフィッシャーサイエンティフィックSPD131DDA
Equipmentスウィニングバケットローター遠心分離機諸
EquipmentWaters XBridge BEH130 カラム水C18、3.5 & ムー;m、2.1×150ミリメートル
EquipmentAgilent 1260 HPLCシステムアジレント1260 インフィニティII
ソフトウェアおよびオンラインツール生体伝導体(Rパッケージ)bioconductor.org
ソフトウェアおよびオンラインツールキャレット (R パッケージ)クランcaret_6.0-93
ソフトウェアおよびオンラインツールclusterProfiler (R パッケージ)生体伝導体4.0.5
ソフトウェアおよびオンラインツールダイヤNNDIA-NNソフトウェアv1.8
ソフトウェアおよびオンラインツールggplot2 (R パッケージ)クラン3.4.0
ソフトウェアおよびオンラインツールマックスクオンツマックスプランク研究所1.6.17
ソフトウェアおよびオンラインツールomickits.comOmiKitsクラウドプラットフォームhttp://www.omickits.com
ソフトウェアおよびオンラインツールpROC(Rパッケージ)クラン1.18.0
ソフトウェアおよびオンラインツールrandomForest (R パッケージ)クラン4.7-1.1
ソフトウェアおよびオンラインツールスペクトロノートパルサーXバイオグノシスAG17
ソフトウェアおよびオンラインツールUniProtKBヒトデータベースuniprot.orgリリース 2019_10
<ストロング>その他の素材低結合マイクロ遠心チューブエッペンドルフ30120094
<ストロング>その他の素材血清分離管(SST)BDバイオサイエンス367988
<ストロング>その他の素材3M Empore™C18 ディスク3メートル

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