Cell-ACDCを用いた多次元顕微鏡データの解析

Summary

多次元顕微鏡データを正確に分析するには、複雑なワークフローが必要です。この記事では、ソフトウェアCell-ACDCの使用方法を示します。最先端の AI 駆動モデルを活用して、顕微鏡データのセグメンテーション、追跡、細胞血統分析、定量化を行います。重要なのは、モデルの出力を半自動で補正するための革新的なフレームワークでこれらのモデルを補完することです。

Abstract

ライフサイエンス向けの定量顕微鏡の最近の進歩により、実験生物学者は前例のない分解能と速度で細胞をプローブできるようになりました。同時に、AI革命により、多次元顕微鏡データから抽出できる情報量が劇的に増加しました。しかし、生成される大量のデータと最先端のAIモデルの複雑さは、画像解析の段階で深刻なボトルネックとなっています。Cell-ACDCは、多次元顕微鏡データにおける単一細胞のセグメンテーション、追跡、定量分析のための強力なエンドツーエンドのソリューションを提供する、オープンソースのユーザーフレンドリーなソフトウェアです。これは、そのようなモデルを実装するために必要な高度な技術的専門知識が不足している可能性のある実験生物学者向けに調整されています。この記事では、フレームワークを利用して最新のモデルと、スマートで半自動のデータ補正のための多くのツールを簡単に活用し、取得可能な生物学的情報の量を最大化する方法を示します。Cell-ACDCは、マルチチャンネル、タイムラプス、Zスタック顕微鏡データをサポートし、各タイプのデータ次元に合わせた専用ツールセットを提供します。Cell-ACDCは、新しいモデルをシームレスに統合し、生物学者が直接アクセスできるモジュール設計により、顕微鏡データ分析のリファレンスツールとして機能する可能性があります。

Introduction

顕微鏡検査は、基礎科学^1,2,3から創薬および試験^4,5まで、また細胞培養から組織^6,7、オルガノイド^8,9、および全生物¹⁰に至るまで、研究開発のあらゆる段階で生物学的発見を加速するための基礎となっています.ただし、これらの高度な顕微鏡技術には、2 つの主な欠点があります。まず、顕微鏡データは本質的に大きく、特に複数の次元 (時間や体積など) を取得する場合¹¹ です。第二に、データ内の豊富な生物学的情報を正確に抽出するには、多くの場合 AI モデルに基づいて構築される高度な画像分析フレームワークの導入が必要です。この作業は、実験生物学者にとって困難な作業になる可能性があります。したがって、データの処理、処理、分析のステップは、新しい発見の可能性を低下させながら、科学研究を大幅に遅らせる可能性があります。理想的には、生体画像解析用のソフトウェアフレームワークは、生の顕微鏡ファイルの処理からセグメンテーションと追跡、生物学的洞察を抽出するための下流分析に至るまで、分析のすべてのステップでユーザーを支援する必要があります。実際には、バイオ画像解析のための新しいソフトウェアの急速な開発は、前向きな結果ではありますが、特定の解析ステップに固有のツールのランドスケープが分散したり、高度なプログラミングの専門知識が必要になったりするという副作用がありました。これにより、ユーザーは分析ワークフローを組み立てるという困難なタスクを残し、多くの場合、次のツールと互換性を持たせるためにデータを保存、操作、変換するパイプラインが最適ではないことがわかります。また、バイオイメージ解析の開発は単一のプログラミング言語に標準化されておらず、ImageJ¹²またはQuPath¹³プラグイン(Java)、Napariプラグイン(Python)¹⁴、またはPythonスクリプトとして多くのツールが開発されています。場合によっては、この困難な環境により、科学者は手動分析を選択することになりますが、このプロセスは時間がかかるだけでなく、人間のバイアスをもたらし、再現性を妨げます。

これを解決するために、多次元顕微鏡データを分析するためにPythonで記述されたオープンソースのGUIベースのソフトウェアツールセットであるCell-ACDC(Cell-Analysis of the Cell Division Cycle)¹⁵が開発されました。重要なことに、Cell-ACDCは、両方のセグメンテーション(Cellpose、StarDist、Segment Anything、YeaZ、YeastMateなど^{16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27,28})および追跡(Trackastra、Trackpy、Bayesian Tracker、Cell-ACDCなど19,29,30,31,32,33,34)。これらのモデルは、注釈付きデータを視覚化するためのフレームワークとコンピューター支援による手動修正によって補完されます。さらに、同じフレームワーク内で、Cell-ACDCは画像解析パイプラインの各ステップにモジュールを提供し、データの処理、処理、保存を自動的に処理します(図1)。より具体的には、インスタンスセグメンテーション(例えば、単一細胞)、オブジェクト追跡、細胞状態の注釈(例えば、細胞周期段階)、および利用可能な蛍光チャネルの分析を含む様々な形態の定量化を実行可能にする。

Cell-ACDCの主な強みの1つは、生細胞のタイムラプス顕微鏡データの分析ですが、これは時点間で一貫性が必要なため、大きな課題となっています。単一細胞の自動セグメンテーションと追跡のためのモデルは数多く存在しますが、複雑な生物学的問題に対処するには手動補正が依然として不可欠です。Cell-ACDC は、補正プロセスを合理化するために特別に設計された一連のツールを提供します。インテリジェントなアルゴリズムを統合して、手動調整の数を最小限に抑えます。特に、修正は関連するすべての将来および過去のフレームに自動的に伝播され、分析全体を通じてデータの整合性が維持されます。モジュール設計とユーザーベースの拡大を考慮すると、このソフトウェアの継続的な開発が優先事項であり、新しいモデルの統合とコミュニティの進化するニーズへの対応に継続的な取り組みが重点を置いています。

Protocol

注:Cell-ACDCは、プログラミングのバックグラウンドがないユーザーにとって、できるだけ明確で直感的になるように設計されています。これは主に、分析ワークフローをより小さくわかりやすいステップに分割し、ツールチップと情報ボタンを通じて追加情報を提供することによって実現されます。Cell-ACDCは、実行順序が順次ではないことが多い幅広いステップをカバーするため、決定チャートを 図2に示します。次のガイドでは、具体的な例を説明します。手順 10 と 11 を使用して、手順 3 でダウンロードした提供されたデータを使用する代わりに、他のデータをインポートできます。

1. Cell-ACDCのインストール

注: Cell-ACDC は現在、Python パッケージ インデックス (PyPI) を介して Python パッケージとして配布されており、コマンド pip install "cellacdc[torch]" を使用してインストールできます。

1. Miniforge のセットアップ
   1. Miniforge の Web サイトからインストーラーをダウンロードします (詳細については、 材料表 を参照してください)。
   2. Miniforge をインストールする: Windows の場合は、ダウンロードしたインストーラーを実行し、指示に従います。 Mac または Linux の場合は、ターミナルを開き、次のコマンドを実行します。
      curl -L -O "https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Miniforge3-$(uname)-$(uname -m).sh
   3. インストールが完了したら、以下の手順に従って正しいターミナルを開きます。
      1. Windows の場合は、Win + S キーを押し、「Miniforge Prompt」と入力して Enter キーを押します。
      2. Mac/Linux の場合: ターミナル アプリを開きます。
2. 仮想環境を管理します。
   1. プロンプトで、次のコマンドを入力して仮想環境を作成します。次に、 Enter キーを押してコマンドを実行します。
      conda create -y -n acdc python=3.12
   2. 以下を実行して環境をアクティブ化します。
      conda アクティベート ACDC
3. 取り付け
   1. 環境をアクティブにして、以下のコマンドを実行して Cell-ACDC をインストールします。
      pip install "cellacdc[トーチ]"
   2. インストール後、 Cell-ACDC -y を実行して、ソフトウェアのセットアップを完了させます。

2. Cell-ACDCの実行

1. 正しい端末を開きます(手順1.1.3を参照)。
2. 次のコマンドを実行して、環境をアクティブ化します。
   conda アクティベート ACDC
3. 次のコマンドを実行して、Cell-ACDC を起動します。
   セル-ACDC

3. サンプルデータのダウンロード

注:サンプルデータは、Windowsでは「C:\Users\%USERNAME%\acdc-appdata\acdc-examples\TimeLapse_2D\Position_8」にダウンロードされ、MacOSおよびLinuxでは「~/acdc-appdata/acdc-examples/TimeLapse_2D/Position_8」にダウンロードされます。ウェルカムガイドが表示されない場合は、Cell-ACDCランチャーのメインウィンドウ(図1)のメニューバーで[ヘルプ]>[ウェルカムガイド](図3B)を選択します。

1. [ ダウンロード] を選択し、タイムラプスの例でテスト します(図 3B)。
2. ダウンロードが完了するまで待ちます。
3. [ いいえ、GUI へのデータの直接ロードを停止します]をクリックします。

4. データ準備モジュール

注:セグメンテーションの前にデータを整列させ、 関心領域(ROI) を選択できます。これらの手順はオプションですが、時間の経過とともに視野がずれる場合、またはデータの一部のみが関心がある場合にそれぞれ有益です。

1. メインウィンドウで [データ準備モジュールの起動...] をクリックして、データ準備モジュールを開きます (図 1A、データ前処理モジュール)。
2. データを含むフォルダーを選択します。
   1. 新しいウィンドウのツールバーにある フォルダーアイコン をクリックして、顕微鏡データをロードします(図4A)。
   2. データを含むフォルダーを選択し、[ フォルダーの選択]を押して選択を確定します。
3. ドロップダウン メニューを使用して、 phase_contr チャネルを選択して、配置プロセスのチャネルを選択します。次に、[ OK ]を押して選択を確認します(図4B)。
4. [OK]を押して、イメージのプロパティを確認します(図4C)。
   注:Zスタックデータを操作しているが、セグメンテーションに1つのスライスのみを使用する場合は、 スライダーを使用して適切なZスライスを選択します。必要に応じて、ツールバーのボタンを使用して、選択範囲を他のフレームに適用します。
5. 位置合わせプロセスを実行します。
   1. ツールバーにある スタート ボタンをクリックします(図5A)。
   2. [ はい ]をクリックして、位置合わせプロセスを開始します。
      注: [ いいえ ]をクリックすると、位置合わせをスキップできます。
   3. [OK] を押して、パディングに関する情報が確認されていることを確認します。
      注: データサイズによっては、配置に時間がかかる場合があります。
   4. プロセスが完了したら、 OK を押して位置合わせを終了します。
6. ROI とバックグラウンド ROI を設定します。
   1. データ準備 GUI の下部にあるフレーム選択スライダーを使用して、セグメンテーション ビデオの最後のフレームに移動します。
   2. 自動的に追加された背景の ROI は、画像上でドラッグするか、ひし形を使用してサイズを変更して調整します。バックグラウンド ROI にセルが含まれていないことを確認します。ROIはそのままにしておきます(図5B)。
      注: 追加の ROI を定義するには、ツールバーにある [ クロップ ROI の追加 ] ボタンをクリックし、ビューアで選択します。通常、ROI は、関連するフレーム全体で関心のあるすべてのセルを網羅しながら、できるだけ小さくする必要があります。ただし、このプロトコル内で再現性を確保するために、変更しないことをお勧めします。
7. 選択した ROI を新しい画像ファイルにトリミングするには、左端の [トリミング] ボタンをクリックします。
   注: この手順はオプションです。トリミングされた画像が必要ない場合は、ウィンドウを閉じることができます。すべての ROI とバックグラウンド ROI の座標は自動的に保存され、後でセグメンテーションに使用できます。ROI が変更されていない場合、これらのボタンは何もしません。切り抜きオプションには、XY 方向、Z スライス、または特定の時間範囲が含まれます。各ボタンには、トリミングされる寸法のラベルが付けられます。
8. 整列されたデータを保存する
   1. ウィンドウを閉じるボタンを使用してウィンドウを閉じます (たとえば、Windows では右上隅にある X 、macOS または Linux では左上隅にある赤い点)。
   2. [はい、整列されたデータを保存します]を押して、整列されたデータを保存します。
   3. [ はい、整列したデータをもう一度保存します] をクリックして確認します。
9. ステップ 4.7 をスキップしておらず、ROI が変更されていない場合は、トリミングされたデータを保存します。
   1. [ はい、切り抜いたデータを保存します] を選択して、切り抜いたデータを保存します。
   2. [ はい、切り抜きしてください] を押して、切り抜きの保存を確認します。
   3. [ OK] をクリックして、既定のフォルダー パスを確認します。
      メモ:トリミングされていないデータを保持するには、別のフォルダを選択します。
   4. [ はい、上書きします] を選択して、既定のパスが以前に使用されていたかどうかを確認します。
   5. プロセスが完了したら、[ OK] を押して確認します。

5. セグメンテーションに最適なモデルとパラメータを見つける

注:Cell-ACDCは、最適なセグメンテーションパラメータを見つけるためのリアルタイムフィードバックを備えたGUIを提供します(図6)。一般に、これらのモデルはサードパーティによって提供されており、それぞれに独自のドキュメントがあります。最適なセグメンテーション モデルとその最適なパラメーターを決定するのはユーザーの責任であり、ユーザーは試しているそれぞれのモデルのドキュメントで詳細を確認する必要があります。

1. メインウィンドウで [Launch GUI...]をクリックします(図1A、モジュールの視覚化と修正)。
2. サンプルデータを読み込みます。
   1. 新しいウィンドウのツールバーにある フォルダアイコン をクリックして、フォルダ選択メニューを開きます。
   2. データを含むフォルダーを選択し、[ フォルダーの選択] を押して選択を確定します。
3. 視覚化するチャネルを選択します。ドロップダウンメニューを使用して、セグメント化するチャネル phase_contr を選択し、「 OK」 を選択して確定します。
4. データの読み込みを終了します。
   1. [ OK ] を押して、デフォルトのセグメンテーション マスク名を確認します。
   2. 読み込まれた位置の[OK]をクリックして、画像のプロパティを確認します。
   3. [ いいえ ]を選択すると、追加の蛍光データが読み込まれないようにします。
5. モードセレクター(図6「モードセレクター」)で、セグメンテーションとトラッキングモードを選択します。
6. 最適な前処理設定を見つけます。
   1. [画像>前処理... をクリックして、カスタム前処理ウィンドウを開きます(図7A)。
   2. ドロップダウンメニューで 「ホットピクセルを削除」 または別の必要な前処理ステップを選択します。
   3. 歯車アイコンを使用して、ステップの設定を初期化および変更します。情報ボタンを使用して、ステップと使用可能なパラメータに関する情報を表示します。設定は変更しないままにします。
   4. プラスアイコンを使用して、もう 1 つのステップを追加します。
   5. 「 強度のスケールを変更 」を選択し、手順 5.6.1 と 5.6.2 を繰り返して設定を確認します。
   6. プレビューチェックボックスをオンにすると、ステップの効果をリアルタイムで確認できます。
   7. [すべてのフレームに適用]をクリックします(図7B)。
   8. [前処理済みデータの保存] を押して、保存プロセスを開始します。
   9. [ OK ] を押して、既定の名前を確認します。
   10. [ レシピの前処理 ] ウィンドウを閉じます。
7. 最適なセグメンテーション設定を見つけます。
   1. 上部のリボンでセグメント >セグメント表示フレーム を選択し、 YeaZ_v2 を選択します(図8A)。
   2. プロンプトが表示されたら、[ OK ]を押して YeaZ_v2 をダウンロードします。
      注: ダウンロードには数分かかる場合があります。進行状況がコンソール ウィンドウに表示されます。ダウンロード中に GUI を閉じないでください。
   3. デフォルトのパラメータは変更しません。
      注: ほとんどのパラメータには、詳細なガイダンスを提供する 情報 ボタンがあります。
   4. 後処理セグメンテーションパラメータをチェックして、後処理を有効にします(図8B)。
   5. [OK] をクリックしてパラメーターを受け入れます。
      注: セグメンテーションには、モデルの複雑さ、画像サイズ、およびコンピューターの仕様によっては、少し時間がかかる場合があります。特に、Cellpose バージョン 4 は非常に遅い場合があります。
   6. 自動セグメンテーションの有効化について尋ねられたら、[ いいえ] を選択します。
   7. セグメンテーションが正常に機能することを確認します。
   8. 手順5.7.1を繰り返して、セグメンテーションパラメータを再度開きます。
   9. セグメンテーションの結果が期待どおりの場合は、 すべてのパラメータをレシピファイルに保存を押します。それ以外の場合は、セグメンテーションパラメータを変更し、手順5.7.4から5.7.8を繰り返します。
   10. テキスト入力を使用して、セグメンテーションレシピにテストという名前を付けます。
   11. [ OK] をクリックして、名前を受け入れます。
   12. [ OK ] を押して、ワークフローの保存を終了します。
   13. パラメータ選択画面を閉じます。
8. GUIウィンドウを閉じる
   1. GUIウィンドウを閉じます。
   2. [ いいえ ]を押すと、閉じる前に保存されません。

6. セグメント化と追跡(バッチ処理)

1. メインウィンドウで[ Launch segmentation module... ]をクリックします(図1A、「セグメントと追跡」モジュール)。
   1. サンプルデータを選択します。Cell-ACDCのフォルダセレクタでデータを含むフォルダを選択し、[ フォルダ選択] を押して選択を確定します。
2. バッチ処理のパラメーターを選択します。
   1. セグメント化のチャネルとしてチャネル phase_contr_preprocessed を選択します。[ OK ] を押して選択を確定します。
      メモ:一部のモデルでは、入力として追加のチャンネルを使用します。このチャンネルは、後で他のセグメンテーションパラメータを設定するときに選択できます。
   2. [ OK] をクリックして、画像のプロパティを確認します。
3. セグメンテーションモデルの設定を行います。
   1. セグメンテーションに使用するモデルとして YeaZ_v2 を選択し、[ OK] をクリックして選択を確定します。
   2. [ 保存したレシピを読み込む...] ボタンをクリックして、以前に保存したレシピを読み込みます。
   3. リストから segmentation_recipe_test.ini を選択し、[ OK] をクリックして選択を確定します。
   4. 読み込みが成功したというメッセージを閉じるには、「 OK」を押してください。
   5. [ OK] を選択してパラメーターを確認します。
4. その他のセグメンテーション設定を確認します。
   1. [ OK ] を押して、セグメンテーション ファイルのデフォルト名を受け入れます。
   2. [ いいえ ] を選択して、画像全体をセグメント化することを確認します。
   3. [ OK] を選択して、ストップフレームをタイムラプスの最後のフレームとして設定します。
5. トラッキング設定を行います。使用するトラッキング方法として YeaZ を選択し、[ OK] を押して選択を確定します。
6. セグメンテーションと追跡のルーチンを実行します。
   1. 「 今すぐ実行」 をクリックして、セグメント化およびトラッキングパイプラインを実行します。
      注: 画像サイズ、モデルの複雑さ、およびコンピューターの仕様によっては、数時間かかる場合があります。テスト実行では、GPU のないデバイスでは、 YeaZ_v2 を使用したテスト データのセグメント化に約 2 分かかりました。
   2. 「 OK」 をクリックして、セグメンテーションを完了します。

7. セグメンテーションとトラッキングのエラーの修正

注:一般に、前のフレームと比較して現在のフレームに欠落しているセルは、黄色の輪郭とIDで示されます。新しく検出されたセルは、赤いIDと太い輪郭で表示されます。失われたと受け入れられた細胞は、緑色の輪郭とIDで表示されます。

1. メインウィンドウの 「Launch GUI...」をクリックします(図1A「視覚化と修正」モジュール)。
2. サンプルデータを読み込みます。
   1. 新しいウィンドウのツールバーにある フォルダ アイコンをクリックします。
   2. データを含むフォルダーを選択し、[ フォルダーの選択] を押して選択を確定します。
3. 視覚化するチャネルを選択します。ドロップダウンメニューを使用してチャンネル phase_contr_preprocessedを選択し、[ OK] を選択して確定します。
4. セグメンテーションマスク名を選択します。[ 選択したものを読み込む] を選択して、前の手順で作成したセグメンテーション ファイルを読み込みます。
5. データ読み込みプロセスを終了します。
   1. 読み込まれた位置の[OK]をクリックして、画像のプロパティを確認します。
   2. [ いいえ ]を選択すると、追加の蛍光データが読み込まれないようにします。
6. モードセレクター(図6「モードセレクター」)を使用して、セグメンテーションモードとトラッキングモードを選択します。
   注: GUI の下部にあるチェックボックスを使用して、表示される注釈を変更します。左右の画像には異なる注釈を表示できます。
7. リアルタイムトラッカーを選択します。メニューバー(図6「メニューバー」)で、[ トラッキング]>[リアルタイムトラッキングアルゴリズムの選択 ]に移動し、目的のリアルタイムトラッカーを選択します。出芽酵母には Cell-ACDC または Cell-ACDCの2ステップ を、他の生物には Cell-ACDC対称分裂 を使用します。
8. セグメンテーションとトラッキングを修正します。
   1. 左右の矢印キーを使用して、フレーム間を移動します。
   2. フレーム 10 に移動します。
   3. S キーを押して 、手動芽分離ツールをアクティブにします。
   4. 右クリックすると、セル 1 のセグメンテーション マスクが自動的に分割されます。
   5. フレーム 14 に移動します。
   6. キーBを押してブラシをアクティブにします。
   7. マウスの左ボタンを使用して、つぼみの欠落しているセグメンテーションマスクを描画します。
   8. セグメンテーションとトラッキングエラーを修正しながら、後続のフレームを調べます。使用可能なツールを使用します (図 6「ツールバーの編集」)。少なくともフレーム42までは修正してください。
      注: ほとんどのツールには、その機能を説明するツールチップがあります。ツールにカーソルを合わせると、ツールチップが表示されます。

8. 細胞周期の注釈

注:このステップに進むのは、対象のすべてのフレームのセグメンテーションとトラッキングの補正が完了した後だけです。細胞分裂の種類(哺乳類細胞などの対称、または出芽酵母などの非対称)に応じて、正しいアノテーションモードを使用します。サンプルデータについては、「非対称に分割するセル」の手順8.1を参照してください。ステップ8.2では、対称分裂細胞の一般的なワークフローについて説明します。

1. 非対称に分裂する細胞
   注:出芽酵母のような生物の場合、芽は母親に割り当てることができます。両方のオブジェクトが同じフレーム内に存在する必要があります。デフォルトでは、出芽酵母の注釈に基づいて予想される細胞周期段階が表示されます。芽の細胞周期段階は赤で表示され、他のすべてのオブジェクトの細胞周期段階は白で表示されます。母親は黄色の破線でつぼみに接続されています。
   1. モードセレクターを使用して細胞周期解析をアクティブにします(図6「モードセレクター」)。
   2. プロンプトが表示されたら、[ はい、フレーム 1 に移動します] を選択します。
   3. 左右の矢印キーを使用して、フレーム間を移動します。
   4. フレーム 41 に移動します。[ OK ] をクリックして、プロンプトが表示されたら [細胞周期注釈] テーブルの初期化を受け入れます。
   5. セル1またはそのつぼみを右クリックして接続を分離し、細胞分裂イベントに注釈を付けます。
   6. 関連するすべてのフレームが表示されるまで続行します。利用可能なツールを使用して、マザーバッドの自動割り当ての間違いを修正します(図6「ツールバーの編集」)。
   7. 利用可能なツール
      注: [ マザーバッドアソシエーションの切断/再バインド ]ツールを除くこれらのツールは、カスタマイズ可能なショートカットを使用するか、ツールバーの関連ボタンを押すことでアクティブにできます。
      1. つぼみを母に割り当てる(A): つ ぼみを母に割り当てツール をアクティブにします。イヤホンのマウス の右ボタン を押し続けます。対応するマザーセルにドラッグし、マウスボタンを放します。
         注意: このツールは、母親へのつぼみの自動割り当てが正しくない場合に使用します。
      2. 不明な履歴に注釈を付ける (U): 不明 な履歴に注釈を付けるツール をアクティブにします。 マウスの右ボタン を使用して、不明な履歴を持つものとして注釈を付ける必要があるセルをクリックします。
         注:このツールを使用して、履歴が不明なセルに手動で注釈を付け、自動推論が不十分な系統のあいまいさを修正するのに役立ちます。
      3. 細胞周期アノテーションの再初期化
         注:このオプションを使用して、現在のフレーム以降からセルサイクルアノテーションアルゴリズムを再実行します。これにより、セグメンテーション/トラッキングデータに対して行われた最近の修正または更新との一貫性が確保されます。
      4. 母芽の関連付けを解除/再結合する: 他のツールが選択されていないことを確認します。既存のマザーとバッドのペアを右クリックして関連付けを解除するか、もう一度右クリックして接続を再確立します。
2. 対称分裂細胞
   注: この機能はベータ テスト中で、まもなく正式にリリースされる予定です。2つ以上の娘細胞を単一の母細胞に割り当てることが可能です。潜在的な母細胞は、前のフレームには存在するが現在のフレームには存在しない細胞であり、潜在的な娘細胞は現在のフレームに新しく出現する細胞です。
   1. モードセレクタを使用して 、Normal division: Lineage tree をアクティブにします(図6「モードセレクタ」)。
   2. プロンプトが表示されたら、[ はい、フレーム 1 に移動します] を選択します。
   3. 左右の矢印キーを使用して、フレーム間を移動します。
   4. 使用可能なツールを使用して、自動母娘割り当ての間違いを修正します(図6「編集ツールバー」)。
   5. [ 伝播] をクリックして、プロンプトが表示されたら変更を伝播します。
   6. 利用可能なツール
      注:これらのツールは、ショートカットまたはツールバーのそれぞれのボタンを使用してアクティブにできます。
      1. 新しいセル ID の母体を見つける (F): 新しい細胞 ID の母体を検索 ツールをアクティブにします。新しいセルを右クリックして、候補のマザーセルを循環します。 Shift + 右クリック して、候補を逆方向に切り替えます。
         注:このツールを使用して、娘細胞の母細胞を割り当てたり変更したりします。
      2. 不明な母を設定 (U): 不明 な母を設定 ツールをアクティブにします。母が不明なセルを 右クリック します。
         注:このツールを使用して、細胞の母を未知として手動で指定します。

9. データの保存

1. 上部のリボンで [ファイル] > [保存] に移動します。
2. [ 測定値を設定...] をクリックして、目的の測定値を選択します。
3. mCitrineメトリックの横にあるチェックボックス、またはその他の必要な測定値をオンにします。
4. [ OK] をクリックして確認します。
5. [ はい ]をクリックして、測定値を保存します。
6. [ OK ]をクリックして、測定値を保存するフレームを確認します。
7. データの連結に関するプロンプトが表示されたら、[ いいえ ] をクリックします。

10. データ構造を作成する

注:このセクションでは、セグメンテーションと追跡のための顕微鏡データの準備について説明します。これは、「サンプルデータのダウンロード」でダウンロードしたデモンストレーションデータを使用する場合はスキップできます。生成されるデータ構造を 図 9 に示します。

1. 顕微鏡ファイルを空のフォルダーに入れます。
   注:.czi(ツァイス)、.lif(ライカ)、.nd2(ニコン)などの顕微鏡形式、および単一の.tifファイルと.pngファイルがサポートされています。
2. モジュール 0をクリックします。データ構造の作成... をメインウィンドウにします (図 1A、「データ構造の作成」モジュール)。
3. [ BioIO ]または [フィジーマクロ]を選択します。
   1. Windows を使用している場合は [BioIO を使用] をクリックし、MacOS および Linux ユーザーの場合は [フィジー マクロを使用] を選択します。
      注:以下では、Windowsを使用していることを前提としています。
   2. BioIO をインストールするように求められたら、[ OK] を押してインストールします。
   3. 顕微鏡ファイルの配置を選択します。ドロップダウンメニューを使用して顕微鏡ファイルの配置に一致するオプションを選択し、[ OK] を押して確定します。
4. ソースフォルダとデスティネーションフォルダの選択、およびデータ読み込み戦略
   1. [ 完了] を押して、ファイルが空のフォルダーにあることを確認します。
   2. Cell-ACDCのフォルダセレクタを使用して、ファイルを含むフォルダを選択します。
   3. [ フォルダの選択] を押して、フォルダを選択します。
   4. もう一度 [フォルダの選択 ]を押して、保存先のフォルダと同じフォルダを選択します。
      注:生の顕微鏡ファイルは削除されません。
   5. [はい、位置全体を一度にロードします] を選択します。
5. BioIO サブパッケージのインストールを求められたら、[ OK] を押してインストールします。
6. 入力ファイルのメタデータを設定します。
   1. メタデータを修正します。
      注: [チャンネル名] フィールドの横にある小さな目のアイコンをクリックして、[寸法の順序] を再確認します。未加工ファイルからロードできなかったその他のメタデータが強調表示されます。
   2. [ OK] を押してメタデータを確認します。
   3. はいを押して、寸法の順序を確認します。
7. プロセスが完了するまで待ちます。
8. プロセスが終了したら、 はい を押してウィンドウを閉じます。
   注: データ構造の作成には、データサイズによっては数時間かかる場合があります。

11. データ前処理ユーティリティ

注:分析に進む前に画像を処理するためのいくつかのオプションがメインウィンドウで使用できます。これらのツールにアクセスするには、メインウィンドウのメニューバーにある [ユーティリティ] ドロップダウンメニュー(図1B「ユーティリティ」)に移動し、 画像の前処理にカーソルを合わせて、使用するオプションを選択します。次の 2 つの例を示します。

1. チャンネルを結合: 2つ以上の画像チャンネルを結合します。
   注:たとえば、2つの蛍光チャネルを平均化できます。
2. 画像のサイズ変更: これを使用して、非常に大きな画像データセットのサイズを縮小します。
   注: これにより、処理時間が大幅に短縮され、多くの場合、セグメンテーションの品質にはほとんどまたはまったく影響しません。

12. トラブルシューティング

1. Cell-ACDC がクラッシュした場合は、[ 問題] タブに移動し、緑色の [ 新しい問題 ] ボタンをクリックして、Cell-ACDC GitHub ページでバグ レポートを作成します。提供されたテンプレートに従って、問題の診断と解決に必要なすべての関連詳細を含めます。または、 image.sc フォーラムでタグ #cell-acdc を使用して支援を求めるか、責任著者の 1 人に連絡してください。多くの場合、特にパッケージをインストールした後は、ソフトウェアを再起動するだけで問題が解決する可能性があります。
2. Cell-ACDC がフリーズしたり応答しなくなったりした場合は、コンソールで進行状況の更新を確認します。特に Cellpose バージョン 4 などの計算負荷の高いモデルを使用したり、大規模なデータセットを処理したりする場合は、長いセグメンテーション時間がかかるのが正常です。Cell-ACDC が応答しない場合は、手順 12.1 を参照してください。
3. 自動セグメンテーションに背景が正しく含まれていない場合は、前処理ステップで背景が過度に滑らかになっている可能性があるかどうかを確認します。多くのセグメンテーション モデルは、生の (前処理されていない) 画像でトレーニングされており、背景に十分なテクスチャが欠けている場合、パフォーマンスが低下する可能性があります。

Results

3Dにおける腫瘍スフェロイドの核体積定量化

自動3D顕微鏡(zスタック)により、科学者はオルガノイドなどの複雑な多細胞システムを視覚化できます。単一細胞レベルで形態学的および蛍光シグナル特性を定量化するには、多くの場合、3Dでの細胞セグメンテーションが必要になります。次の例は、Cell-ACDCが核染色チャネルからの数千の細胞を含むオルガノイドの核をセグメント化し、それらの体積を定量する方法を示しています(参考文献⁹のデータ)。セグメンテーションは、^Ref.9でトレーニングおよび公開されたカスタムCellposeモデルを使用して実行されました。トレーニング済みのCellposeモデルは、Cellpose v2のモデルパラメータを選択するときにGUIで重みファイルパスを指定することで、Cell-ACDCで直接使用できます。セグメンテーションは、Cell-ACDCの2番目のモジュールを使用して実行され、すべての画像をバッチ処理しました(図1A、「セグメントとトラック」モジュール)。次に、結果を 3 番目のモジュール GUI で視覚化しました (図 1A、「視覚化と修正」モジュール)。このモジュールは、複数の注釈オプション(輪郭、オーバーレイされたセグメンテーションマスク、テキストIDなど)を使用して、何千もの単一オブジェクトを視覚化するように最適化されています。3Dマスクからの測定値が計算された後、利用可能なすべての測定値がGUIに直接文書化されました。これらにアクセスするには、上部のメニュー バー (図 6、「メニュー バー」) に移動し、[ 測定] メニューを選択してから [ 測定値の設定...] を選択します。ポップアップダイアログを使用すると、ユーザーは情報ボタンから測定固有の情報を取得し、保存する測定値を選択できます。 図10の代表的な結果には、オブジェクト内の総ボクセルにピクセルサイズの2乗とボクセル深度を掛けて計算した各オブジェクトの体積である「cell_vol_fl_3D」が使用されました。これらのプロパティは、顕微鏡の生ファイルから自動的に抽出されるか、ユーザーによって提供されます。このGUIから測定値を計算するには、生の画像をロードする必要があります。したがって、プロセスを合理化し、バッチ処理を可能にするために、[ ユーティリティ] メニュー(図1B、「ユーティリティ」)から、サブメニューの [測定 ]に移動し、[ 1つ以上の実験の測定値を計算]に移動して、測定値を計算することもできます。最後に、代表的な結果として核体積分布をプロットしました(図10)。この分析により、おそらくセグメンテーションアーティファクトが原因である小さな核のかなりの割合が明らかになりました。セグメンテーションマスクから小さなオブジェクトをフィルタリングすることで、簡単に削除できます。同時に、非常に大きな核は、セグメンテーション中に結合した核が原因である可能性があります。アーティファクトを特定し、細胞サイズに関する追加の生物学的情報を抽出するために、オブジェクト(単一細胞など)の体積分布をプロットすることを常にお勧めします。

タイムラプス顕微鏡データの定量化

タイムラプス顕微鏡を使用すると、細胞動態を単一細胞レベルで直接観察できます。細胞セグメンテーションに加えて、時間的ダイナミクスを抽出するには、細胞追跡や細胞血統アノテーションなどの追加の分析が必要です。これらの分析ステージは相互依存しているため、パイプラインの早い段階で発生したエラーは、後のステップに伝播する可能性があります。そのため、セグメンテーション、トラッキング、アノテーションのエラーを継続的に可視化し、修正する必要があります。以下は、Cell-ACDCがこれらのタスクに取り組むのに適していることを示しています。2つの異なるモデル生物の2つのデータセットが選択されました:1)出芽酵母(^Ref.35のDCY001-1株、2つのヒストンH2Bタンパク質、Htb1とHtb2がmCitrineでタグ付けされている)、および2)マウス胚性幹細胞(mESC、^Ref.22からのデータ)。

これら2つのデータセットは、Cell-ACDCで利用可能な2つのアノテーションモード、つまり非対称および対称(つまり、対称細胞質分裂、または「正常」)細胞分裂を強調しています。分裂のモードが異なるため、2つの生物は異なる追跡と注釈のフレームワークを必要とします。

非対称分裂では、母細胞は芽を形成し、成長し、最終的に分離して娘細胞になります。分裂後、母細胞は元の細胞IDを保持し、その世代番号は1つ増加しますが、娘細胞には新しい細胞IDが割り当てられ、その世代番号は1に設定されます。出芽期は細胞周期のS/G2/M期に対応し、Cell-ACDCではそのように注釈が付けられています。これらのアノテーションの選択は、出芽酵母の細胞周期に関連する典型的な生物学的問題に対処するのに役立ちます。

「対称的」分裂(哺乳類細胞など)の場合、母細胞は2つの娘細胞に分裂します。母細胞、つまりそのIDは分裂すると消え、2つの娘細胞は新しいIDを受け取ります。さらに、娘細胞の世代数は、母細胞に対して1つ増加します。Cell-ACDC は、親 ID、ルート ID (系統の先頭にある元の祖先セル)、および姉妹 ID も追跡します。

どちらの注釈モードでも、注釈エラーを修正するための革新的なフレームワークが開発され、修正は過去および将来のすべての関連時点に自動的に伝播されます。視覚化、注釈、および修正は、3番目のモジュールGUIで実行されました(図1A「視覚化と修正」モジュールおよび 図6)。データセット1の細胞をセグメント化して追跡するために、モデル YeaZ_v2²⁶ を位相差チャネルに適用し、核(ヒストン)チャネルには StarDist²⁵ モデルを使用しました。次に、ユーティリティ Tracking and lineage > Track and count sub-cellular objects (図1B、 ユーティリティメニュー バー)を使用して、Cell-ACDCは各核に対応する細胞のCell IDを割り当て、細胞マスクと核マスクから生成されたテーブル間の一貫性を確保しました。

データセット2では、 DeepSea²² セグメンテーションモデルを使用しました。3つのモデルはすべてCell-ACDCですでに利用可能であり、複数のセグメンテーションモデルをソフトウェアに統合する利点を示しています。

セグメンテーションと追跡エラーが修正されたら、細胞の血統に注釈を付け、数値特徴を計算し、下流の分析を実行しました。データセット1では、列TaYFP_amount_autoBkgrとセグメント化された核の数(図11A)を時間に対してプロットしました。「TaYFP」は核チャネルの名前です。「amount_autoBkgr」は、落射蛍光画像³⁶から抽出された総細胞タンパク質量の代用である。これは、各セルマスクの平均蛍光強度とバックグラウンド中央値の差にセル面積(ピクセル単位)を掛けた値として計算されます。ここでは、背景の中央値は、セルとしてセグメント化されていないすべてのピクセルから計算されます。予想通り、H2B量は芽の出現時に増加し始め(図11A-ii)、核分裂前に一定値に達します(図11A-iii)。ヒストンタンパク質の量は細胞周期に依存すると予想されるため、これはヒストンタンパク質の恒常性における重要な品質管理です。さらに、核の数を経時的にプロットすると、ヒストンタンパク質の量が核分裂のほぼ前後で最大に達することが確認されます。

データセット2では、細胞分裂中の選択した細胞の経時的な細胞面積がプロットされました。予想通り、セル面積は最大値に達するまで増加します(図11B-i)。その後、細胞が収縮するにつれて、細胞分裂(図11B-ii)まで減少します。最後に、2つの娘細胞のサイクルが再開されます。細胞が期待どおりに成長および分裂していることを確認するには、細胞周期にわたる細胞サイズの変化をチェックすることが不可欠であるため、これも推奨される分析です。

図1:Cell-ACDCモジュール。 (A)メインのCell-ACDCランチャーから発射できる4つの主要モジュールの概要。顕微鏡データをセグメント化、追跡、注釈付けした後、数値特徴は、3番目のモジュール(「視覚化と修正」)、または(B)上部のメニューバーの ユーティリティ メニューから計算できます。「ユーティリティ」は、ユーザー入力なしで複数のデータセットで自動的に実行できるルーチンです。測定値の計算に加えて、複数の出力テーブルを1つのテーブルに連結したり、サブセルラーオブジェクトを追跡したり、画像の前処理をしたりするユーティリティもあります。Cell-ACDCは、2D、3D(Zスタックまたはタイムラプス)、および4Dデータ(経時的なZスタック)をサポートし、任意の数の追加チャネルを備えています。数値特徴を含む出力テーブルは、下流の分析と生物学的発見に使用できます(図10 および 図11)。この目的のために、Cell-ACDC GitHub ページの Jupyter ノートブックが利用可能で、出力テーブルから取得できるプロットの例が含まれています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:Cell-ACDCの意思決定フローチャート。 データセットの種類と分析要件に応じて使用するモジュールの概要を示すフローチャート。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 3: サンプル データをダウンロードします。 (A) ウェルカムガイドを開きます。(B) プロトコルの複製に必要なサンプルデータをダウンロードします。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:データ準備用のデータを読み込む (A) データ準備 GUI にデータをロードします。(B)ロードするチャンネルを選択します。(C) 画像メタデータを編集して確認します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 5: データ準備プロセスの実行。 (A) プロセスを開始します。(B)位置ROI(トリミング用)と背景ROI。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:結果を視覚化して修正するための3番目のモジュールGUI。 3番目のモジュールGUI( 図1Aの「視覚化して修正」)のスクリーンショットと強調表示された項目。ツールバーのほとんどのボタンには、その特定の機能の使用方法を説明するツールチップ (ボタンの上にマウス カーソルを置くとアクセス可能) があることに注意してください。モードセレクターを使用して、「ビューア」、「セグメンテーションとトラッキング」、「細胞周期解析」(非対称に分裂する細胞用)、「正常分裂:系統ツリー」(哺乳類細胞などの対称的に分裂する細胞用)、「カスタムアノテーション」の5つのモードを切り替えることができます。ツールバーまたはメニューバーは、他のGUIに存在することが多いことに注意してください(例:「データ前処理」モジュール、 図1)。編集 ツールバー には、セグメンテーションとトラッキングのエラーを編集および修正するために使用できるすべての機能が含まれています(ブラシ、消しゴム、編集IDなど)。ロードされた画像は2パネルビューで表示され、異なる注釈オプションが必要な場合に役立ちます(例:左側の画像の細胞周期情報と右側の画像のID)。右側の画像をオフに切り替えることもできます(画像を右クリックして、 ミラー画像を表示の選択を解除します)。各画像パネルの側面には、強度レベルをすばやく調整するためのLUTスライダーが含まれています。LUTコントロールを右クリックすると、強度画像にさまざまなカラーマップを選択できます。さらに、右側には、強度画像に重ねるセグメンテーションラベルの色のLUTセレクターがあります( Segm.マスクと呼ばれる注釈オプション)。左側の画像の注釈オプションの左側には、自動保存、フォントサイズなどの一部の設定を制御するための追加のトグルがあります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:メインGUIで前処理を視覚化します。 (A)前処理ダイアログを開きます。(B) プロトコルで使用されるパラメータを使用したダイアログの前処理が初期化されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図8:メインGUIでセグメンテーション出力を視覚化します。 (A)セグメンテーションモデルを選択します。(B) セグメンテーションパラメータを設定します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図9:Cell-ACDCに必要なフォルダ構造。 Cell-ACDCを使用するには、データを特定のフォルダ構造に配置する必要があります。Cell-ACDCは、この構造を自動的に生成するモジュールを提供しますが、この構造がどのように見えるかを理解することが重要です。まず、すべてのファイルが Images というフォルダー内に存在する必要があります。次に、それらはすべて同じ名前、いわゆる「basename_」で始める必要があります。必要なファイルの最小セットは、シングルチャネルのTIFFファイル(2D、3D Zスタック、または3D+時間)と、末尾が「_metadata.csv」のCSVファイルです。このファイルは、2 つの列 (最初の列は Description と Values) を持つテーブルである必要があり、少なくとも SizeT のエントリと、フレーム数と Z スライスの SizeZ のエントリをそれぞれ含める必要があります。イメージ ファイルに Z スライスがない場合は、 SizeZ を 1 に設定する必要があります。同じことが、 SizeT が1でなければならないタイムラプス画像の場合にも当てはまります。CSV ファイルであるため、エントリは Description,value の 1 行で、カンマで区切られます ( 例: SizeZ,1)。複数のチャンネルの場合は、チャンネルごとに 1 つの TIFF ファイルを生成する必要があります。次に、 Images フォルダを「Position_1」というフォルダ内に配置する必要があります。複数のポジションが許可されており、連続した番号で名前を付ける必要があります。いずれかの Cell-ACDC モジュールにデータを読み込む場合、ユーザーは特定の位置フォルダーまたは実験フォルダー全体を選択できます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図10:腫瘍オルガノイドの3D定量化。 Cell-ACDCの3番目のモジュールGUIにロードされた代表的な腫瘍オルガノイド(⁹からのデータ)のスクリーンショット(左)、セグメンテーションマスクを強調表示する赤い輪郭を持つzスライスの例(中央)、および3Dセグメンテーションマスクから計算された細胞体積分布のヒストグラム(右)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図11:タイムラプス顕微鏡データの定量化。 (A)Cell-ACDCの3番目のモジュールGUIにロードされた出芽酵母細胞のタイムラプス顕微鏡データのスクリーンショット(左)と、代表的な細胞周期におけるヒストンH2Bタンパク質量の経時的な定量化(右)。ズーム画像は、細胞周期の開始時(i)、芽の出現時(ii)、および核分裂時(iii)のサンプル細胞とその芽(白い矢印)を示しています。データはChatzitheodoridou et ^al.35(B)Cell-ACDCの3番目のモジュールGUI(左)にロードされたマウス胚性幹細胞のタイムラプス顕微鏡データのスクリーンショットと、細胞分裂中の代表的な細胞の時間の関数としてプロットされた細胞面積(μm²)。ズームされた画像は、分裂前の最大細胞面積(i)、2つの娘細胞への分裂(ii)、および分裂後の最後に分析されたフレーム(iii)のサンプルセルとその娘を示しています。データはZargari et ^al.22,33から取得されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

多次元顕微鏡データの分析には、多くの場合、最先端の AI 主導モデルの使用が必要になります。ただし、これらのツールは迅速に開発され、導入には大きな参入障壁があります。さらに、生物学者は効果的なエラー修正のために結果の視覚化を必要とすることがよくあります。ここでは、科学者がCell-ACDCを使用してこれらの課題にどのように対処できるかを示します。

提示されたプロトコルの重要なステップは、最適なセグメンテーションモデルを選択することです。Cell-ACDCには、視覚的な選択を可能にするGUIが含まれています(図1A、「視覚化と修正」モジュール)。データを準備し、複数のデータセットをバッチ処理するためのツールも提供されています(図1A、データ構造の作成、データの前処理、セグメントとトラックモジュール、およびユーティリティ)。ユーザーは、 image.sc フォーラム (タグ #cell-acdc を使用) で問題を報告し、フィードバックを提供するか、Cell-ACDC GitHub ページで問題を開くことをお勧めします。

Cell-ACDCは、数千の核⁹を持つ画像のスフェロイドや、フレームあたり数百の細胞を持つ出芽酵母のタイムラプスデータなど、比較的大きなデータですでに使用されていますが、プログラムが正しく機能するには、シングルチャネルデータ全体をRAMにロードする必要があります。安定したパフォーマンスを確保するために、使用可能なメモリ内の画像ファイルサイズの約3倍を推奨します。現在、利用可能なシステムメモリを超えるデータセットは処理できませんが、OME-Zarr³⁷の統合により、アウトオブコア(遅延)読み込みのサポートが計画されています。

現在、Cell-ACDCの主な制限の1つは、ほとんどのツールが3D Zスタックまたは2D+時間データ用に開発されているため、3D+時間データセットの部分的なサポートです。したがって、Cell-ACDCの将来のバージョンでは、3D+時間データを完全にサポートして機能を拡張します。さらに、母細胞が2つの娘細胞に分裂する細胞である「対称的に」分裂する細胞(哺乳類細胞など)の細胞系譜注釈フレームワークの拡張に取り組んでいます(母細胞が細胞周期ごとに1回、出芽によって単一の娘細胞を生じさせる出芽酵母とは対照的です)。最後に、現時点では、Cell-ACDC は、単一チャネル データが完全に RAM に収まるデータに限定されています。そのため、上記のように遅延読み込みを実装する予定です。

Cell-ACDCは、リリース以来、新しいセグメンテーションおよびトラッキングモデルの追加、新しいアノテーションフレームワーク(現在ベータテスト中の哺乳類細胞など)、およびさまざまなパフォーマンスの向上など、常に改善されてきました。これらの開発のおかげで、科学者はCell-ACDCを使用して研究を加速し、科学的発見を可能にすることができます6,9,16,35,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48 ^、49。既存の方法と比較して、このソフトウェア フレームワークがユニークなのは、14,27,50,51 既存のモデルを活用して補完できるため、コミュニティの発展から恩恵を受けることができることです。Cell-ACDCの開発は、多次元顕微鏡データを解析するための参照フレームワークとして確立するために積極的に維持されています。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
赤ちゃん	ユリアン・ピーチ	10.7554/eLife.79812	Cell-ACDCでは、セグメンテーションおよび追跡ソフトウェアをオプションで自動インストール可能です
ベイズトラッカー	クリスティーナ・ウリクナ	10.3389/fcomp.2021.734559	Cell-ACDCでは、オプションで自動インストール可能な追跡ソフトウェアも可能です
セル-ACDC	フランチェスコ・パドヴァーニ	10.1186/s12915-022-01372-6	ソフトウェア
細胞核	クリスティーナ・ピンティルデ;エイロ・ロアキューテ;pez / アナ・リタ・ロドリゲス・ネヴェス / イヴァナ