3齢ショウジョウバエmelanogaster幼虫における嗅覚回路ニューロンの生体内および生体外カルシウムイメージング

カルシウムイオンはニューロンの活動を調節し、刺激に対する細胞の反応を促進する上で極めて重要な役割を果たしているため、ニューロンのカルシウム動態を理解することは、神経シグナル伝達と脳機能の根底にある複雑なメカニズムを解明するために非常に重要です。ニューロンのカルシウム動態はカルシウムイメージングによって監視でき、ショウジョウバエの幼虫を含む幅広い生物にわたるカルシウム媒介シグナル伝達に関するリアルタイムの洞察が得られます。ショウジョウバエの幼虫は、行動の根底にある回路機能を研究するための強力なモデルシステムとして台頭しています。これは、完全なシナプス分解能脳コネクトーム^{が生成された}わずか3つの生物のうちの1つです1。幼虫は、全^{脳レベルと}単一ニューロンレベルの両方でニューロンのイメージングと操作を可能にするさまざまな高度なツールに適しています^2,3。

カルシウムイメージングを介してショウジョウバエの幼虫ニューロンのカルシウム動態を測定する能力は、神経科学研究を進歩させるために極めて重要でした⁴。カルシウムイメージングの最近の進歩により、幼虫^の単一シナプス5のレベルでのカルシウムダイナミクスを、自由に動く幼虫^の多ニューロン記録まで測定することが可能になりました6。カルシウムイメージングは、カルシウム事象が幼虫全体の自然な生理学的文脈下で捕捉されるin vivo 4^、7、8、9、またはシミュレートされた生理学的条件下で保存された解剖された幼虫組織にカルシウム事象が記録されるex vivoで実施することができる¹⁰。全体として、研究者らはショウジョウバエの幼虫におけるカルシウムイメージング法のさまざまな反復を使用して、神経回路、感覚、学習と記憶、および行動の基本的なメカニズムを明らかにしてきました8,11,12,13,14,15,16,17 .しかし、幼虫のカルシウムイメージング研究は、特殊な機器の必要性と、モーションアーティファクトによるデータ解釈の問題により制限されています。

ここでは、3齢ショウジョウバエの幼虫におけるin vivoおよびex vivoカルシウムイメージングのための費用対効果が高く、簡単に実装可能な方法論を紹介します。抑制性嗅覚回路^{ニューロンである}Keystone-LNのカルシウム動態を画像化^し、幼虫の準備全体内でin vivoカルシウムイメージングを紹介し、解剖された幼虫の脳でex vivoカルシウムイメージングを紹介します。幼虫全体と解剖された脳は、イメージング条件下で約10〜15分間生存し、応答性を保ち、サンプルごとに複数の刺激試験を取得できます。組織の生存率を維持し、実験のばらつきを低減しながら、幼虫または組織サンプル全体を固定化するという課題に対処するために、生体適合性のあるシアノアクリレート局所組織接着剤であるGLUtureの使用を最適化しました。

アガロース包埋やピン留めなどの従来の幼虫固定化方法と比較して、この接着剤ベースのアプローチは、組織の生存率を維持しながらモーションアーティファクトを低減します^20,21;2光子イメージングシステムと比較して、スピニングディスクセットアップは機器コストを削減し、リソースが限られたラボのアクセス性を向上させます。最後に、データ分析のためにカスタム開発されたRスクリプトと組み合わせた簡単なイメージングアプローチについて説明します。私たちのアプローチは、幼虫のカルシウム画像研究へのアクセス性を高める可能性があり、臭いなどの外部刺激と神経調節剤などの内部刺激の両方の影響を調べるために適応できます。

1. カルシウムイメージングのためのショ ウジョウバエ 幼虫の3齢準備

1. 標準的なフライフード( 材料表を参照)でハエを25°C、相対湿度(RH)50〜60%、明暗サイクル12時間に維持します。
2. ニューロン同定のための赤色蛍光タンパク質(RFP)と、目的のニューロン(「X」)でGCaMP6f(カルシウム指示薬)を発現させるには、X-Gal4系統の処女女性とUAS-GCaMP6fおよびUAS-tdTomatoを保有する男性を交配します²²。
   注:この研究では、Keystone-Gal4系統を使用して、幼虫脳の抑制性局所ニューロン(Keystone-LN)の単一ペアでtdTomatoおよびGCaMP6fの発現を促進しました^18,19。
3. オスとメスのハエが交尾して産卵を48時間させた後、成虫を新鮮なバイアルに移します。
4. 3齢の幼虫(産卵後約120時間)を15%スクロース溶液に浮かせて抽出します。P1000マイクロピペットを使用して、浮遊幼虫を1,000 mLのガラスビーカーに移します。
5. ビーカー内の水を毎回800mLの新鮮な蒸留水に置き換えて、幼虫を3〜4回洗浄します。プロトコールの残りの部分に進む前に、幼虫を10分間休ませます。

2. 3齢ショ ウジョウバエ 幼虫の飢餓プロトコル(飢餓状態と非飢餓状態をテストする場合)

1. 6 cmのペトリ皿に実験用ワイプの小さな正方形を置き、2つの給餌室を準備します。飢餓していない状態では、350 μLの0.2 Mスクロース溶液を加えます。飢えた状態では、350 μLの蒸留水を加えます。
2. 同数の洗浄された幼虫を各給餌室に移します。幼虫にスクロース(飢餓していない)または蒸留水(飢餓状態)を室温で2時間食べさせます。

3. 生体内 カルシウムイメージング

注:組織接着剤を含むすべての実験は、標準的な実験室の安全慣行を使用して実施する必要があります。ニトリル手袋、白衣、安全ゴーグルまたはフェイスシールドなどの個人用保護具 (PPE) が必要です。綿手袋は、シアノアクリレートとの発熱反応のため避けるべきです。接着剤が皮膚、目、粘膜に接触しないようにしてください。皮膚が結合している場合は、その領域を温かい石鹸水に浸し、そっと分離します。目が露出した場合は、ぬるま≥湯で 5 分間洗い流し、直ちに医師の診察を受けてください。硬化した接着剤は燃焼すると刺激性の煙を放出する可能性があるため、接着剤は裸火や高熱から遠ざける必要があります。接着剤を使用しないときは、湿気や直射日光を避け、密閉容器に入れて≤30°Cで保管してください。

1. NaCl 110 mM、KCl 5.4 mM、CaCl₂ 1.2 mM、MgCl₂ 0.8 mM、D-グルコース10 mM、およびHEPES 10 mMの組成でカルシウムイメージングバッファーを調製します。使用しないときは4°Cで保管してください。
   注:110 mM NaClを含む修飾生理食塩水は、幼虫のCNS解剖およびイメージングに広く受け入れられている製剤であり、電気生理学およびイメージング研究で使用される典型的な範囲(≈108〜128 mM NaCl)^{23、24、25、26}に収まる。
2. 24 x 50 mm(厚さ1.5 mm)の顕微鏡カバーガラスに、シリンジから分注したワセリンを使用してウェルを作成します。
3. カバーガラスの中央に局所組織接着剤(60%2-オクチルおよび40%n-ブチルシアノアクリレート)を少量垂らします。ガラス棒を使用して接着剤を薄く均一な層に均一に広げます。
4. ブラシまたは細いワイヤーを使用して、1匹の幼虫を接着剤に慎重に移します。幼虫の腹側を接着剤にそっと押し付けます。接着剤を乾燥させて、幼虫が完全に固定されるようにします。
5. 幼虫が固定されたら、カバーガラスを倒立顕微鏡ステージに置きます(図1A)。

4. Ex-vivo カルシウムイメージング

1. 次の組成で幼虫解剖バッファーを調製します:NaCl 110 mM、KCl 5.4 mM、CaCl₂ 0.3 mM、MgCl₂ 0.8 mM、D-グルコース10 mM、およびHEPES 10 mM。使用しないときは4°Cで保管してください。
2. IshimotoとSanoが説明したように脳の解剖を解剖します¹⁰。簡単に言えば、ブラシまたは細いワイヤーを使用して、1匹の幼虫を、底にシリコーンエラストマーを重ねた3.5 cmのペトリ皿に移します。
3. 解剖顕微鏡下で、幼虫の腹側を上に向けて配置し、脳を見つけます。解剖はさみを使用して、幼虫の前端の約3分の1を下に切り込みます。口のフックにもう一度切り込みを入れます。体と口のフックを取り外しながら脳を保存します(Janelia Flylight Protocol²⁷から適応)。
4. 腹側索から運動ニューロンを含む神経のクラスターを特定します。鉗子を使用して、解剖された幼虫の残りの部分から脳をそっと引き離します。脳から余分な組織を切り取ります。
   注意: 脳は壊れやすいため、過度の力を軽く扱うと組織に損傷を与える可能性があります。
5. ステップ3.2〜3.3で説明したように、カルシウムイメージング用の組織接着剤で顕微鏡カバーガラスを準備します。
6. P10マイクロピペットを使用して、ペトリ皿からの5 μLの解剖溶液で解剖された脳を注意深く吸引します。脳を接着剤にゆっくりと排出します。接着剤が乾く前に、脳を背側を上にした位置に向けます(2つの脳葉を下に向けて、背側腹側索を上に向けて)。
7. P200マイクロピペットを使用して、100 μLのカルシウムイメージングバッファーをカバーガラス上の固定化された幼虫の脳に移します。
8. 脳の入ったカバーガラスを倒立顕微鏡に置き、スピニングディスク共焦点スキャナーモジュールとカルシウムイメージング用のCCDカメラに接続します(図1B)。
   注: ex vivo 製剤の場合は、接着剤がまだ濡れている間に脳の向きを正しく配置してください。最適な画質を得るには、ROIが顕微鏡の対物レンズに最も近いように脳を配置し、ROIの近くに余分な接着剤を塗布しないようにします。

5. イメージングプロトコル

1. 共焦点顕微鏡を使用してカルシウムイメージング用のソフトウェアを開きます。 GFPレーザー (励起488 nm、強度70%、発光525 nm/50 m、OD8)と RFPレーザー (励起561 nm、強度50%、発光610 nm/75 m、OD8)の間でフィルターを切り替えた10x/1.4 NA対物レンズを使用して画像をキャプチャします。 露出 を 100ミリ秒 から 1,000ミリ秒の間で設定し、 ゲイン を 対応する露出値の50%に設定し、画像キャプチャ中の ビニング係数 を 2 に設定します。
2. 顕微鏡を10倍の倍率に調整し、明視野照明の下で脳の位置を特定します。
3. RFPレーザー(励起を561 nmに設定)でtdTomatoシグナルを検索して、目的のニューロンを特定します。
   メモ:彩度を選択し、ガンマを減らして、正しい露出値を設定します。
4. 関心領域(ROI)が特定されたら、GFPレーザー(励起を488 nmに設定)に切り替えて、GCaMP6f信号をキャプチャします。両方のチャネルのスタック画像をキャプチャする前に、tdTomato信号とGCaMP信号の両方が共局在していることを確認してください。
   注:tdTomatoおよびGCaMP6fスタック記録の画像設定を調整して、蛍光を最大化します。
5. tdTomato信号とGCaMP6f信号の2つの別々の時系列記録を、0.5フレーム/秒のレート(合計2分)で同時にキャプチャします。
   注:解剖された幼虫の脳は、これらの緩衝条件下で約10分間生存可能なままです。この時間を過ぎると、信号は劣化します。
6. サンプルをイメージングする準備ができたら、tdTomato信号とGCaMP6f信号の2つの別々の時系列記録を0.5フレーム/秒の速度(合計2分間)で同時にキャプチャします。
   注:解剖された幼虫の脳は、これらの緩衝条件下で約10分間生存可能なままです。この時間を過ぎると、信号は劣化します。
   注:定量分析を行う際には、線形強度スケーリングを維持しながら、必要に応じてレーザー出力を上げ、検出器の露光ゲインを調整することをお勧めします。

6. データの処理と分析

1. tdTomatoおよびGCaMP6f信号スタックを開き、ImageJ(NIH)²⁸にインポートします。
2. 正しい関心領域(ROI)を特定するには、tdTomato信号とGCaMP6f信号をマージして共局在を確認します。検証後、tdTomatoチャネルとGCaMP6fチャネルを分割します。
3. トップメニューで、 プラグイン |新規をクリックし、[ マクロ ] をクリックして新しいマクロを開始します。次に、カスタム ROI ベースのマクロを ImageJ にインポートします。GCaMP6fスタックを選択し、カルシウム分析のために実行をクリックします。
4. カスタムImageJマクロ(https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging)を使用して蛍光シグナルを処理します。マクロは最初に最大強度投影を生成し、StackRegプラグイン(Rigid Registration モード)²⁹を使用してモーション補正を実行し、ブリーチ補正を適用します。
5. 「アクションが必要」ポップアップが表示され、手動でROIを選択するよう要求され、ユーザーは手動で広範なROIを描画できます。[ OK ] をクリックして解析を続行します。モーション補正を実行するには、フレーム間で局所的な空間とROIの形状を維持しながら、正確なモーション補正のために、長方形のボックスがすべてのフレームのROI全体をカバーしていることを確認します。
   注:録音はStackRegを使用してImageJに登録されました。面内運動が大きい場合(累積XY変位>1μM)、または軸方向のZドリフトが焦点の喪失につながる場合、レジストレーションの信頼性が低下するか、サンプルがイメージングウィンドウから完全に失われました。したがって、極端なドリフトまたはカルシウムシグナルの低下を示すサンプル(>30%)は、ニューロン活動の正確な測定を保証するために、自動的にタグ付けされ、下流の分析から除外されました。これらの閾値は、カルシウムイメージング研究^{30、31、32、33}で一般的に適用される品質管理慣行と一致しています。また、除外により、信頼できる刺激にリンクされたカルシウム過渡現象を伴う安定した記録のみが分析に使用されることが保証されました。
6. 分析では、ピクセルの自己相関によって導かれて、手動で定義された循環ROIから蛍光トレースを抽出します。これらのROIは、キーストーンニューロンフィールド全体を網羅します。
   1. ImageJ(v1.54p)のカスタムマクロを使用して、2つの蛍光色素(GCaMP6f/GFPとtdTomato/RFP)の生の蛍光強度データを抽出します(https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging、 材料表を参照)。
   2. ROI が 20 x 20 ピクセルで、視野全体に 10 ピクセルのステップ サイズを持つスライディング ウィンドウを適用します。ROIごとに、マクロは、(1)すべてのフレームの強度、(2)ベースライン変動の差(つまり、最初の10フレームの最大強度値と最小強度値の差)、および(3)フレーム間の最大強度変化(ΔF)を計算します。強度変動が 10 単位未満を示す ROI は排除され、最も鋭い ΔF 値のみがさらなる分析のために選択されます。
   3. 次の方法を使用して蛍光トレースを正規化します。
      1. Fmax と Fmin の正規化: 次の式を使用して正規化された Δ を計算します。
         
         ここで、Fは各時点での生の蛍光、Fminは最小蛍光(ベースライン)、Fmaxは記録中の最大蛍光です。
      2. ΔF/F ₀ 正規化: さらに、次の式を使用して、ΔF/F_{o 正規} 化を実行します。ここで、F_o (ベースライン) は各記録の最初の 10 フレームによって決定されます。
         
         ここで、F_t は時間tでの蛍光であり、F₀ は最初の10フレームから計算されたベースライン値です。
7. GCaMP6f シグナルを抽出した後、左クリックして [すべて選択]、[切り取り]、[貼り付け] の順にクリックして、すべての値を新しい Excel スプレッドシートに転送します。上部のメニューバーで、[データ] |テキストから列へ。「テキストから列へ」ウィザードのポップアップが表示されます。手順 1 で、[区切り] を選択し、[次へ] をクリックします。ステップ 2 の区切り文字で、[タブとカンマ] を選択し、[次へ] をクリックします。手順 3 で、[完了] を選択します。
   オプション: 正規化されたカルシウムシグナルをプロットするには、 Fnorm_FminFmaxを強調表示し、 散布図を選択します。
8. (1)生の蛍光値F、(2)ΔF /_{F o}、および(3)Fnorm(正規化された蛍光強度)を含む生成された.csvファイルを探します。最終的なデータセットを、(1)時間(フレーム)、(2)サンプル条件(飢餓または摂食)、(3)反復ID(個々のサンプル)、(4)正規化された強度(0から1までスケーリングされたFnorm値)の4つの列に整理します。
9. 最後に、カスタム R スクリプトを使用して R でデータ分析と視覚化を実行します (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging、 材料表を参照)。
   1. カスタム R スクリプトを新しい R プロジェクトにインポートします。分析を実行する前に、 ggplot2、 dplyr、 readr などの必要な R パッケージがインストールされ、更新されていることを確認してください。
   2. カスタム R スクリプトの 1 行目から始めて、[連続 して実行] をクリックしてカルシウム分析を実行します。また、出力に、時系列記録の最初の 30 フレーム、60 フレーム、およびすべてのフレームの正規化されたカルシウム強度を示すヒートマップと、正規化された強度の中央値を示す箱ひげ図が含まれていることを確認してください。
   3. マンホイットニー U 検定を使用して、正規化されたカルシウム強度の重要性を評価します。

7. 廃棄物の処理と除染

1. 実験後、流水で工具や表面から粗い破片を取り除き、70%エタノールまたは10%漂白剤で消毒し、続いて滅菌水で消毒します。消毒された表面で作業し、手袋を外した後は手を洗ってください。研究室では飲食しないでください。
2. 廃棄する前に、幼虫組織と汚染された使い捨て製品をバイオハザードバッグとオートクレーブに入れます。
3. 完全に硬化した接着剤廃棄物は一般ゴミに捨ててください。未硬化の接着剤や汚染された使い捨て製品は、密封されたラベルの付いた有害化学廃棄物容器に収集する必要があります。
4. すべての鋭利物(刃物、針、割れたガラス)を耐パンク性のある鋭利物容器に入れます。
5. 可燃性溶剤(エタノール、アセトン)は、ラベルの付いた可燃性廃棄物容器に回収します。

幼虫カルシウムイメージングアプローチを実証するために、ショウジョウバエ幼虫の生体内および生外調製物の両方に適用することに成功しました(図2および図3、ビデオ1、ビデオ2、ビデオ3、および ビデオ4)。幼虫の脳18,19のキーストーン-LNの一対でGCaMP6fとTd-トマトを発現するショウジョウバエ幼虫のカルシウム動態を測定しました。比較測定値を紹介するために、飢餓した幼虫と飢餓していない幼虫のカルシウム動態を比較しました。

生体内製剤では、無傷の幼虫全体でKeystone-LNからのカルシウム動態を測定しました(図2Cおよび図3A、ビデオ1およびビデオ2)。我々のex-vivo調製では、飢餓していない幼虫または飢餓した幼虫から解剖され、イメージングバッファーに保存された幼虫脳のKeystone-LNからのカルシウム動態を測定した(図2Cおよび図3B、ビデオ3およびビデオ4)。どちらの調製物でも、飢餓していないサンプルと比較して、飢餓サンプルでより高いKeystone-LN活性が観察されました。この高いキーストーン-LN活性は、60秒にわたる応答の時間的表現を示すヒートマップ(図3、左上および左下のパネル)および平均信号強度値を示す箱ひげ図(図3、右上および右下のパネル、マンホイットニーのU検定、**p < 0.001)で明確に観察されました).分析された集合データは、各条件下で実施された少なくとも 5 つの試験から得られました。これらの結果は、飢餓した動物でより高い嗅覚ニューロン活動を示す最近の研究と一致しています34,35。

図1: in-vivo および ex-vivo カルシウムイメージングセットアップの概略図。 幼虫サンプル全体(A)または幼虫脳サンプル(B)を、顕微鏡カバーガラス上のワセリン(茶色)のウェル内に広げた組織接着剤(青色一色)の薄い層に固定しました。サンプルをカルシウムイメージングバッファー(水色)に浸し、倒立スピニングディスク共焦点顕微鏡でイメージングするために配置しました。サンプルの時系列カルシウム蛍光画像をキャプチャしました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:GCaMP6f蛍光イメージング。(A)488 nmチャネル(GCaMP6f、緑)と525 nmチャネル(tdTomato、赤)の蛍光を示す分割画像。結合された画像が右側のパネルに表示されます。(B)Keystone-LNのGCaMP6f(緑)とtdTomato(赤)の経時的な生の蛍光トレースの例。GCaMP6f蛍光の変動はカルシウム活性を示し、安定したtdTomatoシグナルはKeystone-LNを同定するためのコントロールとして使用されます。(C)in-vivo(トップパネル)およびex-vivo(下パネル)調製のための代表的なGCaMP6fシグナル画像。左側に飢餓していないサンプルが表示され、右側に飢餓サンプルが表示されます。スケールバー = 20 μm (A)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:GCaMP6f蛍光測定。(A) 左上のパネルは、 in-vivo 調製物(幼虫全体)における飢餓していない幼虫(n = 5)および飢餓した幼虫(n = 5)からのKeystone-LNからのカルシウムシグナルの平均時間的ダイナミクスを示すヒートマップを示しています。右上のパネルの箱ひげ図は、 in vivo 調製(マンホイット ニーU 検定、**p < 0.001)で、飢餓していない(灰色)サンプルと飢餓した(白色)サンプルの間で正規化されたCaシグナル強度を比較しています。 (B) 左下のパネルは、 ex-vivo 調製(解剖された脳)における飢餓していない(n = 5)および飢餓した幼虫(n = 5)からのKeystone-LNからのカルシウムシグナルの平均時間的ダイナミクスを示すヒートマップを示しています。右下のパネルの箱ひげ図は、 ex vivo 調製(マンホイット ニーU 検定、**p < 0.001)で、飢餓していない(灰色)サンプルと飢餓した(白色)サンプルの間で正規化されたCaシグナル強度を比較しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ビデオ1:生体内の非飢餓状態に対するキーストーン局所ニューロンにおけるカルシウム応答のGCaMP6f蛍光記録。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ビデオ2:生体内の飢餓状態に対するキーストーン局所ニューロンにおけるカルシウム応答のGCaMP6f蛍光記録。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ビデオ3:ex-vivoの非飢餓状態に対するKeystone局所ニューロンにおけるカルシウム応答のGCaMP6f蛍光記録。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ビデオ4:ex-vivoの飢餓状態に対するKeystone局所ニューロンにおけるカルシウム応答のGCaMP6f蛍光記録。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者には開示すべき利益相反はありません。