薬剤耐性細胞株は、治療耐性メカニズムの理解と、新しい化合物、再利用薬、および併用療法の非臨床評価を可能にします。この論文では、親細胞株を標的薬の濃度の段階的な増加にさらすことにより、耐性細胞株を作成するためのプロトコルを紹介します。
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この記事について
サマリー
要約
薬剤耐性細胞株の開発は、薬剤耐性のメカニズムを理解し、がん治療における治療失敗を克服するための戦略を特定するために不可欠です。耐性モデルにより、新規化合物、再利用薬、併用療法の前臨床評価が可能になります。耐性細胞を生成するために、親のがん細胞株は、数週間にわたって標的薬剤の濃度を段階的に増加させるに繰り返し曝露されます。各段階で生き残り増殖する細胞が選択され、増殖し、より高い薬物用量にさらされます。耐性の発生は、細胞生存率アッセイと非線形回帰分析を使用して、親細胞と耐性細胞の間の半最大阻害濃度 (IC50) 値を定量化および比較することによって確認されます。IC50 値の大幅な増加は、薬剤圧への適応が成功し、耐性が発達したことを示しています。これらの薬剤耐性細胞株は、マイクロアレイやシングルセルシーケンシングなどの包括的な分析だけでなく、さまざまな in vitro または in vivo 実験にも利用できます。これらのモデルは、薬剤耐性を克服するための潜在的な治療戦略を調査するための貴重なツールを提供します。
概要
化学療法は、手術や放射線療法が不可能な局所がん、または転移性がんに対して最も頻繁に使用される治療選択肢です。分子標的薬や化学療法は、多くの悪性腫瘍の第一選択治療として使用されており、その有効性は広く認められています。一部のがんは、治療開始から特定の薬剤に耐性を示し、治療が効果を示さない。しかし、より一般的なケースでは、薬剤耐性の発現により当初は効果があった治療が効果がなくなり、がんの進行につながります。
薬剤耐性は、薬物を回避したり、細胞増殖を助けたりする遺伝子産物の発現を誘導するがん細胞の遺伝子変異またはエピジェネティックな反応の両方によって引き起こされます1,2。さらに、多くの場合、この耐性は多剤耐性に発展し、がん細胞は複数の薬剤に耐性を持つようになります3,4。したがって、薬剤耐性のメカニズムを明らかにし、それを克服するための戦略を開発することは、がん治療の進歩にとって非常に重要です。
薬剤耐性細胞株は、治療耐性のメカニズムを研究するために頻繁に使用されるモデルであり、in vitroおよびin vivo実験の両方で重要な役割を果たします5。これらのモデルは、薬物作用経路をより深く理解し、治療効果に影響を与えるバイオマーカーを特定し、薬剤耐性の形成を阻害する治療戦略を見つけるために不可欠なツールです。薬剤耐性細胞株を作成する基本的なプロセスは、細胞株を標的薬3,6のレベルの増加にさらすことによって耐性を誘導することです。
使用される濃度と薬物曝露の持続時間は、このプロセスの重要な要素です。各濃度レベルで、生き残った細胞のサブセットが増幅され、次の濃度の薬物に繰り返し曝露されます。最終的に、親細胞株と比較して薬物の半最大阻害濃度(IC50)が増加した薬剤耐性細胞株が誘導されます。本報告では、ヒト前立腺がん細胞株DU145からパクリタキセル耐性細胞株(DU145-TxR)を、断続的な薬物曝露による段階的な方法を用いて作製する手順について詳述する。
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プロトコル
1. 細胞培養および細胞生存率アッセイ
注:パクリタキセルは抗がん剤であり、細胞毒性があります。取り扱いの際は、ガウン、ゴーグル、手袋を着用し、体内への吸入を防ぐために安全キャビネット内で作業してください。DMSOは細胞毒性は高くありませんが、皮膚や粘膜に接触すると溶解薬剤の透過性が高まるため、ガウン、ゴーグル、手袋を着用して取り扱いましょう。
- 完全培地(RPMI-1640 + 1%ペニシリン-ストレプトマイシン[ペン-ストレップ] + 10%ウシ胎児血清[FBS])を使用して、10 cmの細胞培養皿でDU-145細胞を5%CO2 の37°Cインキュベーターで80%コンフルエントまで培養します。
- 培地を吸引し、DPBSで洗浄し、0.05%トリプシンを加え、インキュベーターに5分間放置します。
- タップして細胞がプレートから剥がれて浮遊していることを顕微鏡で確認した後、1 mLの完全培地を加えてトリプシンの作用を停止します。
- 細胞の数をカウントし、96ウェルプレートの各ウェルの完全培地でウェルあたり1.0×104/99 μLの密度でシードします。細胞がプレートの底に付着するように2時間インキュベートします。細胞は、各試験群に対して3回または4回にプレーティングする必要があります。
- 各ウェルに添加するパクリタキセルとDMSOを調整します。各ウェルに添加されるDMSOの量が同じであること、およびDMSOの最終濃度が1%以下であることを確認してください。
- これを実行し、プロトコルに従って、DMSO中の10 mMパクリタキセルから始めて、チューブ内のこの薬物の12.8 μLに87.2 μLのDMSOを加えて、1,280 μMで100 μLのパクリタキセルを取得します。
- この溶液50 μLを別のチューブに移し、50 μLのDMSO(640 μM)で半分の強度に希釈します。
- この手順を繰り返して、連続希釈を実行し、0(DMSOのみ)、0.1、0.5、1、2、4、10、20、40、80、160、320、620、および1,280μMの濃度でパクリタキセルの溶液を調製します。
注:DMSOで希釈したパクリタキセルは、その後の実験で再利用するために凍結保存する必要があります(凍結融解サイクルを最小限に抑えるために、アリコートで保存してください)。
- 以前に調製したパクリタキセル溶液1 μLを別のチューブで9 μLの完全培地で希釈し、細胞を播種してから2時間後にこれを各ウェルに1 μL加えます。各ウェルのパクリタキセル濃度は、0、0.1、0.5、1、2、4、10、20、40、80、160、320、620、および 1,280 nM であり、各ウェルには 100 μL の培地が含まれています。
注:細胞生存率アッセイで使用される薬物の濃度を設定するときは、以前の論文で発表されたIC50 値を確認し、濃度が3の範囲内にあることを確認してください。各ウェルのDMSO濃度は全体的に0.1%でした(1%未満が望ましい)。 - 48時間インキュベートします。各ウェル(培地100 μL)に10 μLの細胞増殖試薬WST-1を加え、さらに0.5〜4.0時間インキュベートします。
注:最適なインキュベーション時間は、細胞株と細胞密度によって異なります。本研究では、細胞を約1.5時間培養しました。インキュベーション時間が短すぎたり長すぎたりすると、次のステップで各ウェルの吸光度が低すぎたり高すぎたりします。その結果、細胞生存率の違いを確認することはできません。したがって、最初のテストでは、適切なインキュベーション時間を確認するために、いくつかのインキュベーション時間をテストする必要があります。 - マイクロプレートリーダーを使用してWST-1吸光度を測定します。
注:ターゲット吸光度は450 nm(420〜480 nmを推奨)、バックグラウンド吸光度は650 nm(600 nm以上を推奨)です。
2. 細胞生存率と半最大阻害濃度(IC50)値の計算
- 吸光度から細胞生存率を計算します。吸光度は(A450nm-A650nm)です。
細胞生存率(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)] × 100
As:サンプル吸光度(薬剤処理細胞)
Ab:ブランク吸光度(培地のみ、細胞なし)
Ac:制御吸光度(薬物未処理細胞) - 前のセクションで計算した細胞生存率をスプレッドシートソフトウェアで要約します。
- 非線形回帰分析により、親細胞のIC50 を計算して記録します。
注: 多くの場合、4 パラメータ ロジスティック モデル (4PL) が適切な計算方法です。オンラインIC50 計算ツールが利用可能7.ただし、化合物の有効性が濃度範囲外であり、データがシグモイド曲線の下部および上部漸近線を完全に表すことができない場合は、4PL モデルを使用しないでください。- このような増加を回避するには、できるだけ多くの濃度点で細胞生存率を測定します。シグモイド曲線を取得できない場合は、最小値と最大値が固定された2パラメータまたは3パラメータモード7を使用します。
- 計算ソフトウェアや統計ソフトウェア (Web で入手できるものを含む) を使用しない場合は、次の式を使用します。
IC50=((50-C)(B-A) + A(D-C))/(D-C)
A: 細胞生存率が ≤50% で測定された薬物濃度の中で最も低い値
B:細胞生存率>50%で測定した薬物濃度の中で最も高い値
C:Bでの細胞生存率
D:Aでの細胞生存率
注:この式は、IC50 の値を挟む2つの点の間のグラフが直線であることを前提としています。
3.薬物曝露
メモ:このセクションで説明する手順の概要を 図1に示します。
- 細胞培養プレートに親細胞を播種します(100 mmディッシュの場合は2.0×106 細胞/ディッシュ)。
- ~10〜20%の細胞生存率阻害濃度(この場合はIC10〜20、~0.5 nM)のパクリタキセルを培地に添加し、インキュベーターで2日間培養します。
- パクリタキセルフリー培地と交換し、数日間インキュベートします。
- 細胞が成長し、80%コンフルエントになったら、それらを新しい細胞培養プレートに継代します。残りの細胞を凍結保存します。
- パクリタキセルを、開始濃度の~1.5〜2.0倍(0.75〜1 nM)の濃度で通過した細胞に添加します。インキュベーターで2日間インキュベートします。
- パクリタキセルフリー培地と交換し、数日間インキュベートします。
- 細胞が同様に増殖する場合は、ステップ3.4〜3.6を繰り返し、パクリタキセル曝露の濃度を段階的に増やします。
注:薬物濃度の増加(1.5〜2.0倍)は実験者が自由に設定でき、実験はその濃度で繰り返す必要があります。薬剤濃度を上げるたびに細胞を凍結して保存することをお勧めします。パクリタキセル濃度がさらに上昇し続けると、細胞増殖が回復せず、細胞が死滅する可能性があります。このような場合は、死前の濃度で増殖した細胞を解凍し、パクリタキセルの増加を1.1〜1.5倍(1.2倍を推奨)に減らし、培養を繰り返します。 - 薬物に対する細胞株の耐性を徐々に高め、セクション2で説明されているように、WST-1およびソフトウェアを使用してIC50 を計算および記録します。
注:IC50 の少なくとも3〜5倍の増加が観察された場合、株が薬剤耐性細胞株であると判断できます。
4. 薬剤耐性の維持
- 薬剤耐性細胞株の耐性表現型を維持するために、IC10〜20の薬物濃度でインキュベートします。
注:薬剤耐性が変化する可能性があるため、細胞生存アッセイのIC50 を定期的に測定することをお勧めします。
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結果
この方法を使用して、以前に9か月かけてパクリタキセル耐性DU145細胞(DU145-TxR)の確立に成功しました。細胞生存率アッセイの結果、DU145親細胞株のパクリタキセルのIC50 値は1.1 nMであるのに対し、DU145-TxRのIC 50値は親細胞株のIC50 値(IC50:164.6 nM)の149.6倍高かったことが示されました(表1 および 図2)。この結果は、DU145-TxRが非常に高い薬剤耐性を獲得していることを示しています。
細胞形態は、細胞播種およびパクリタキセル添加後 48 時間に、細胞生存率アッセイの直前にデジタル倒立顕微鏡を使用して観察されました。その結果、パクリタキセル濃度が1 nMから10 nMに増加すると、親細胞株DU145は明確な細胞萎縮と細胞死を示唆する形態学的変化を示しました。しかし、DU145-TxR細胞株では明らかな形態学的変化は観察されませんでした(
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ディスカッション
薬剤耐性がん細胞株の開発は、薬剤毒性や耐性メカニズムを調べるための確立された方法ですが、研究者が直面する最初の課題は、耐性を発現するための適切なモデルを選択することです。in vitroで薬剤耐性細胞株を作るのに、細胞株を標的薬剤にばく露させる方法が一般的ですが、ばく露濃度の設定方法(段階的または一括)や、無薬期間(パルスまたは連続)を設定するかどうかを検討する必要があります。
パルス法は、薬物を使用しない期間があり、薬物曝露期間が短期間と回復期間があるため、がん患者が数サイクルの化学療法を受けるのと似ています。したがって、この方法は臨床モデルに近く、広く使用されています。逆に、継続的な薬物曝露の方法は、毎日投与される一部の化学療法や分子標的療法など、血中の薬物レベルが安定しているモデルを模倣しています。
細胞株が曝露される最大薬物濃度は、患者が薬物で治療されたときの薬物の血中濃度によって決定されます。その薬物濃度は、患者の体内のがん細胞の曝露であると考えられ...
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開示事項
著者らは、潜在的な利益相反はないことを宣言します。
謝辞
この研究は、国立衛生研究所の助成金 P01 CA093900 によって部分的に支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.05% トリプシン-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 10 mL 使い捨て血清ピペット | Fisher scientific | 13-678-11E | |
| 100 mm ディッシュ | Corning | 353003 | |
| 15 mL コニカルチューブ | Corning | 352097 | |
| 2.0 mL 極低温バイアル | Corning | 431386 | |
| 96ウェル細胞培養プレート | Corning | 353072 | |
| 細胞計数チャンバー | Invitrogen | C10228 | |
| 細胞増殖試薬 WST-1 | シグマ | 5015944001 | |
| 心分離機 5702 R | eppendorf | ||
| countless II | Invitrogen | セルカウンター | |
| ジメチルスルホキシド | シグマ | D2650 | |
| DPBS | Gibco | D4W2J | |
| DU145 | ATCC | HTB-81 | 前立腺がん細胞株 |
| EVOS FLc | サーモフィッシャーサイエンティフィックデジタル | 倒立顕微鏡 | |
| FBS | Gibco | A5670701 | |
| パクリタキセル | セレック | S1150 | |
| ペニシリン–ストレプトマイシン | Invitrogen | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Synergy H1 | BioTek | マイクロプレートリーダー | |
| トリパンブルー溶液 0.4% | Invitrogen | 15250061 |
参考文献
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