変形性膝関節症に対する視覚化された感作ツボ処置: 行動、熱、および分子の評価

サマリー

この研究では、鍼治療と赤外線サーモグラフィーの写真撮影に適したラットの固定方法について詳しく説明します。さらに、感作されたツボでの電気鍼治療が局所的な炎症性疼痛を抑制することを示しています。

要約

変形性膝関節症 (KOA) は、世界中で筋骨格系の痛みと機能障害の主な原因となっていますが、持続的な痛みの軽減を達成するための現在の薬理学的および外科的介入の有効性が限られているため、管理が依然として困難です。鍼治療は KOA 関連の痛みを軽減する臨床的期待が実証されていますが、その根底にあるメカニズムにはさらなる解明が必要です。感作されたツボに鍼治療を適用すると、治療の有効性が著しく高まります。このプロトコルは、モノヨード酢酸ナトリウム (MIA) の関節内注射による KOA のラット モデルを確立し、拘束方法、ツボの局在化、および鍼治療パラメーターを含む、感作されたツボを標的とする鍼治療プロトコルを体系的に記述します。治療効果は、痛みの行動評価、膝関節の赤外線サーモグラフィー分析、血清中の炎症性サイトカイン検出、軟骨組織の組織病理学的検査を通じて総合的に評価されました。結果は、感作されたツボでの鍼治療が、炎症誘発性メディエーターの放出を阻害し、侵害受容シグナル伝達を遮断し、血液微小循環を改善し、局所的な関節温度を調節し、関節変性を遅らせることにより、MIA誘発モデルラットの痛みの表現型を大幅に軽減することを示しています。

概要

変形性膝関節症 (KOA) は、一般的な変性関節疾患であり、軟骨びらん、軟骨下骨リモデリング、骨棘の発達、滑膜炎症などの慢性炎症と全関節の病状を特徴とします ^1,2。臨床的には、患者は通常、痛み、筋力低下、関節の不安定性、一過性の朝のこわばり、および進行性の機能制限を呈します。KOAは、約3億6,500万人の機能障害者に影響を及ぼし、疫学モデルでは、2050年半ばまでに2020年のベースラインから症例数が74.9%増加すると予測^{しています3。}特に、痛みは主な治療動機として機能しますが⁴、同時に機能障害を悪化させ、可動性の障害や日常活動能力の低下を通じて複数の生活の質の領域を大幅に損ないます。したがって、治療戦略は、痛みを軽減し、機能を回復し、疾患の進行を遅らせることを目的としています⁵。現在の第一選択の薬物療法には、鎮痛薬、非ステロイド性抗炎症薬、コンドロイチンと硫酸グルコサミン、痛みと炎症を軽減するための関節内コルチコステロイドが含まれます⁶。しかし、これらの薬剤の長期使用は、重大な医原性リスク、特に胃腸合併症や心血管有害事象⁷ によって制限されるため、より安全で持続可能な代替治療法の重要な必要性が強調されています。

鍼治療と電気鍼治療は変形性関節症の管理に広く利用されており、膝の痛みの軽減と関節機能の改善に有効であることが実証されており ^8,9、世界保健機関 (WHO) は関節炎を鍼治療の優先症状として認識しています。刺激ターゲットとエフェクターの両方として、ツボは鍼治療研究の中心であり続けており、その形態学的外観、空間的寸法、および機能的反応性は、疾患状態中に動的に変化し、「ツボ感作」と呼ばれる現象を起こします^10,11。重要なことに、この感作プロセスは、ツボの受容野面積と治療反応性を調節し、それによって治療効果を決定します。以前の前臨床研究^12,13 では、Yanglingquan (GB34、腓骨頭の前部および下部、後肢の外側近くのくぼみに位置する) および Zusanli (ST36、脚の前側に位置し、膝蓋靭帯の外側境界は前中点、足首関節の 3/16 まで押し下げられています) KOA 動物モデルで感作が実証されました。レーザースペックルイメージングでは、これらのツボでの局所血液灌流の上昇が明らかになりましたが、光音響イメージングでは逆説的に微小循環に有意な構造変化は示されておらず、KOA のツボ感作中の微小循環の変化は構造的ではなく主に機能的であることを示唆しています。根底にあるメカニズムの調査には、ラットモデルの使用が必要です。ただし、動物の手順の遵守が不十分であると、かなりの時間を費やすことになります。これらの制約に対処するために、下肢のツボへのアクセスを容易にし、電気鍼治療の効率を高めるように特別に設計されたラット固定装置が開発されました。

赤外線サーモグラフィーは、機能的イメージングモダリティとして、非接触赤外線センサーを利用して、事前に定義された関心領域からの熱放射を検出し、コンピューター処理されたデータにより定量分析用の疑似カラーサーモグラムを生成します^14,15。この技術は、皮膚、血管、および筋肉組織の血流変動に関連する温度変化を測定することにより、皮膚血行動態の変化の非侵襲的モニタリングを可能にし¹⁶、それによってツボでの機能的微小循環変化の視覚的評価を容易にします。この研究では、GB34およびST36ツボの疼痛感作を最初に電子痛覚計を使用して検証し、続いてサフラニンO高速グリーン染色、IL-1βおよびTNF-α分析、赤外線サーモグラフィーイメージング、および疼痛関連行動評価を組み合わせて適用して、酢酸ヨードナトリウム誘発性(MIA)変形性膝関節症ラットのGB34およびST36ツボでの電気鍼治療刺激の鎮痛効果を調査しました。

プロトコル

すべての実験プロトコルは、北京中医薬大学動物倫理委員会 (ID: bucm-2024091102-3197) によって承認され、厳格に監督されており、すべての手順は国立衛生研究所 (NIH) の実験動物のケアと使用に関するガイドに厳密に準拠しています。この研究では、30匹の雄のSprague-Dawleyラット(体重範囲:210〜250 g)を使用しました。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。

1. 実験動物・団体

1. 動物専用施設に動物を収容します。
2. 周囲温度を22°C±2°C、相対湿度を50%〜60%、12時間の明暗サイクルに維持します。研究全体を通して、食料と水への 自由 なアクセスを提供します。
3. 7日間の順応期間の後、ラットをランダムに5つの実験群(グループあたりn = 6)に分けます:正常対照(Con)群、偽手術(偽)群、モデル(MIA)群、非固定(NF)群、および電気鍼治療(EA)群。

2. モノヨード酢酸誘導KOAモデルの確立

1. ラットを誘導チャンバーに入れます。導入のために酸素中の 4% イソフルランを使用して麻酔し、フェイスマスク を介して 送達される 1.5%-2.0% イソフルラン未満に維持します (施設で承認されたプロトコルに従います)。
2. ラットを左側臥位に固定します。右膝関節とその周辺に優しい脱毛クリームを使用して毛を取り除きます。
3. 右膝関節をポビドンヨードで内側から外側に3回消毒し、続いて75%エタノールで同じ手順を繰り返します。
4. 右膝を90°屈曲に保ちます。下膝蓋骨境界と脛骨結節を特定します。22-G 針 (0.7 mm × 30 mm) を膝蓋靭帯の外側または内側の境界 を介して 関節腔に 30°-45° の皮膚アプローチ角で 3-5 mm 進めます。関節内配置を確認し、50 μL の MIA 溶液 (1 mg/50 μL) をゆっくりと注入します。偽のコントロールの場合は、同量の滅菌生理食塩水を注入します。
5. 5つの受動的な可動域操作を実行して、関節内の薬物の均一な分散を確保します。術後の回復のために動物をホームケージに戻します。

3. ネズミを固定する手順

1. ネズミを黒い拘束スリーブに固定します。 図1Aに示すように、右下象限に直径1.5cmの円形の開口部を作成し、そこを通して右後肢が外側に外側に見えます。
2. ペアのナイロンケーブルタイ(5mm×300mm)を6.8cm間隔でプラスチックメッシュフレームに固定します。 図1B、C、Eに示すように、上拘束を腋窩領域に配置し、下拘束を骨盤帯に固定します。
   注: NF グループは、手順 3.2 で説明されている手順を実行しません。

4.電気鍼治療

1. 連続した 3 日間の固定プロセスの後、4 日目に電気鍼治療介入を開始します。
2. GB34およびST36ツボ領域で無菌準備を行います。これらの遺伝子座の標準化された表面解剖学的マッピングについては、 図1D を参照してください。
3. 使い捨て滅菌鍼(直径:0.25 mm、長さ:13 mm)をツボに挿入します。電気刺激プロトコルに従って、GB34をアノードに接続し、ST36をカソードに接続します(図1G)。
4. 20分間の電気鍼治療の後、デバイスを無効にします。針のハンドルから電極を取り外し、鍼を慎重に取り外して治療手順を完了します。2 週間連続して毎日介入を実施します。
   注: NF グループを除いて、残りの 3 つのグループは治療を受けませんでしたが、EA グループと同じ方法で毎日 20 分間固定されました。

5. 機械的離脱閾値 (MWT) テスト

1. 24°C±°Cの室温の静かな環境で、ステンレス鋼のメッシュ底と有機プラスチックのケージ本体を備えた足のテストプラットフォームにラットを置きます。
2. 電動フォンフレイ電子疼痛検出器の直径0.mmのプローブを使用して、右後ろ足の中心領域または指定された経穴を垂直に刺激します。足の引き抜き回避反応が観察されるまで、刺激の強度を徐々に均一に増やします。この瞬間に表示された値を機械的な引き出ししきい値として記録します。
   注:各ラットは10分間隔で1回測定され、3回の連続した試験の平均が最終結果として指定されます。

6. 足引き抜きレイテンシー (PWL) テスト

1. 正式な評価の前に、熱プラットフォーム上で5分間ラットを順応させます。
2. 試験中は、プラットフォーム表面温度を 55.0 °C ± 0. °C に維持します。右後足が加熱された表面に接触したときにタイミングを開始し、最初の陽性反応(足を舐める、ジャンプする、または急速な撤退)が観察されたらタイミングを停止します。記録された期間をPWLとして定義します。
   注:ラットごとに5分間の試験間隔で3回測定します。平均値を代表PWLとして計算します。

7. 赤外線熱画像

注:サーモグラフィーの前日に後肢を脱毛して、体温測定に対する毛髪の影響を排除します。

1. 周囲温度2°C、相対湿度60%で、消音照明や拡散照明の下で実験条件を維持します。
2. 右後肢を円形の穴から伸ばした状態で、黒い拘束スリーブでラットを拘束します。手術台に10分間置きます。
   注:10分経ってもラットが落ち着かない場合は、次のステップに進む前に、静かになるまで待機時間を延長してください。
3. 放射率0.97、フレームレート9Hz、IR解像度160×120ピクセルで構成された5cmの距離でサーマルイメージャーを使用して、外側および腹側の窒息関節熱画像を取得します。
4. 取得した赤外線サーモグラフィーデータを専用の分析ソフトウェアを使用して処理し、コンピューターベースのスペクトル分析により熱パラメータを正確に定量化します。

8. 酵素結合免疫吸着アッセイ (ELISA)

1. ラットに20%ウレタン溶液(1.2 g / kg)の腹腔内注射により麻酔します。腹腔を開き、採血針を腹部大動脈に挿入します。抗凝固剤を使用せずに真空採血管に針の端を挿入します。
2. 血液サンプルを30分間凝固させます。1006で遠心分離します。x g を°Cで15分間。 BCAアッセイを使用して血清タンパク質レベルを定量します。
3. IL-1β および TNF-α 濃度は、メーカーのプロトコルに従って市販の ELISA キットを使用して測定します。

9.サフラニンの高速グリーン染色

注:腹部大動脈採血後、外科用ハサミを使用して右窒息関節を切除し、大腿骨近位部と脛骨遠位部の両方の1mmの骨関節セグメントを温存します。関節周囲軟部組織を慎重にデブリードします。

1. 抑止関節を4%パラホルムアルデヒド(PFA)に72時間浸漬します。PFAを完全に除去するために、穏やかに攪拌しながらリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で完全にすすぎます。
2. サンプルをエチレンジアミン四酢酸(EDTA)脱灰液に°Cで4週間浸漬します。EDTA溶液は2日ごとに交換してください。針で組織を軽く刺します。抵抗がないことは、脱灰の完了を示します。脱灰した検体をPBSで4〜6時間すすぎ、残留EDTAを除去します。
3. 自動脱水機を使用してサンプルを脱水します。パラフィンに埋め込み、硬いブロックに固化させます。ミクロトームを使用してパラフィン包埋ブロックを切片し、厚さ4μmのスライスを取得します。スライスをウォーターバスに移します。展開したら、セクションを取り出し、スライドガラスの上に置きます。温度制御されたチャンバーで12時間乾燥させます。
4. スライドをキシレン(I)に10分間、キシレン(II)にさらに10分間入れます。無水エタノール(I)、無水エタノール(II)、90%エタノール、75%エタノールにそれぞれ5分間順次浸します。超純水ですすいでください。
5. ファストグリーン溶液でスライドを2分間染色します。軟骨がガラス状で透明になり、顕微鏡で観察するとはっきりと見える隙間が見えるまで、水道水ですすいでください。1%酢酸溶液で10秒間分化し、残留する青色が完全に除去されるまで監視します。すぐに超純水ですすいでください。
6. 軟骨マトリックスが均一で濃いルビーレッドの色を示し、骨組織が淡いピンク色に見えるまで、サフラニンO溶液で15分間染色スライドします。
7. スライドを無水エタノール(I)、(II)、(III)、および(IV)にそれぞれ10秒間順次浸します。調製したばかりのキシレン(I)とキシレン(II)にそれぞれ10分間浸漬します。
8. スライドを取り外し、組織との接触を慎重に避けながら、スライド表面に中性樹脂を塗布します。カバーガラスの端をスライドの上に置き、気泡の形成を防ぐためにゆっくりと下げます。余分なキシレンと樹脂を拭き取ります。室温で一晩自然乾燥スライドします。乾燥切片を光学顕微鏡下に置いてイメージングします。

10. 統計分析

1. 統計分析には SPSS ソフトウェアを使用します。データを平均±標準偏差として表します。
2. 反復測定ANOVAを使用してMWTおよびPWLデータを分析します。一元配置分散分析を使用して、グループ間で他のデータセットを比較します。
3. 結果を平均±標準偏差(SD)で表します。統計的有意性を p < 0.05 と定義します。

結果

実験全体を通して動物は死亡しませんでした。NF群とEA群の両方で各ラットの手術手順期間と針剥離数の結果は、ナイロンケーブルタイによる制限後のEA群で、手術時間の短縮と針の剥離が少ないことを示しました(P < 0.001;図1H,I)。ツボの痛みの閾値の分析では、モデリング前のGB34、ST36、および非ツボ領域の間で機械的疼痛感受性に統計的に有意な差はなかったことが明らかになりました(P > 0.05)。MIA 注射の 14 日後、3 つの部位すべてで痛みの感受性が増加し、GB34 と ST36 は非ツボ領域と比較して有意に高い感度を示しました (P < 0.05 または P < 0.01;図1J)。機械的離脱閾値 (MWT) と足離脱潜時 (PWL) の評価の結果は、ベースライン閾値がグループ間で一貫していることを示しました。生理食塩水またはMIAの注射から2週間後、偽の群とCon群の間に...

ディスカッション

代謝阻害剤であるMIAは、細胞の好気性解糖を選択的に妨害し、それによって軟骨細胞のアポトーシスを誘導します17,18,19。関節内 MIA 投与は、軟骨細胞の枯渇とそれに続く関節軟骨変性を引き起こし、ヒトの OA 病理によく似た形態学的不規則性と組織病理学的変化を特徴とします²⁰。したがって、OA の痛みのメカニズムに関する研究に広く利用されています²¹。ヨード酢酸 (IAA) 注射も一般的に使用されます。ただし、水に溶けにくく、得られた溶液は通常酸性になります。この酸性度は、関節組織にさらなる刺激効果を発揮する可能性があります。現在、MIAとして知られるIAAのナトリウム塩形態が一般的に使用されています²²。その結果、この研究では、MIA 誘...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0-10ul 容量調節可能なピペッター	サービスバイオ	IC012395160823
0-200ul 容量調整可能なピペッター	サービスバイオ	IC021029160323
1.5mlエッペンドルフチューブ	サービスバイオ	EP-150-M型
10ulマイクロピペットチップ	サービスバイオ	TP-10
1mlシリンジ	上海Zhiyu医療機器有限公司	ZSQ-1
200ulマイクロピペットチップ	サービスバイオ	TP-200
22ゲージニードル 	クルス	112416c
2mlエッペンドルフチューブ	サービスバイオ	EP-150-M型
5ml赤血球チューブ	上海新楽バイオテクノロジー株式会社	CXG-5R型
アルコール度数75%	山東安傑高科消毒技術有限公司	75-500ミリリットル
接着スライド	シトテスト	188105
自動プレートウォッシャー	レイト	RT-3100C
採血針	江西瑞邦工業グループ株式会社	CXZ-07
骨組織サフラニンと固体グリーン染色液	上海Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd.	R32730
カバーガラス	Citotest Labware Manufacturing Co.、Ltd	10212432C
脱水	ダイアパス	ドナテッロ
電子天びん	メトラー・トレド	ME203E/02
電熱ブラスト乾燥炉	ラボタリー	ゲル-70
埋埋機	武漢俊傑電子有限公司	JB-P5
環境にやさしい脱ろう透明液体	サービスバイオ	G1128-1L
酵素標識検出器	ビオテック	時代
エタノール	SCRCの	100092683
エチレンジアミン四酢酸	マックリン	60-00-4
無脂肪コットンボール	曹県華廬衛生材料有限公司	TZMQ-500
高速冷凍遠心分離機	竜	D3024R型
高速ティッシュグラインダー	サービスバイオ	KZ-III-F
ホットプレート鎮痛計	キューベース	KW-CT-1
イメージングシステム	ニコン	ニコンDS-U3
赤外線サーマルイメージャー	Testo AG	テスト 865
ヨードフォア	山東安傑高科消毒技術有限公司	DF-500型
IRソフト	Testo AG
イソフルラン	RWDライフサイエンス	R510-22-10
ラテックス手袋	北京瑞晶ラテックス製品有限公司	RJJC-S
機械式足突き試験装置	キューベース	KW-RBの
MIAさん	シグマ	206-165-7
ニュートラルガム	SCRCの	10004160
通常のブタノール	SCRCの	100052190
生理食塩水	石門	スライス-500ml
パラフィン液	マックリン	8012-95-1
パラホルムアルデヒド固定剤(中性)	サービスバイオ	G1101
病理用スライサー	上海ライカインストゥルメンツ株式会社	RM2016
ラットIL-1ベータ ELISAキット GER0002-96T	サービスバイオ	AC30253754
ラットTNF-α ELISAキット GER0004-96t	サービスバイオ	AC40253711
SDラット	北京四貝飛バイオテクノロジー株式会社	SCXK (京) 2024-0001
小動物麻酔器	ユヤン	ABMの
サージカルマスク	勝者	WJKZ-1
ティッシュスプレッダー	浙江科華機器有限公司	KD-P
超純水研磨システム	エイケンウォーターエル	AK-RO-C2
正立光学顕微鏡	ニコン	ニコン エクリプス E100
ウレタン	マックリン	2621-79-6
ボルテックスミキサー	サービスバイオ	MV-100
キシレン	SCRCの	10023418