蛍光タンパク質を発現する細胞におけるテロメアFISHと免疫蛍光を実行するための柔軟な手順

サマリー

このプロトコルは、テロメアFISH(天然または変性)を免疫蛍光および/または蛍光タンパク質の可視化と組み合わせる方法を記述する。

要約

蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(TelFISH)を使用したテロメアの視覚化は、テロメア生物学実験において長い間不可欠なツールでした。TelFISHと免疫蛍光(IF)を組み合わせることも、たとえば、テロメアが53BP1と共局在するテロメア機能不全誘発病巣を特定する際に、確立された方法(IF-TelFISH)です。最近では、ネイティブ テロメア FISH (nTelFISH) は、一部の腫瘍細胞で使用されるテロメア維持メカニズムであるテロメアの代替延長をアッセイするための重要なツールとなっています。蛍光タンパク質の発現は、細胞生物学においても不可欠なツールであり、他の方法では検出できないタンパク質や構造の視覚化を可能にします。FISHはタンパク質を変性させるため、蛍光タンパク質(FP)を発現した細胞でアッセイを実行すると、FPシグナルが失われます。ここでは、FISH後もFPシグナルを保持する発現蛍光タンパク質を持つ細胞内でIFとテロメアFISHを統合する方法について説明します。変性およびネイティブテロメアFISHの代替案は、いくつかのIFおよびFPシナリオと組み合わせて提供されています。まとめると、このプロトコルは、正常細胞と腫瘍細胞の両方でテロメア生物学を調査するための柔軟なフレームワークを提供します。

概要

線状染色体を持つ生物は、2つの問題と戦わなければなりません。まず、末端複製の問題により、DNAが複製されるたびに染色体の末端がわずかに侵食されます。第二に、細胞は自然なDNA末端とDNA切断を区別できなければなりません。テロメアは、これらの問題の解決策として進化しました。リボ核タンパク質テロメラーゼの作用により、ヒトでは短いタンデムリピート-TTAGGGの添加によって染色体が長くなります。これらのリピートはシェルテリン複合体によって結合されており、細胞DNA損傷修復機構¹から染色体末端を隠します。テロメアが短いか機能不全に陥ると、細胞の老化と表現型が老化します²、一方、テロメアの危機からの脱出は腫瘍形成における主要なマイルストーンです³。これらの理由から、テロメア生物学は人間の健康と病気を理解する上で特に興味深いものです。

テロメア蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)は、間期細胞または中期スプレッドのテロメアを視覚化するための重要な方法で長い間行われてきました⁴。何十年にもわたって、テロメア FISH は 53BP1 免疫蛍光染色 (IF) と組み合わせて、機能不全のキャップのないテロメアのマーカーであるテロメア機能不全誘発病巣 (TIF) を特定してきました ^5,6。同様に、テロメアの維持にテロメアの代替延長 (ALT) を使用する腫瘍の特徴は、テロメアと核 PML 小体との結合により、ALT 関連 PML 小体または APB が形成されることです⁷。APBは、テロメアFISHとPML IF染色を組み合わせることによってアッセイできます。したがって、IF-FISHはテロメア生物学において確立されたツールです。

ここでは、IF-FISHの使用が2つの方法で拡張されました。まず、蛍光タンパク質(FP)を発現した細胞に対してIF-FISHを実施します。蛍光タグ付きタンパク質の発現は、細胞生物学においてユビキタスなツールとなっています。タグ付きタンパク質を発現させることは、良好な抗体が存在しないタンパク質を視覚化するための唯一の選択肢である可能性があります。たとえば、発現したGFPタグ付き核アクチン染色体(nAC-GFP)は、核アクチンダイナミクスを明らかに^{します8。}この試薬は、かつて物議を醸したトピックと考えられていた核 f-アクチンの探索に新たな機会をもたらしました。GFPやmCherryなどのFPは通常、固定後も蛍光活性を維持しますが、FISHハイブリダイゼーションバッファーのホルムアミドはそれらを暗くします⁹。この問題を回避するために、このプロトコルは、IF染色の二次ステップで蛍光色素タグ付き抗FP「ブースター」の革新を提供します。蛍光色素の明るさはホルムアミドの影響を受けないため、IF-FP-FISH。

第二に、IF は、ALT 状態の重要な診断であるネイティブ テロメア FISH (nTelFISH) と組み合わせて実行されます。FISHを変性させる際には、何らかの方法を使用してDNA鎖¹⁰を溶かし、通常は二本鎖であるDNAへのプローブアクセスを可能にする必要があります。対照的に、ネイティブFISHには変性ステップが含まれていないため、プローブはすでに一本鎖のDNAにのみアクセスできます。ネイティブテロメアFISHは、腫瘍細胞におけるALTのもう一つの特徴である一本鎖C鎖テロメアリピートを特異的に検出します^11,12。このアッセイをIF-FP染色と組み合わせることで、現在、標的腫瘍治療の有力な候補と考えられているALTのメカニズムを理解する上で、新たな疑問に取り組むことができます。

ここで説明するプロトコルは、「独自の冒険を選択する」スタイルで使用して、IF、FP、およびネイティブまたは変性テロメアFISHのいずれかの任意の組み合わせを染色できます。プロトコルは高度に構成可能であるため、タイミングは大幅に異なる場合があります。一般的には4日間でハンズオン時間が必要ですが、これらの日は連続しないかもしれません。典型的な変性FISHワークフローを完了するのに必要な時間の推定値を 図1に示します。ネイティブFISHは一晩で交配する必要はないため、ベンチでの長い一日が可能であれば、一晩のステップ(2日目と3日目を組み合わせて)を排除できる可能性があります。

一般的な共焦点顕微鏡は、大まかに言えば、青、緑、赤、遠赤の4つのカラーチャンネルをイメージングできます。潜在的な 4 色の組み合わせの 4 つの例が示されていますが、潜在的な順列は無限です。2つのIF抗体または2つの発現FPを同じように使用することが可能です。プロトコルは単純で堅牢です。それ自体で良好なIF結果を生み出す抗体はどれでも適しています。ここではFISHのテロメアプローブのみが含まれていますが、セントロメアプローブでFISHを変性させることも良好な結果が得られます。したがって、このプロトコルは、核生物学における重要な質問に答えるための幅広い柔軟性を提供します。

プロトコル

始める前に、顕微鏡、FP発現細胞株、利用可能なプローブと抗体を検討してください。青色蛍光色素は一般に明るくないため、青は通常、DAPIなどのDNA染色に使用されます。必要に応じて青色二次抗体を使用できます。細胞がGFPを発現する場合、赤色蛍光色素でタグ付けされたFISHプローブを、AF-647でタグ付けされたIFの二次抗体とともに使用できます。あるいは、mCherryを発現する細胞をイメージングするために、AF-488でタグ付けされたIF二次抗体およびAF-647で標識されたFISHプローブを選択してもよい。4つの可能なIF-FP-FISHの組み合わせの例を 図2に示し、実験計画の柔軟性を促進するためのガイドとして意図されています。ネイティブFISHと変性FISHのどちらかを選択することが重要であり、これらの方法は組み合わせることができません。細胞の接着を可能にするためのカバーガラスの酸洗浄の信頼できる方法がここに含まれています。これは使用前にいつでも完了でき、滅菌カバーガラスは無期限に保管できます。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。

1. カバーガラスの酸洗浄

注:ガラスカバーガラスは、培養細胞が付着できるように洗浄し、酸洗浄する必要があります。12ウェルプレートでの増殖には、18mmの丸いカバーガラスが理想的です。顕微鏡コア施設に相談して、#1 または #1.5 カバーガラスのどちらが好ましいかを判断してください。カバーガラスの洗浄時間は重要ではありませんが、酸洗浄にこだわらないでください。

1. カバーガラス鉗子 (図 3A) を使用して、カバーガラスをラックに配置し、表面が接触しないようにします。必要に応じて、追加のカバーガラスを斜めに配置して容量を増やします(図3B)。いくつかのラックを染色皿に快適に収めます(図3C)。
2. 染色皿に水と少量の洗剤を入れます。カバーガラス付きのラックを皿にゆっくりと下げます。
3. ロッカーまたは章動装置を使用して、カバーガラスを石鹸水で30分間かき混ぜます。
4. カバーガラスのラックを持ち上げて染色皿から取り出します。石鹸水は廃棄してください。
5. 染色皿をすすぎ、脱イオン水で満たします。カバーガラスのラックをきれいな水に戻し、ロッカーの上に置いて5分間穏やかに攪拌します。
6. きれいな脱イオン水をさらに2回交換してすすぎを繰り返し、合計3回すすぎます。
7. カバーガラスのラックを持ち上げて染色皿から取り出します。皿に1N HClを加えます。
   注意: HCl は苛性です。ドラフトで取り扱い、個人用保護具を使用してください。ラックに取り付けられたカバーガラスを酸溶液に慎重に下げます。1 N HCl がカバーガラスを完全に覆っていることを確認してください。染色皿に蓋をします。
8. カバーガラスと酸溶液を含む染色皿をバスソニケーターのタンクに入れます。55°Cで15分間超音波処理します。
9. カバーガラスを酸浴に一晩放置します。
10. 翌日、染色皿からカバーガラスラックを慎重に取り外します。1 N HCl は、施設の安全プロトコルに従って廃棄してください。
11. 染色皿をすすぎ、脱イオン水で満たします。カバーガラスのラックをきれいな水に戻し、ロッカーの上に置いて5分間穏やかに攪拌します。
12. きれいな脱イオン水をさらに2回交換してすすぎを繰り返し、合計3回すすぎます。
13. カバーガラスのラックを持ち上げて染色皿から取り出します。皿を空にし、70%エタノールを入れます。カバーガラスのラックを皿に戻し、5分間穏やかにかき混ぜます。
14. カバーガラスのラックを持ち上げて染色皿から取り出します。皿を空にし、100%エタノールを入れます。カバーガラスのラックを皿に戻し、5分間穏やかにかき混ぜます。
15. 100%エタノールとカバーガラスを入れた皿を組織培養フードに持っていきます。フードで、カバーガラスのラックを皿から取り外し、自然乾燥させます。
16. 皿を空にし、カバーガラスのラックを皿に戻します。無菌性を維持するために蓋をして保管してください。染色皿は気密ではありません。カバーガラスをエタノールに残すと、最終的には蒸発します。カバーガラスは引き続き使用できます。

2. カバーガラスにセルをめっきする

注:カバーガラスの取り扱いには練習が必要です。自信が持てるまで、6ウェルプレートから始める方が簡単です。6ウェルプレートを使用する場合は、12ウェルプレートの洗浄量を2倍にします。

1. GFPまたはmCherryでタグ付けされた目的のタンパク質を発現する健康で成長中の細胞を培養します(いくつかの赤または緑のFPが適しています、 材料表の注を参照)。示されている例では、テロメアの維持にALTを使用するU2OS骨肉腫細胞が使用されています。
   1. 一過性トランスフェクトされた細胞または安定したFP発現を持つ細胞株を使用します。実験で薬物処理またはトランスフェクションが必要な場合は、固定時の望ましいコンフルエンス(通常70%〜80%)、処理期間、および細胞増殖速度を考慮して、カバーガラスごとにプレートする適切な細胞数を計算します。
2. 無菌性を維持するために、組織培養フードにカバーガラスを準備します。12ウェルプレートの各ウェルに、1 mLの滅菌PBSを加えます。カバーガラス鉗子を使用して、酸で洗浄された清潔なカバーガラスを各ウェルに1つ置きます。手で数秒間穏やかにかき混ぜます。
3. PBSを吸引します。ウェルあたり1 mLの新鮮な滅菌PBSを加えます。プレートを脇に置きます。
4. (オプション)カバーガラスをフィブロネクチンでコーティングして、細胞の接着を改善します。多くの接着細胞株は、固定前に少なくとも18時間プレーティングすると、酸洗浄されたカバーガラスによく接着します。細胞がうまく接着しない場合や、めっき直後に固定が必要な場合は、カバーガラスをコーティングして接着を促進します。
   1. 滅菌PBS中のフィブロネクチンの5μg/mL溶液を調製します。
   2. カバーガラスからPBSを吸引します。約300 μLのフィブロネクチン溶液を各カバーガラスにそっと塗布し、表面張力によって保持された液滴を形成します。
   3. 37°Cで数時間、または4°Cで一晩インキュベートします。
   4. PBSで数回すすぎ、カバーガラスをPBSの最終交換に保持します。細胞を準備する間、プレートを脇に置きます。
   5. フィブロネクチンが適切でない場合は、代替品としてポリ-L-リジン、コラーゲン、またはゼラチンを検討してください。
5. 細胞をトリプシン化し、実験計画と固定時の所望の細胞密度に基づいて、12 mLの培地で適切な数を希釈します。
6. カバーガラスからPBSを吸引し、ウェルあたり1 mLの細胞懸濁液を加えます。
7. 細胞をインキュベーターに入れます。
8. 必要に応じて、実験計画に従って薬物、siRNA、またはその他の試薬で細胞を処理します。目的のコンフルントまで成長します。

3. IF-FP染色

注:プロトコル全体を通して、カバーガラスを乾燥させないでください。片手でピペットを吸い、もう一方の手で溶液を吸引して、カバーガラスが溶液からできるだけ短時間になるようにすることをお勧めします。カバーガラスに直接乗せるのではなく、ウェルの壁にそっと溶液をピペットでかけます。カバースリップを鉗子でしっかりと、しかし優しく扱います。カバーガラスは、力を入れすぎると壊れやすいです。最初に、破損した場合に備えてカバーガラスが重複することを計画してください。経験を積むと、カバーガラスが壊れることはまれになります。カバースリップは乾いた井戸から拾うことはできません。カバースリップは、ピックアップするためにバッファーで覆われている必要があります。

1. 培地を取り除き、選択した固定剤を使用して細胞を固定します。固定前に細胞をすすぐ必要はありません。12ウェルプレートではウェルあたり1 mL、6ウェルプレートではウェルあたり2 mLを使用します。
   1. オプション1:PBSに4%ホルムアルデヒドを使用します。
      注意: ホルムアルデヒドは有毒です。手袋をして取り扱い、適切に廃棄してください。16%メタノールフリーのホルムアルデヒドと10x PBSストックを使用して新鮮に調製します。室温で15分間固定します。
   2. オプション2:スクロース(CBS)を含む細胞骨格緩衝液に4%ホルムアルデヒドを使用します。
      注:このバッファーは、細胞骨格構造¹³を保存するために好ましい。CBSの最終濃度は、10 mM MES pH 6.1、138 mM KCl、3 mM MgCl₂、2 mM EGTA、および0.32 Mスクロースです。固定剤を調製するには、20 mM MES pH 6.1、276 mM KCl、6 mM MgCl₂、4 mM EGTA で 2x CBS ストックを作成します。ショ糖の別の1.28 Mストックを準備します。両方のストックを4°Cで保存します。 新鮮な作業固定剤の場合は、16%メタノールフリーのホルムアルデヒドを1容量、スクロースストックを1容量、および2倍CBSストックを2容量混合します。室温で15分間固定します。
   3. オプション3:-20°Cのメタノールで固定します。核酸抗体標的(ssDNA、G-四重鎖、RNA-DNAハイブリッドなど)に推奨されます。-20°Cで5分間固定します。
2. 固定剤を吸引し、制度の方針に従って廃棄します。
3. カバーガラスをPBSで数回すすいでください。
   1. 停止点:固定カバーガラスは、信号損失を最小限に抑えながら、4°CのPBSに数日間保存できます。長期保存するには、100%エタノールに脱水し(70%エタノールで2分、90%エタノールで2分、100%エタノールで保存)、プレートをラボフィルムで密封し、-20°Cで保存します。 カバースリップは、この方法で数週間から数か月間保管できます。染色する準備ができたら、カバーガラスを再水和し(90%エタノールで2分、70%エタノールで2分、PBSで15分)、次のステップに進みます。
4. カバーガラスをPBS中の0.5%Triton X-100で4°Cで5分間透過処理します。 プレートでこの手順を実行します。
5. カバーガラスをPBSで数回すすいでください。
6. 加湿チャンバーを準備します(図3D)。湿らせたペーパータオルをチャンバーの底に置きます。染色のためのサポートを作成するには、カバーガラスに対応するように12ウェルプレートの蓋の上部にラベルを付けます。
   1. ラベルが見えるように、蓋を実験用フィルムで覆います。チャンバーがぴったりとフィットする蓋で遮光性があることを確認してください。必要に応じてホイルで覆います(図3E)。
7. PBS中の100 μg/mL RNase Aを標識支持体に75 μL滴下します。各カバーガラスをそっと持ち上げ、実験組織の端を軽くたたいて、余分なバッファーを取り除きます。カバーガラスをRNase A液滴に反転させます(細胞側を下にして)。サポートを加湿チャンバーに入れ、蓋を閉めます。37°Cで45分間インキュベートします。
8. 新鮮なPBSを12ウェルプレートに加えます。カバーガラスをセル側を上にしてプレートに戻します。PBSで数回すすいでください。
9. 室温で30分以上ブロックします。フィルムで覆われたサポートからRNase溶液を拭き取ります。PBS中の20%ロバ血清を75 μL滴下してフィルムにピペットで留めます。カバーガラスをブロッキングバッファーに反転させます(セル側を下にして)。
10. 一次抗体を調製します。
    1. カバーガラスあたり 75 μL を使用します。ピペッティングエラーを考慮して、10%余分に準備します。
    2. 抗体を5%ロバ血清で希釈します。抗体希釈液を経験的に決定します。1:100の希釈が妥当な出発点です。
    3. ブロッキングしながら、一次抗体インキュベーション用の2番目の標識支持体を調製します。蓋をフィルムで覆い、希釈した抗体を75 μL滴を指定された場所に塗布します。
11. ブロッキングステップの最後に、カバーガラスを抗体液滴に移します(細胞側を下にして)。サポートを加湿チャンバーに入れ、蓋を閉め、室温で少なくとも2時間、または4°Cで一晩インキュベートします。
12. 新鮮なPBSを12ウェルプレートに加えます。カバーガラスをセル側を上にしてプレートに戻します。PBSで3回、室温で5分間、ロッキングしながら洗浄します。
13. 最終洗浄中に、二次抗体を調製します。
    1. カバーガラスあたり 75 μL を使用します。ピペッティングエラーを考慮して、10%余分に準備します。
    2. 蛍光二次抗体およびGFP/RFPブースター抗体には、1:400の希釈が推奨されます。ターゲットの経験に基づいて必要に応じて調整します。
    3. ロバ血清5%で二次抗体を希釈します。標識された支持体の適切なスポットに75 μLの滴を塗布します。
14. 洗浄後、カバーガラスを二次抗体液滴(細胞側を下にして)に移します。密閉された加湿チャンバー内で室温で少なくとも30分間インキュベートします。
15. 新鮮なPBSを12ウェルプレートに加えます。カバーガラスをセル側を上にしてプレートに戻します。PBSで3回、室温で5分間、ロッキングしながら洗浄します。

4. 再固定と脱水

1. 再固定のために室温でPBS中の4%ホルムアルデヒドを調製します。このステップには、最初の固定にメタノールが使用された場合でも、ホルムアルデヒドを使用してください。最後のPBS洗浄を取り除き、穏やかに揺らしながら15分間細胞を再固定します。
2. 固定剤を吸引し、制度の方針に従って廃棄します。
3. カバーガラスをPBSで数回すすいでください。
4. カバーガラスを脱水し、自然乾燥させてハイブリダイゼーションの準備をします。
   1. 70%エタノールで2分間インキュベートします。
   2. 90%エタノールで2分間インキュベートします。
   3. 100%エタノールで2分間インキュベートします。
   4. 100%エタノールの後、カバーガラスをセル側を上にしてラベル付けされたろ紙の上に置き、向きを維持します。FISHプローブを準備している間、完全に自然乾燥させます。

5. 魚 (オプション 1): 魚の変性

1. 2つのホイルサポートを準備します( 図3Fを参照)。
   1. アルミホイルを四分の一に折り、4層にします。くすんだ面が外側を向いていることを確認してください。
   2. 折りたたんだホイルをトリミングして、12ウェルプレートの蓋の内側に収まります。ラボワイプを使用して、ホイルを蓋の内側にこすりつけ、蓋の隆起がホイルにパターンをエンボス加工するようにします。これにより、後続のステップでカバーガラスが互いに滑り込むのを防ぐ隆起が作成されます。
   3. そのようなサポートを2つ用意します。それらは拭き取って、後の実験で再利用することができます。
2. 10 μMプローブをハイブリダイゼーションバッファー(70%脱イオンホルムアミド、10 mM Tris、pH 7.4、0.5%10×ロシュブロッキング溶液)で1:50に希釈します。カバーガラスごとにこの希釈プローブを75 μL使用し、ピペッティング損失を補うために10%余分に調製します。最終的なプローブ濃度は200 nMである必要があります。
3. ヒートブロックを90°Cに予熱し、サーモサイクラーを85°Cに予熱します。
4. カバーガラスの変性:風乾したカバーガラスをセル側を上にして、準備したホイルサポートの1つに置きます。ホイルをサーモサイクラーブロックにそっと置き、蓋を閉めます。変性するために5分間インキュベートします。
5. 同時に、希釈したプローブをヒートブロック内で90°Cで5分間加熱します。
6. 変性プローブを75 μL滴下して、2番目の調製したホイルサポートにピペットで留めます。ホイルの鈍い面が上を向いていることを確認して、適切な形の液滴ができるようにします。光沢のある面が上にあると、プローブが広がり、表面張力が失われます。
7. 変性したカバーガラスをプローブドロップの上に反転させ、セル側を下にして置きます。
8. プローブとカバーガラス付きのホイルサポートを85°Cに設定したサーモサイクラーブロックに移し、5分間インキュベートします。へらを使用して転送を補助します。カバーガラスにぶつかったりずれたりしないように注意して移動してください。
9. カバーガラス付きのホイルを移動させ、加湿チャンバーにプローブします。蓋をして室温で一晩インキュベートします。

6.魚(オプション2):在来魚

1. 10 μMプローブをハイブリダイゼーションバッファー(70%脱イオンホルムアミド、10 mM Tris、pH 7.4、0.5%10×ロシュブロッキング溶液)で1:200に希釈します。最終的なプローブ濃度は50 nMです。カバーガラスあたり75 μLを使用し、ピペッティングエラーを考慮して10%余分に準備します。
2. 希釈したプローブを75 μL滴下、フィルムで覆われたサポートの指定されたスポットに塗布します。
3. 変性したカバーガラスを75 μLのプローブ液滴に反転させ、細胞側を下にして置きます。
4. サポートを加湿チャンバーに入れ、蓋を閉めます。室温で少なくとも45分間インキュベートします。必要に応じて、インキュベーションを一晩に延長することができます。

7. 洗浄・取り付け

注:最適な封入媒体は、顕微鏡対物レンズの開口数によって異なります。推奨事項については、地元の顕微鏡コア施設に相談してください。適切な選択肢の 1 つは、屈折率 1.52 の NucBlue を使用した ProLong Glass です。ただし、手元の顕微鏡によっては、代替の封入剤の方が適切な場合があります。

1. カバーガラスを12ウェルプレートに戻して洗浄します。セル側が上になるように反転させます。
2. 70%ホルムアミド/ 10 mM Tris、pH 7.5で3×10分間洗浄します。
   注意: ホルムアミドは有毒です。制度の方針に従って処分してください。
3. TNT(0.05 M Tris / 0.15 M NaCl / 0.05%Tween-20、pH 7.5)で3×5分間洗浄します。
4. PBSで数回すすぎます。DNA染色が封入培地に含まれていない場合は、最終洗浄時にDAPIを添加することを検討してください。DAPIで染色するには、PBSに300 nM DAPIを加え、カバーガラスに塗布し、5分間インキュベートします。DAPI ソリューションは、機関のガイドラインに従って廃棄してください。
5. カバーガラスをスライドガラスに取り付け、敷封剤を一滴使用します。カバーガラスをドロップに反転させます:セル側を下にします。
6. イメージングする前に、封入剤を一晩硬化させます。

結果

このプロトコルの典型的な結果を 図4に示します。適切に実行されれば、細胞の形態は十分に維持され、蛍光シグナルは明るくなります。テロメアFISHを変性させると、各テロメアを表す各核に数十の涙点のパターンが明らかになるはずです( 図4、実施例1および2を参照)。テロメア病巣はほぼ独占的に核に存在する必要がありますが、細胞質テロメア染色は、特にALT細胞株で発生することがあります。結果として得られるテロメア信号は非常に明るい傾向があるため、テロメア信号が他の検出チャネルにに漏れないように注意する必要があります。ALT細胞株では、テロメアがPML小体¹⁴に集まることが多く、その結果、通常予想されるよりも病巣が少なくなります。このクラスタリングは、 図 4 の例 2 で確認できます。

テロメア維持にALTを使用する細胞株では、ネイティブテロメアFISHはALTの特徴であるテロメアssDNAを検出します^11,12。すべての核がテロメアssDNAを有することは期待されておらず、また、少数以上の涙点が単一の核に存在することは期待されていません(図4、実施例3および4を参照)。ネイティブのテロメアFISHシグナルは、変性するテロメアFISHほど明るくありません。骨肉腫細胞株U2OSは、ネイティブFISHの優れたポジティブコントロールです。テロメアssDNAは、テロメラーゼによって維持されるテロメアを持つ細胞株では観察されないと予想されます。

変性FISHと天然FISHの両方で、強い核小体蛍光はアーチファクトです。過剰な核小体シグナルが観察された場合は、RNase Aの新鮮な溶液を使用するか、RNase A処理を延長してみてください¹⁵ (プロトコルステップ3.8)。ALT状態が不明な細胞を用いたネイティブテロメアFISH実験では、U2OSなどの陽性ALT細胞株を使用して検出設定を較正します。

IF-FP-FISH実験におけるFPの観察は、検証のために生細胞イメージング実験と容易に比較できます。不一致が観察された場合は、さまざまな固定条件を試してください。CSBバッファー(プロトコルステップ3.1.2)での固定は、細胞構造の保存に有益であり、より正確なFP局在化を明らかにする可能性があります¹³。

免疫蛍光染色は、目的のタンパク質によって大きく異なります。IFの結果は、FISHを使用せずに調製されたサンプルと比較して、目的のタンパク質の局在化と強度に対するFISHプロトコルの影響を評価する必要があります。一般に、IF-FP-FISH実験は病巣のカウントに適していますが、強度は^{定量的ではない}可能性があります6。

図 1: 推定期間を含むワークフローの例。 一次抗体のインキュベーションを一晩行う場合は、さらに1日が必要になる場合があります。ネイティブFISHの場合、2日目と3日目が組み合わされることもありますが、これによりベンチ時間が長くなります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:4色イメージングを使用した実験の組み合わせの成功例。 例1および2は変性テロメアFISHを示し、3および4はネイティブFISHを使用します。なお、このプロトコルは、2つの標的タンパク質を免疫染色する(実施例1)、1つのFPおよび1つのIF染色を組み合わせる(実施例2および4)、または2つのFP(実施例3)のいずれであっても有用である。これらの実験の代表的な結果を 図4に示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:このプロトコルで使用される機器。 (A)カバースリップ鉗子。カバーガラスの取り扱いにはストレート鉗子を使用できますが、角度の付いたカバーガラス鉗子を使用すると作業がはるかに簡単になります。(B)洗浄用ラックに収められたカバースリップ。カバーガラスは、まっすぐにラックを横切ることに加えて、容量を増やすために隣接する溝の間に角度が付けられていることに注意してください。(C)染色皿にカバーガラスを4ラック入れた。ガラスの染色皿には、ラックに収められたカバーガラスが数十個収納されており、HCl酸洗浄の影響を受けません。(D)準備された加湿チャンバー。外側はホイルで覆われて暗い環境を作り出し、蛍光色素を保存します。底の湿らせたペーパータオルは湿気を提供します。(E)密閉された加湿チャンバー。乾燥を防ぐためには、ぴったりとフィットする蓋が不可欠です。(F)アルミホイルサポートの作成。トリミングされたホイルに隆起をエンボス加工すると、変性ステップ中にカバーガラスが互いに滑り込むのを防ぐことができます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:IF、FISH、および発現FPを含む4チャネルイメージング実験の代表的な結果。 パネルは、 図2に示した実験の実際の結果を示しています。DAPIはDNAを染色し、nAC-GFPは核内f-アクチンを強調し、TelFISHとTRF2-mCherryマークテロメアを強調表示し、PML免疫染色は核PML小体をマークし、nTelFISHはテロメアssDNAを明らかにします。すべての細胞はU2OS骨肉腫細胞です。画像は、超解像機能を備えた共焦点顕微鏡で取得されました。実施例1の画像は、レーザー走査型共焦点顕微鏡で取得した。他のすべての画像は、構造化照明顕微鏡で取得しました。すべてのスケールバーは5μMを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

IF-FISHを用いた実験は、テロメアストレスのアッセイやALT ^5,6,16の検出として、テロメア分野の主力として長い間主流となってきました。ここでは、プロトコルは蛍光タンパク質を含むように拡張されます。さらに、ネイティブテロメアFISHのオプションは、直交ALTアッセイ¹¹として提供される。このプロトコルは実行が簡単で、満足のいく結果を確実に生成します。

抗体またはPNAプローブの液滴を含むカバーガラスで操作することにより、このプロトコルは倹約できるように設計されています。液滴を使用すると、貴重な試薬を節約できます。対照的に、チャンバー付きスライドなどの代替品は高価で柔軟性が低くなります。カバーガラスの取り扱いは習熟度を高めるために練習が必要ですが、コスト削減により時間の投資は価値があります。75 μLを超える試薬液滴は推奨されないことに注意してください。液滴が大きいと、カバーガラスが滑り回るだけで、結果は改善されません。

nAC-GFPの発現は、図4に見られるように、核内f-アクチン⁸の視覚化に不可欠なツールです。重要な生物学的疑問に答えるのに役立つ可能性のあるタグ付き試薬は他にもたくさん存在します。たとえば、FUCCIプラスミドシステムを使用して細胞周期を視覚化でき、このプロトコルを使用してテロメア^FISH17と組み合わせることができます。細胞周期をアッセイするための別のアプローチは、PCNA染色体を使用して細胞周期情報を取得する可能性があります¹⁸。質問に応じて、多くのFPタグ付き試薬が市販されています。

ここでは、このプロトコルはテロメアFISHで実証されていますが、同じ濃度のPNAプローブを使用して、セントロメアFISHでも成功した結果が達成されています。たとえば、FAM標識セントロメアプローブをCy3標識テロメアプローブと多重化することが可能です。プロトコルが単一遺伝子座のDNA FISHでは機能する可能性は低いことを強調することが重要です。単一の遺伝子座をプロービングするには、サンプルのプロテアーゼ消化が必要であり、この消化は明らかにIFまたはFP検出と互換性がない¹⁹。ただし、IF と mRNA FISH を同様のアプローチで組み合わせることで成功が達成されています。明らかに、このシナリオではRNase処理ステップを省略する必要があります。

最後に、天然テロメアFISHがALTステータス^20,21の必須アッセイに急速になっていることは明らかです。集団ベースの²² である ALT の C サークル アッセイとは異なり、ネイティブ テロメア FISH は細胞レベルで ALT 読み出しを提供し、ALT ダイナミクスの変化を高感度に検出できます。天然のテロメアFISHをIFおよびFP発現と結合させることで、ALTメカニズムに関する重要な洞察を明らかにすることができます。やがて、これらの洞察が、テロメアの維持にALTに依存する腫瘍の標的療法につながることを願っています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10 % トゥイーン-20	バイオラッド	1610781	溶液が濁っている場合は廃棄してください。
10 倍の PBS	ギブコ	70011044	固定剤やその他の緩衝液を調製するには、後固定を使用します。
12ウェル細胞培養プレート	ヌンク	150628
16%メタノールフリーホルムアルデヒド	サーモサイエンティフック	28908
5 M 塩化ナトリウム	ミリポアシグマ	S6546
接着細胞、例: U2OS骨肉腫細胞	ATCCの	HTB-96
加湿チャンバー用気密ボックス	メパル	106415032500	適切な気密ボックスであれば機能しますが、底が不均一なボックスには注意してください。
アルコノックス	ミリポアシグマ	Z742914
アルミホイル	フィッシャーサイエンティフィック	01-213-100
適切な細胞培養培地(例:McCoy's 5A)	ギブコ	16600082	U2OSの場合、FBSを15%追加
セントロメアプローブ(FAM)	PNAバイオ	F3001	いくつかの蛍光色素が利用可能です
ChromoTek 核アクチン-クロモボディプラスミド (TagGFP)	プロテインテック	ACG-N
カバースリップフォーサー	ファインサイエンスツール	11251-33
カバースリップラック	ミリポアシグマ	Z688568
DAPIの	インビトロゲン	D21490	オプション、封入剤にDNA染色が含まれていない場合
ロバの美容液	ジャクソン免疫研究	017-000-121
エグタ	バイオワールド	40520008	0.5 M溶液 pH 8.0
エタノール	ワーナー・グラハム	200プルーフ
ウシ胎児血清	ギブコ	A5670801
フィブロネクチン	ミリポアシグマ	F0635	カバーガラスのオプションコーティング用
ホルムアミド	ミリポアシグマ	47671-250ML-F
ドイツ製ガラスカバーガラス	ワーナー・インシュルメンツ	64-0714	CS-18R15 (#1.5 厚さ、これが顕微鏡に適切であることを確認してください)
GFPブースター	プロテインテック	GB2AF488	GFP/mClover/YFP/Venus などを認識します。包括的なリストについては、製品情報を参照してください
蓋付きガラス染色皿	ミリポアシグマ	900203
デジタルタイマー付き加熱式超音波洗浄機	ブランソン	CPX-952-218R型	このバスソニケーターモデルには熱が含まれていますが、構成可能な電力や強度はありません。
塩酸	ミリポアシグマ	258148	濃HClは12 Nです。20 mLの濃HClを220 mLの脱イオン水に加え、1 N HCl
塩化マグネシウム溶液	ミリポアシグマ	63069	1Mソリューション
MESの	ミリポアシグマ	475893
メタノール	ミリポアシグマ	179337
パラフィルム	USAサイエンティフィック	3023-4526
塩化カリウム	ミリポアシグマ	P9541
一次抗体 マウス用抗PML	サンタクルス	SC-377390
一次抗体 ウサギ用抗53BP1	ノーバス	NB100-904
一次抗体 ウサギ用抗PML	アクローン	A1184
NucBlueでガラスを延長	インビトロゲン	P36981
RFPブースター	プロテインテック	RB2AF568型	mRFP/mCherry/mKate2/mPlumを認識します。包括的なリストについては、製品情報を参照してください
RNAアーゼA	ミリポアシグマ	RNASEA-ROの
ロシュブロッキングソリューション	ミリポアシグマ	11096176001
二次抗体(例:AF488抗マウス)	インビトロゲン	A-11001	または類似のもの
二次抗体(例:AF594抗ウサギ)	インビトロゲン	A-11012	または類似のもの
二次抗体(例:AF647抗マウス)	インビトロゲン	A-21235	または類似のもの
スパーテル	フィッシャーサイエンティフィック	10257402
滅菌PBS	ギブコ	14190144	カバーガラスの準備用
蔗糖	ミリポアシグマ	S0389
TelCプローブ(Cy3)	PNAバイオ	F1002	いくつかの蛍光色素が利用可能です
TelGプローブ(AF647)	PNAバイオ	F1014	いくつかの蛍光色素が利用可能です
トリスベース	ミリポアシグマ	648311	水中に1M溶液を調製し、HClを使用してpHを調整します
トリトン X-100	ミリポアシグマ	100倍
トリプシン-EDTA(0.25%)、フェノールレッド	ギブコ	25200072
ツァイスエリラ顕微鏡	ツァイス		または類似のもの