疾患関連イントロン変異体によって引き起こされるスプライシングエラーを調べるための超並列スプライシングアッセイ

サマリー

ここでは、ミニジーンコンストラクトを使用してイントロンバリアントを体系的にバルクで評価する超並列スプライシングアッセイ(MaPSy)を実行するための詳細なプロトコルを提示します。このアプローチにより、アンプリコンシーケンシングを通じて細胞内のバリアント誘発性スプライシング変化のハイスループット解析が可能になり、プレmRNAスプライシングへの影響の機能評価が可能になります。

要約

スプライシングエラーは、まれな遺伝性疾患の原因となる病原性変異の10〜30%を表します。RNAスプライシングは、エクソンを選択的に結合し、イントロンを除去することにより、適切な遺伝子発現を確保し、主要な調節配列はイントロン内に位置します。5'スプライス部位と分岐部位は、小さな核RNAと相互作用してスプライセオソームの認識複合体を形成し、ポリピリミジン路やスプライシングエンハンサー/サイレンサーなどの要素はタンパク質を動員してスプライセオソームの組み立てを調節します。イントロンバリアントからのスプライシングの中断を予測することは、これらの相互作用が複雑であるため困難です。

ヒトの自然遺伝子変異の90%を占めるイントロン変異体は、標準的なスプライシングを破壊し、病気を引き起こす可能性があります。この可能性を調査するために、患者が同定したイントロンバリアントを評価するための超並列スプライシングアッセイ(MaPSy)を開発しました。参照配列またはバリアント配列を持つ合成されたオリゴヌクレオチドを、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含むスプライシングミニ遺伝子にライゲーションしました。各コンストラクトには、目的の可変イントロン-エクソン接合配列を保持する中間エクソンに隣接する2つの定数エクソンが含まれていました。バリアント配列の細胞スプライシング効率をリファレンス配列と比較し、スプライシングバリアントとしての重大な破壊を特定することができました。

MaPSyの結果は、ミニジーンアッセイやCRISPRを介したゲノ ム編集などの追加のアプローチを通じて検証できます。さらに、破壊された接合部の集合分析により、スプライシングメカニズムとスプライシングエラーに関連する疾患の分子基盤についてのより深い洞察が得られます。

概要

RNA スプライシングは、翻訳のためにエクソンを結合し、イントロンを除去し、RNA の輸出を促進し、核酸の恒常性を維持する重要なプロセスです。この厳密に制御されたメカニズムは時間的および空間的に機能し、トランスクリプトームの多様性と複雑さに寄与します¹。スプライシングは、5'スプライス部位(5'ss)、分岐部位、3'スプライス部位(3'ss)などの主要なシグナルと、分岐部位の下流のポリピリミジン路やAGジヌクレオチド除外ゾーンなどの追加の調節要素によって導かれ^ます2の認識を助けます2。メカニズム的には、U1低分子核RNA(snRNA)は5'ssと対になり、分岐部位はU2 snRNA³と相互作用します。分岐部位、ポリピリミジン路、および3'sの協調活性は、U2低分子核タンパク質(snRNP)とU2補助因子の結合を促進し、スプライセオソームを安定させ、5'ssへの求核攻撃のための分岐点を位置付け、それによってスプライシングを開始します。

シーケンシング技術の急速な進歩に伴い、全ゲノムシーケンシングのコストは低下し続けており、ヒトの遺伝子変異のカタログは拡大し続けています。まれな遺伝性疾患における疾患関連変異の10〜30%がRNAスプライシングに影響を与え、^4,5,6、^治療標的として機能する可能性のある異常な遺伝子産物を生成することが多いと推定されています。ただし、イントロンバリアントの機能的影響を評価することは、スプライシングシグナルが複雑であり、冗長で縮退することが多いため、依然として困難です。5'および3'スプライス部位は比較的よく特徴付けられていますが、分岐部位、ポリピリミジン管、およびその他のスプライシング調節要素は、高等真核生物でかなりの配列と位置のばらつきを示します。大規模なマッピング研究により、単一のイントロン7,8,9,10内に複数の分岐部位が存在する可能性があり、イントロン-エクソン境界変動の解釈が複雑になることがさらに実証されています。

ディープラーニングは、一次配列がスプライス^{部位認識に}どのように寄与するかを評価するために採用されており^4,11,12、^スプライシングバリアントは、エクソンとイントロンの3'領域にまばらに伸びながら、標準的なスプライス部位にクラスター化していることが明らかになりました。このパターンは、5'スプライス部位の選択は主にコンセンサス配列によって決定されるのに対し、3'スプライス部位の認識は分岐部位やポリピリミジントラクトなどの追加のイントロン要素に依存するという確立された理解と一致しています。ただし、既存のモデルは、イントロンバリアントに特に焦点を当てるのではなく、構成的なスプライス部位を代替または人工的なスプライス部位と区別するようにトレーニングされています。その結果、これらの計算ツールは中程度の予測精度しか示さず、主にスプライス部位とエクソンスプライシングバリアント^{13、14、15、16}を識別します。予測モデルに加えて、スプライシングバリアントを大量に検証できる実験システムは、スプライシング欠陥の同定と特性評価を大幅に強化します。

疾患関連イントロン変異体をスプライシング表現型に結び付ける包括的なRNAシーケンシングデータは、頻度が低く、既存のデータセットからスプライシング結果を予測することが難しいため、依然として不足しています。このギャップに対処するために、スプライシングバリアントを体系的に分析するためのハイスループットスプライシングアッセイと計算モデルが開発されました。超並列スプライシングレポーターアッセイ(MaPSy)は、スプライス部位の選択に対する可変配列の影響を評価するように設計されています。MaPSyは、5'および3'スプライス部位付近に配列変異を組み込むか、固定ミニ遺伝子骨格内のイントロンエクソン領域全体にまたがることにより、スプライシング変化の機能評価を可能にします。ただし、バルクオリゴヌクレオチド合成の制限により、このアプローチではディープイントロンバリアントと擬エクソン活性化は捕捉されません。

MaPSyの堅牢性は、70の独立したスプライシングミニ遺伝子を使用して検証されており、0.89¹⁷のピアソン相関が得られます。特に、スプライシングドナーバリアント(+1および+2)の約90%がスプライシング欠陥を示し、アッセイの精度が強調されました。さらに、ランダム化された分岐部位配列を持つMaPSyは、分岐部位認識の縮退性とU2コアタンパク質への依存を明らかにしました¹⁸。さらに、蛍光活性化細胞選別(FACS)と組み合わせた分割GFP MaPSyデザインを使用して、遺伝的変異によって引き起こされるエクソンスキップイベントを調査しています。このアプローチにより、スプライシング破壊バリアントの 54% が標準スプライス部位¹³ を含むイントロン領域に存在することが明らかになり、スプライシング調節におけるイントロン要素の重要な役割が強調されました。まとめると、これらの発見は、スプライシング制御におけるイントロン配列の重要性を強化し、疾患関連のスプライシング欠陥の同定におけるMaPSyの有用性を実証します(図1)。

図1:近接エクソンイントロン変異の超平行スプライシングアッセイ(MaPSy)の実験計画。 ヒト疾患のデータベースに記録された変異体が収集され、5,307対のオリゴとして合成されました。各オリゴペアには、78ヌクレオチド(nt)イントロン領域と35ntエクソン領域にわたる参照対立遺伝子と変異対立遺伝子が含まれています。オリゴは、3エクソンスプライシングミニ遺伝子への増幅とライゲーションのための共通のプライミング部位に隣接しています。したがって、合成された領域は、ミニ遺伝子の第2エクソンの3'ssを含む。ミニ遺伝子の組み立て後、プールされたミニ遺伝子をヒト胚性腎臓(HEK293T)細胞にスプライスしました。得られたスプライシングされたアイソフォームを採取し、アンプリコンシーケンシングによって分離しました。この図は、Chiang et ^al.17 の許可を得て適応されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プロトコル

1. MaPSyオリゴヌクレオチド(オリゴ)ライブラリーの合成

1. 基本的なオリゴ構造:155-ヌンクレオチド(nt)プール内の各オリゴを設計して、35-ntエクソン配列と80-ntイントロン配列を含むように設計し、両端に20-ntの共通プライミング配列に隣接する115-nt遺伝子特異的領域を形成します(図2A)。
2. バリアント収集:モチーフの完全性を維持し、スプライシングに影響を与える調節領域に焦点を当てるために、次のようなイントロンバリアントを収集します。
   3 から -78 から +10 nt
   5 から -3 から +30 nt
   注:臨床変異体は、ClinVar¹⁹、dbSNP²⁰の低頻度エントリ、関連出版物、および追加の臨床データベースから入手できます。ゲノム座標を使用して、バリアントを目的のゲノム領域と交差させることができます(例えば、BEDTools²¹を使用)。バルク合成のオリゴプール内のサイズばらつきを最小限に抑えるために、15 nt未満の一塩基多型(SNP)および小さな挿入/欠失(インデル)のみを選択する必要があります。
3. 基本的なミニジーン構造:スプライシングジャンクション構造を維持するために、各ミニジーン骨格には3つのエクソンが含まれています:EGFPのフラグメントをコードする2つの定数の外側エクソン(pGint、Addgene Plasmid #24217から)と、ヒト CAMTA2 のエクソン15に由来する中間エクソン(図2B)。 CAMTA2 フラグメントとpGintの両方を BamHI および SalI 制限酵素で消化し、 CAMTA2 フラグメントをEGFPエクソン間のpGintにライゲーションして、pGint-CAMTA2 3エクソンミニジーンを作成します(補足ファイル1)。
   注:中間エクソン、すなわち CAMTA2 エクソン15は、標的細胞で発現した場合、中間のスプライシング効率を示すはずです。この特性は、バランスの取れたベースラインを提供し、バリアント効果によるスプライシング効率の増加と減少の両方を検出できるため、不可欠です。
4. プライミング部位の設計:各オリゴが中央エクソン/イントロン内の意図した挿入部位と重なる~20-ntの隣接配列を含むように、挿入部位配列をライブラリの両端に追加します(図2A)。
   注:オリゴプールが複数のミニ遺伝子コンストラクト用に設計されている場合、複数のプライミング部位を組み込むことができます。
5. バーコード設計:イントロンバリアントの場合、イントロン配列はスプライシング後に失われるため、遺伝子型とスプライシングされた生成物を区別するためにエクソンバーコードが不可欠です。バーコード配列によるスプライシングの変化(つまり、バーコード効果)を回避するには、バーコードをエクソン内の遠位、スプライス部位から離れた場所(つまり、エクソンプライミング部位のすぐ隣)に配置します。
   注:可能であれば、バリアントごとに複数のバーコードを使用することをお勧めします。必要なバーコードの長さは、ライブラリの複雑さによって異なります。例えば：
   参照対立遺伝子が1つのバリアントとのみペアになる場合は、1-ntバーコードで十分です。
   参照対立遺伝子が6つの異なるバリアントとペアになる場合は、2-ntバーコードが望ましいです。
   単一の参照対立遺伝子に密接に関連する複数のバリアントを持つライブラリー(たとえば、1つのヌクレオチドのみが異なる)は、分析の複雑さを増す可能性があります。
6. オリゴの順序付け:オリゴをFASTAファイル形式で順序付けし、各バリアントジャンクションを参照対立遺伝子と並べてペアにします。
   注:複数のバリアントを持つジャンクションの場合、ジャンクションごとに必要な参照対立遺伝子は1つだけです。プールされた配列合成サービスは、GeneScript(https://www.genscript.com/gentitan-oligo-pools.html)、Twist Bioscience(https://www.twistbioscience.com/products/oligopools)、IDT(https://sg.idtdna.com/pages/products/custom-dna-rna/dna-oligos/custom-dna-oligos/opools-oligo-pools)、Agilent(https://www.agilent.com/en/product/oligo-pools-oligo-gmp-manufacturing/pooled-oligo-synthesis)などの企業から利用できます。合成の長さ、ライブラリの容量、コストは、プロバイダーや地域によって異なる場合があります。

図2:MaPSyのオリゴおよびスプライシングミニ遺伝子設計。(A) イントロンの3'または5'末端のプールされたオリゴ合成のための設計。図は、155-nt オリゴの基本構造を示しています。オリゴ合成の実際の能力は、生産のために選択された会社によって異なります。 (B) MaPSyミニ遺伝子の設計。pGintプラスミド(i)から3エクソンミニジーン(ii)を修飾し、スプライス部位をプールされたオリゴに置き換えて、スプライシングシグナルの変動を導入しました(iii)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. MaPSyライブラリーDNAテンプレートの構築

1. オリゴプールを受け取ったときの初期増幅
   1. オリゴプールを受け取ったら、High-Fidelity DNAポリメラーゼを使用した100 μLポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、設計された隣接プライミング部位で10〜50 ngのオリゴライブラリーを増幅し、オリゴを二本鎖に変換します( 表1のLibFおよびLibRプライマー、 表2のサーモサイクラー設定)。
   2. 精製カラムを使用してPCR産物をクリーンアップします。詳細には、PCR産物をカラムメンブレンに結合させ、70%エタノールを含むバッファーで洗浄して、残留プライマー、塩、ポリメラーゼを除去します。最後に、精製したPCR産物を低塩緩衝液またはヌクレアーゼフリー水を使用して溶出します。
   3. 増幅されたオリゴサイズをゲル電気泳動で検証します。精製したPCR産物5 μLを、1× TAEバッファー(40 mM Tris塩基、20 mM酢酸、1 mM EDTA、pH 8.0)で調製した1.5%アガロースゲルにロードします。
      注:過剰増幅とPCRバイアスを防ぐために、PCR増幅サイクルを15に制限してください。通常、ターゲット生成物よりも大きい二次ファジーバンドは、オリゴプール内の過剰増幅と不完全なアニーリングを示している可能性があります。PCR産物の一部を保存し、オリゴプールを配列決定して品質とエラー率を評価してから続行します(停止点)。
2. MaPSyスプライシングミニ遺伝子の構築 初期PCR
   1. バックボーンフラグメント:0.5 ngのpGint-CAMTA2プラスミドバックボーンを2つの主要なPCRフラグメントのソースとして使用します
      1. PCR産物1:CMVプロモーター、最初のエクソン(N末端EGFP)、および最初のイントロンの一部を増幅します(表1 および 表2)。
      2. PCR産物3:中間エクソンの一部(CAMTA2エクソン15)、2番目のイントロン、3番目のエクソン(C末端EGFP)、およびSV40ポリアデニル化シグナルを増幅します(図3、表1、 および表2)。
   2. ライブラリアンプリコン:PCR産物2:3のライブラリーの場合、PCR産物1およびPCR産物3の内側の端に一致するように、両端に重複する配列を持つライブラリアンプリコンを増幅し、CAMTA2エクソン15の3で効率的に統合できるようにします(図3、表1、および表2)。
      注:5'ssライブラリの場合、中央エクソン結合の5'末端をライブラリ配列に置き換えます。
3. PCR後、手順2.1.2のように精製カラムを使用してすべての製品をクリーンアップします。テンプレートベクターからの汚染を防ぐために、アガロースゲル抽出によってPCR1およびPCR3から目的の生成物を精製します。具体的には、電気泳動後、標的PCR産物を含むアガロースゲル~100mgを切除し、結合バッファーに溶解する。溶解したゲル溶液をカラムメンブレンに結合し、標準的なPCR精製プロトコルに進みます。
4. MaPSyスプライシングミニ遺伝子の構築- オーバーラップ伸長PCR:オーバーラップPCRを1回または連続して実行して、3つの主要なフラグメント(PCR産物1、ライブラリアンプリコン、およびPCR産物3、テンプレートとしてそれぞれ~20 ngを使用)を完全長スプライシングミニ遺伝子にライゲーションします( 表1の最も外側のプライマーCAMGFPFおよびCMVGFPR、 および表2のサーモサイクラー設定を使用します)。
   注:最終生成物には、CMVプロモーターと3つのエクソンが含まれており、最初の3はオリゴヌクレオチドライブラリーに由来しており、細胞ベースの実験のためにトランスフェクションの準備ができています。
5. 組み立て後、PCR精製カラムを使用して完全長DNAテンプレートをクリーンアップします。ゲル中に非特異的なバンドが観察された場合は、ステップ2.3のようにゲル抽出を実行して、目的の完全長生成物を正確に分離します。
   注:ライブラリ内の非常に類似した配列は、不完全なアセンブリにつながる可能性があります。1回のPCR反応で完全な組み立てが困難な場合は、連続したオーバーラップPCR(2つのフラグメントから始めて、3番目のフラグメントを追加する)を試みることができます。PCRの特異性を向上させるには、アニーリング温度を調整するか、タッチダウンPCRを実装して、複雑なテンプレートの結合特異性を高めることを検討してください。少なくとも4つの独立した実験を実行するのに十分なMaPSyコンストラクトを準備します。一部のオリゴヌクレオチドは効率的に増幅できず、不完全なアセンブリ(ストップポイント)になる可能性があるため、次世代シーケンシングのために各コンストラクトの小さなアリコートを保存して配列の完全性を検証します。

図3:ライブラリ構築のワークフロー。(A) オーバーラップPCRで使用されるプライマー( 表1も参照)。 (B) オーバーラップPCRの手順。簡単に言えば、オリゴプールとスプライシングミニ遺伝子の他の部分は、25のPCRサイクルによって増幅されました。プロモーターと最初のエクソンを含むフラグメント(PCR産物1)を、20の増幅サイクルを使用してPCRを重ねることにより、オリゴプール(PCR産物2)に縫合しました。次に、ステッチされた生成物(PCR産物1+2)を、20回の増幅サイクルを使用して、3^番目の エクソンとポリアデニル化シグナル(PCR産物3)を含むフラグメントにさらにステッチし、最終的な構築物(PCR産物1+2+3)を取得しました。この図は、Chiang et ^al.17 の許可を得て適応されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

MaPSyライブラリープライマーの構築		手記
CMVGFPF	CCGCCATGCATTAGTTATTAATAG	PCR産物1
リブR2	CAGGTCTTCAGGCCCCAGCC	PCR産物1
LibF	GGCTGGGGCCTGAAGACCTG	PCR産物2
リブR	AAGGCGCACATGACCCCGGG	PCR産物2
LibF2	CCCGGGGTCATGTGCGCCTT	PCR産物3
CMVGFPR	GGACAAACCACAACTAGAATGC	PCR産物3
アンプリコンシーケンシング用のMaPSyライブラリPCRプライマー
P7-Lib0F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib1F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib2F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib3F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P5-Lib0RIです	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTataagagacagcgaaggctcctgtctctgtagt
P5-Lib1RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
P5-Lib2RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
P5-Lib3RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNCGAAGGCTCCTGTCTCTGTAGT
バリデーション入門書
Lib0F (ライブラリ検証)	AAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
Lib0R (ライブラリの検証)	CAGCTTGCCGTAGGTGGCAT

表1:このプロトコルで使用されるプライマー。

PCR反応ミックス
コンポーネント	容積
ddH2O	13.4 μL
5x HFバッファ	4 μL
10 mM dNTP	0.4 μL
フォワードプライマー 10 μM	0.5 μL
リバースプライマー 10 μM	0.5 μL
cDNA	1 μL
高忠実度DNAポリメラーゼ	0.2 μL

PCRプログラムを実行する(20 μL反応)
	一時	時間	サイクル
初期変性	98°C	1分	1
変性	98°C	30秒	10–20
アニーリング	65°C	30秒
延長	72°C	30秒	変性に戻る
最終延長	72°C	5分	1
持つ	4°C	持つ	持つ

表2:サーモサイクラーの設定。

3. 哺乳類細胞からのスプライシングミニ遺伝子の発現と回収

1. 細胞培養:10%ウシ胎児血清(FBS)、100単位/mLのペニシリンとストレプトマイシン、および2 mM L-グルタミンを37°Cで5%CO₂ 中で添加したダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)にHEK293T細胞を維持します。
2. スプライシングミニ遺伝子のトランスフェクション:
   1. トランスフェクションの24時間前に、6ウェルプレートの2 mLの培地に5×10⁵ HEK293T細胞をプレートします。
   2. メーカーのプロトコルに従って、1〜2 μgのMaPSyコンストラクトで細胞をトランスフェクトし、3.75 μLトランスフェクション試薬で5分間プレインキュベートします。トランスフェクションの成功は、スプライシングされたライブラリーからのEGFPシグナルの存在によって示されます。
   3. トランスフェクションの24時間後に、250 μLのTrizol(または同等品)を使用して細胞を溶解します。
3. RNA抽出:メーカーのプロトコルに従って、RNAミニプレップキットを使用してトータルRNAを抽出します。具体的には、Trizol中のRNAをカラムメンブレンに結合し、70%エタノールを含むバッファーで洗浄して塩、タンパク質、その他の不純物を除去し、精製したRNAを低塩バッファーまたはヌクレアーゼフリー水で溶出します。
   注意:トリゾール(または同等品)は腐食性が高く、毒性があります。曝露は、重篤な化学火傷、永久的な瘢痕化、腎不全につながる可能性があります。
   注:RNAは、Trizol(またはTOOLSのTOOLSmart RNA抽出器などの同等のTrizolベースの試薬)に-80°Cで最大1年間保存できます(停止点)。精製されたRNAは、凍結融解サイクルを最小限に抑えれば、-80°Cで最大2年間保存できます(停止点)。
4. 逆転写:メーカーのプロトコルに従って、ランダムヘキサマーを含む逆転写酵素を使用して、2μgのトータルRNAからcDNAを調製します。具体的には、RNAを50μMランダムヘキサマーと室温で10分間インキュベートしてアニーリングを可能にし、次に55°Cで10分間逆転写を行います。
   注:cDNAは-20°Cで最大1年間保存できます(停止点)。
5. スプライシングされたミニ遺伝子の増幅:スプライシングされたミニジーンの特定のプライミング配列を使用してPCRを実行します(表2)。アガロースゲル上で生成物を視覚化するために必要な最小限のサイクル数を使用します。
   注:スプライシングされていない製品とスプライシングされた製品の混合バンドがゲル上に見えるはずです。バンドは、DNA種の混合集団のために拡散しているように見える場合があります(図4A)。
6. 手順2.1.2のように精製カラムを使用してPCR産物をクリーンアップします。
7. シーケンシングアダプターの取り付け:PCRの最終ラウンドを実行して、シーケンスアダプター配列をアンプリコン末端に取り付けます。アンプリコンの末端に0〜3個のランダムヌクレオチドを含めて、NextSeqプラットフォームでのバランスの取れた蛍光検出を確保します(表1)。
8. 手順2.1.2のように精製カラムを使用してPCR産物をクリーンアップします。

4. アンプリコンの配列決定と解析

1. ショートリードシーケンシング:コア施設または商用サービスを通じて、Illumina Miseq、Novaseq、または同等のものを使用して、PCRアンプリコンを150ペアエンドシーケンシングにかけます。
2. アラインメント：
   1. 参照ゲノムの作成: 各固有の遺伝子型を個別の染色体としてラベル付けすることにより、合成「参照ゲノム」を作成します。リファレンスゲノムには、アンプリコン内に含まれる合成エクソンとイントロンが含まれます。
   2. シーケンシングリードを整列させる:HISAT2 ^22,23を使用してペアエンドリードをリファレンスゲノムに整列させ、スプライシング固有の要素を制御するパラメータを調整します(コマンドラインの詳細については、補足ファイル2を参照してください)。
   3. 高品質の読み取りを選択する: SAM を BAM 形式に変換し、高品質の読み取り (マッピング品質 ≥60) をフィルター処理してから、BAM ファイル²⁴ を並べ替えてインデックスを作成します (コマンド ラインの詳細については、「 補足ファイル 2 」を参照してください)。
   4. スプライス ジャンクションの識別とジャンクション リードの計算: アライメントされた BAM ファイル内の CIGAR 文字列からエクソン スキップ イベントを抽出することにより、スプライス ジャンクションの使用量を定量化します。「N」操作に基づいてジャンクションにまたがる読み取りを識別し、ジャンクション座標とストランドごとの読み取りカウントを集計して、スプライシング パターンを評価します(コマンドラインの詳細については、 補足ファイル 2 を参照)。
   5. 標準スプライス サイトの分類: スプライス サイトが注釈付き GT-AG 接合に一致する場合、スプライス サイトを標準として分類します。
      注:まれに、MaPSyの参照対立遺伝子が非標準的なスプライス部位を利用することがあります。指定されたスプライス サイトの位置にまたがるジャンクションがない読み取りは、スプライスされていない読み取りとして保持されます。
3. スプライシングバリアントを特定するための統計分析:リードを3つのグループに分類します。
   (1)スプライスされた読み取りとスプライスされていない読み取り。
   (2) すべてのスプライスされた読み取りにおける正規と非正規。
   (3) 正規と非正規およびスプライスされていない読み取り。
   両側フィッシャーの正確確率検定を実施し、その後、誤発見率(FDR)補正(表3)を実施して、スプライシングの効率と精度に対するバリアントの影響を評価します。
4. 信頼度の高いスプライシングバリアントのフィルター処理:4回のリピートでq値が0.05未満で、リードカウントが100を超える参照/バリアントの両方のペアを有意として分類します。次に、参照またはバリアント対立遺伝子のいずれかが>5%の非スプライシングリードおよび非標準リード、信頼性の高いスプライシングバリアントを有する2倍のオッズ比変化を持つ候補を検討します(図4B)。

読み取り	スプライシング	スプライスなしおよび/または非正準
参考	ある	b
バリアント	c	d

表3:フィッシャーの正確確率検定の2行2列の表。

5. 検証

1. 検証のためのミニジーンスプライシング:
   1. オリゴの合成と増幅:選択されたMaPSy候補配列のDNAオリゴを個別に合成します(たとえば、Integrated DNA Technologiesによる)。次に、設計した隣接配列を使用してオリゴを、高忠実度DNAポリメラーゼを使用したPCRによって二本鎖に増幅します(表2)。
   2. ミニジーンクローニング:得られたPCR産物とpGint-CAMTA2の両方を BbsI および SmaI で消化し、消化された産物をDNAリガーゼでライゲートします。
   3. トランスフェクション:ステップ3.2.2としてトランスフェクション試薬を使用して、得られたコンストラクトをHEK293T細胞にトランスフェクションします。
   4. RNA抽出:ステップ3.3で説明するように、トランスフェクトされた細胞からRNAを抽出します。
   5. 逆転写:ランダムヘキサマーを使用して逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を実行します。
   6. スプライシングアイソフォーム増幅:ミニ遺伝子の最初の2つのエクソンを標的とするプライマーでスプライシングアイソフォームを増幅します(Lib0FおよびLib0Rl、 表1、 表2のサーモサイクラー設定)。増幅された生成物を電気泳動で分離し、Gel Doc Systemを使用して視覚化します。
   7. 定量化:ImageJ(米国国立衛生研究所)^25,26を使用して、各スプライシングアイソフォームのシグナル強度を定量化します。または、eGENE HDA-GT12高性能核酸分析装置を使用したDNAスクリーニングキットを使用して、PCR産物の強度と分子量を定量します。
   8. アイソフォームの抽出と確認:ステップ2.3としてアガロースゲル抽出によって各アイソフォームを単離し、コア施設または商用サービスを通じてPCR産物のサンガーシーケンシングによってスプライシング結果を確認し、正常なスプライシング、イントロン封入、およびエクソンスキップを評価します。
2. マルチエクソンスプライシングミニ遺伝子:
   1. MaPSyの結果を検証した後、目的のバリアントを選択し、ゲノムDNA(gDNA)から3〜5つのエクソンをクローニングして、観察されたスプライシング欠陥のよりゲノム的なコンテキストを提供します。
   2. 変異原性プライマーとオーバーラップPCRを使用して部位特異的変異誘発を実行し、標的部位に目的の配列変化を保持するミニジーンコンストラクトを組み立てます。
      注:隣接イントロンがクローニングには長すぎる場合は、適切なスプライシングコンテキストを確保するために、各スプライス部位のイントロン配列の約300 ntを保持します。
   3. 上記の5.1で説明したように、細胞ベースのスプライシングアッセイを実行します。
3. 細胞検証:細胞内のスプライシング効果を検証するには、テンプレートベースのCRISPR編集を使用して、適切な細胞モデルで選択されたバリアントの配列を変更します。
   注:可能であれば、特定のバリアントを持つヒトサンプルを使用して、スプライシングパターンを直接評価します。

結果

MaPSy構築物の細胞スプライシングに続いて、スプライシングされた生成物とスプライシングされていない生成物の両方が混合物として存在します。ライブラリのサイズの多様性と非標準スプライシングの可能性により、両方のタイプの生成物がゲル上でやや拡散しているように見える場合があります。3'末端を標的とするコンストラクトでは、部分的なアデノウイルス配列を含む2番目のイントロンが非常に堅牢にスプライスする傾向があります(図4A)。

MaPSy実験では、疾患関連バリアントの約10〜30%がスプライシングの変化を示し、重要な症例の大部分は標準的なスプライシング効率の低下を示しています(図4B)。非標準的なスプライシングは、スプライシングバリアントのプールを適度にシフトする可能性がありますが、スプライス部位の競合フレームワーク内で非標準的なスプライス部位を促進するバリアントを特定するには、分析にこれらのイベントを含めることが不可欠です(図4C...

ディスカッション

MaPSyコンストラクトの固有のEGFPシグナルにより、エクソンスキップの蛍光ベースの検出が可能になります。中間エクソンまたはイントロンの配列がエクソンスキップを促進する場合、第1および第3エクソンのライゲーションはFACSによって検出可能なEGFPシグナルを生成するため、これはエクソンスキップに影響を与えるバリアントを同定し、スプライシングバリアントの顕微鏡ベースの視覚化を促進するための貴重な方法になります¹³。しかしながら、本明細書に記載されているアンプリコンシーケンシングアプローチは、ライブラリー情報を欠いており、したがって配列決定されないため、エクソンスキップ産物を捕捉しない。したがって、私たちの方法は、エクソンスキップを誘導するバリアントを直接特定しません。それにもかかわらず、以前の分析に基づいて、標準的なスプライシングを減らすバリアントは、非標準的なスプライス部位の使用やエクソンスキッピング^17,27

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Direct-zol RNA MiniPrep Plusキット	ザイモリサーチ	R2072
ダルベッコ'の改造されたイーグル」s ミディアム (DMEM)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11965084
ウシ胎児血清 (FBS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	26140079
L-グルタミン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A2916801
リポフェクタミン 3000	サーモフィッシャーサイエンティフィック	L3000015
ペニシリン-ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140122
pGintプラスミド	アドジーン	24217
Phusion 高忠実度 DNA ポリメラーゼ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	F530L
QIAquickゲル抽出キット	キアゲン	28706
QIAquick PCR精製キット	キアゲン	28106
QIAxcel DNAスクリーニングキット (2400)	キアゲン	929004
SuperScript IV逆転写酵素	サーモフィッシャーサイエンティフィック	18090010