方法論記事

研究および治療用の改変ウイルスベクターの組換えベースの製造

DOI：

10.3791/68988

⸱

2025年9月26日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CEINGE Biotecnologie Avanzate Franco Salvatore S.C.aR.L., 2Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 3ImGen-T Srl

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

組換えを介した遺伝子工学法である組換えは、酵素消化に依存せずに正確なウイルスゲノム改変を可能にします。このアプローチは、標的欠失などの基礎研究や、腫瘍溶解療法、遺伝子治療、遺伝子ワクチンに使用される操作ウイルスの開発に不可欠であり、研究と臨床応用の両方で可能性を広げます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基礎研究とトランスレーショナル研究の両方で操作されたウイルスベクターの需要が高まっているため、組換え DNA ウイルスを生成するための柔軟で迅速かつスケーラブルな方法の必要性が強調されています。制限酵素の消化とライゲーションに依存する戦略は、配列依存の制限と時間のかかるクローニングステップによって制約されます。ここでは、細菌の人工染色体(BAC)におけるウイルスゲノムの正確かつシームレスな改変を可能にすることで、これらの制限を回避する組換えを介した遺伝子工学法(組換え)について説明します。このアプローチにより、コードまたは非コード遺伝要素の効率的な削除、挿入、または置換が可能になり、ハイスループットウイルスベクター開発のための強力なプラットフォームが提供されます。組換えは、ウイルス遺伝子の機能を調査するための欠失や変異などの基礎研究用途において特に価値があります。さらに重要なことは、この方法論により、異なる免疫刺激または治療ペイロードをコードする数十の組換えウイルスを並行して生成できるため、新規コンストラクトの迅速な前臨床評価に非常に適しています。この技術はあらゆる科学的目的に実装できる可能性がありますが、この記事では、単純ヘルペスウイルスに基づく腫瘍溶解性ウイルスの生成と、遺伝子導入のための非複製アデノウイルスベクターの開発という2つの特定の分野での組換えの応用に焦点を当てます。結論として、組み換えはウイルスゲノム工学への多用途のアプローチを提供し、設計から機能テストまでのパイプラインを大幅に加速します。その関連性は、進化する研究や臨床ニーズを満たすために、基礎ウイルス学からトランスレーショナル医療まで多岐にわたります。

概要

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ウイルスベクターは、遺伝物質を宿主細胞に送達する自然な能力により、遺伝子治療、腫瘍溶解性ウイルス療法、遺伝子ワクチン開発における強力なツールとして浮上しています。これらはウイルスの自然な向性と形質導入メカニズムを活用し、一過性および長期的な遺伝子発現を促進します。それらは細胞外環境で生き残り、特定の細胞受容体(ウイルス向性を定義する)に付着してそれらの内在化を促進し、宿主細胞の遺伝子発現機構を乗っ取って独自の遺伝子の発現を促進し、自然免疫群の膜結合および細胞内センサーを回避することができます1,2.このようにして、生産的なウイルス感染の後、ウイルスは細胞をウイルスの子孫工場に変え、新しいウイルスを生物に広げ、最終的に病気を引き起こします。

野生型ウイルスは、遺伝子工学によってバイオテクノロジーツールに変換できます:そのゲノムを簡単に操作して形質導入能力を維持し、臨床転帰を得ることができます。それらの臨床応用に基づいて、ウイルスベクターは、複製能力を(少なくとも部分的に)保持または除去して、複製能力または複製不能力ベクターのいずれかを生成するように設計することができます3,4。

複製能力のあるウイルスは、主に腫瘍溶解性ウイルスの目的を目的としています。抗ウイルス防御が欠損していることが多いがん細胞1は、病原性遺伝子の欠失によって操作された弱毒化組換えウイルスの複製を可能にします。これらのウイルスは、正常組織を温存しながら腫瘍内で選択的に複製します。ウイルス学の理解が進むにつれて、弱毒化ウイルスは、安全性と治療効果の両方を高めるために設計された、より正確なゲノム修飾に取って代わられてきました。

ウイルスゲノムの外科的分子工学を必要とする関心のある分野には、次のものがあります。i)ウイルスプロモーターが腫瘍関連プロモーター(腫瘍細胞で過剰転写される細胞プロモーター)に置き換わり、それによってウイルス遺伝子発現を病変細胞に制限する複製条件付き腫瘍溶解性ウイルス5。ii)向性が変化したウイルス6,7、感染を決定するエンベロープ糖タンパク質は、腫瘍細胞で過剰発現したタンパク質を標的とする抗体断片またはリガンドで修飾または置換される可能性があります8,9。iii) 武装腫瘍溶解性ウイルス。腫瘍溶解性ウイルスによって誘発される腫瘍細胞死は、炎症性メディエーター 1,10 および腫瘍抗原11 の放出を特徴とする免疫原性細胞死 (ICD) を引き起こします。これらのシグナルは、免疫系による腫瘍抗原の効率的な認識を促進し、サーベイランス12を回復し、免疫チェックポイント阻害剤13、14、15およびRNAベースの治療法やワクチンなどの他の免疫治療薬との併用を可能にします16。

この免疫治療効果を支持するために、目的の導入遺伝子をウイルスゲノム内にコードすることができ、それによってウイルスの腫瘍溶解活性だけでなく、関連するペイロードのin-situ産生を通じてその免疫治療の可能性を高めることができます3,7,17,18,19。これらのペイロードは、サイトカイン、ケモカイン、抗体、自殺遺伝子、および抗原3,20を含むことができる。挿入には精度が必要であり、ウイルス遺伝子の破壊を最小限に抑え、複製と効力を維持するために、ウイルスゲノムの遺伝子間領域が好まれます7。したがって、最適な挿入部位と目的の導入遺伝子の両方のスクリーニングを可能にする技術が不可欠です。

一方、遺伝子治療または遺伝子ワクチンの媒体として使用される非複製ウイルスの文脈では、毒性を回避するために、ウイルスベクターが宿主細胞に複製せずに導入遺伝子を(一過性または長期にわたって)送達することが重要です21。アデノウイルスベクターは、高い形質導入効率、導入遺伝子の堅牢な発現、および分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染する能力を特徴としています3。これらの特性により、COVID-19などの新興感染症や遺伝子置換療法を含む遺伝子ワクチンの開発において、クラス初の存在となっています22。市場に出回ったアデノウイルスベクターの最も有名な例は、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質をコードする改変チンパンジーアデノウイルスChAdOx1をベースにした、コビシールドまたはバクシェブリアの商品名で知られるオックスフォード・アストラゼネカのCOVID-19ワクチンである。筋肉内経路で注射すると、コビシールドは細胞内に浸透してスパイクタンパク質の発現を誘導し、免疫系がスパイクタンパク質に対する免疫応答を開始するようにプライミングすることができます3。

制限酵素認識部位に制約されることなくウイルスゲノムを改変する必要性は明らかです。腫瘍溶解性ウイルスの中で、単純ヘルペスウイルス-1(HSV-1)ベースのベクターは、溶解能力、安全性、および大きなゲノムサイズなどの独自の利点を提供し、かなりの導入遺伝子または複数の遺伝的要素の挿入を可能にします23,24。HSV以外にも、Sasso et al.3で最近レビューされたように、他の多くのウイルスが治療の可能性を示しています。普遍的な「クラス最高の」ベクターではなく、さまざまなウイルスプラットフォームが異なる治療ニーズに適しています3.現在、細菌またはハイブリッド酵母-細菌クローニングにおける相同組換えシステムは、制限酵素の最も一般的な代替手段であり続けていますが、これらは手間がかかり、多段階であり、非効率的です25。

新たな代替手段は、ワクシニアウイルス(VV)、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルスベクターなどのウイルスのゲノムを操作するために最近適用されたCRISPR/Cas9の使用です。Cas9は、インデル変異による遺伝子の不活性化に魅力的ですが、ゲノムセグメントを削除したり、ドナーDNAを介して導入遺伝子を挿入したりするために複数のカットが必要な場合、実用性が低くなります。さらに、編集は、gRNA設計、ウイルスゲノムと宿主ゲノムの両方におけるオフターゲット効果、および関心領域におけるPAM配列への依存によって制限されます25。

これを念頭に置いて、HSVとアデノウイルスに基づく2つの例を通して、ウイルスからバクテリオファージ、複雑なプラスミド、および多様な実験システムまで幅広く適用できる組換え法を示します。組換え(相同RECOMBInation媒介遺伝子工学)は、主に大腸菌で使用されるin vivo遺伝子工学技術であり、温度依存性バクテリオファージ組換えタンパク質を利用して、わずか30 bpの相同性でDNA要素間の相同組換えを触媒します26。このアプローチにより、制限部位やDNAサイズに依存することなく、配列の正確な挿入、削除、または修飾が可能になります。この原稿では、熱誘導性大腸菌SW102に基づくバージョンについて説明しますが、特定の誘導性システムを持つ代替株も利用可能です27。

組換えは、制御された温度ショックを通じて電気コンピテント細菌細胞を調製し、ファージ組換え機構を活性化することから始まります。次に、適切な相同性アームを担うDNA分子をエレクトロポレーションします。これらは、制限消化またはPCRによって生成された二本鎖DNA(dsDNA)、またはオリゴヌクレオチドなどの一本鎖DNA(ssDNA)である可能性があります。活性組換えタンパク質とともに相同配列が存在することで、所望の修飾を持つ新しいDNA分子の作成が可能になります。

組換え分子クローニング技術は、精密な遺伝子工学を可能にし、プラスミド、細菌染色体DNA、細菌人工染色体(BAC)への選択可能または選択不可能なマーカーの挿入など、さまざまな状況に適用されます。BAC は、アデノウイルスや HSV DNA などの大きなゲノム断片のクローニングに特に価値があり、ウイルスベクターの迅速な生産を可能にします。組換えは、トランスレーショナルアプリケーションを超えて、ウイルス遺伝子またはタンパク質ドメインの標的欠失、修飾、または置換を可能にすることで、基礎研究もサポートします。組換えにはいくつかの制限があります:短い相同性アームは、反復領域での組換えを妨げます。PCR増幅基質は、時折変異を導入することがあります。そして、ターゲット領域のシーケンスがわかっていなければなりません。

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プロトコル

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組換えの前提条件として、目的のBACゲノムを持つ熟練した細菌株(SW102など)が利用可能でなければなりません。組換えは、所望の修飾を受けたコロニーを濃縮するための非常に効率的な方法ですが、ここでは、第1ステップと第2ステップと呼ばれる2段階の組換え戦略について説明します(図1)。最初のステップでは、ポジティブおよびネガティブの両方の選択マーカーを含む発現カセットを目的の遺伝子座に挿入します。2番目のステップでは、このカセットは、最終ゲノムを目的とした実際の遺伝子組み換えに置き換えられます。この研究で使用された選択マーカーには、アンピシリン耐性 (AmpR)、ベータガラクトシダーゼ活性 (β-gal)、および sacB 遺伝子が含まれます。ただし、研究グループの特定のニーズに応じて、正の選択マーカーと陰の選択マーカーの任意の組み合わせを使用できます。

1. 選択カセットをターゲット領域に挿入します

  1. 0日目
    1. LB寒天+抗生物質(耐性遺伝子がBACにある(例えば、クロラムフェニコール12.5μg/mL)に目的のBACを含むSW102細胞をストリークします。32°Cのインキュベーターで一晩育てます。
      注:この段階での組換え遺伝子の誘導を防ぐために、32°C>温度は避けてください。
  2. 1日目
    1. PCRを実行して、AmpR/LacZ/SacB選択カセットを増幅します。3'末端に配列を含むフォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用して選択カセットをアニーリングおよび増幅し、5'末端に30〜80 bpを含むフォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用して、修飾するウイルスゲノム領域との相同性アームを表します(表1)。
      注:選択カセットとインサートは、専門のプロバイダーから合成構造として簡単に注文できます。ただし、望ましくない組換えイベントを防ぐために、BAC(制御BAC遺伝子)内またはウイルスゲノム内に重複したプロモーター、ターミネーター、またはその他の遺伝的要素が存在しないように注意する必要があります。
    2. アガロースゲル電気泳動(AmpR/LacZ/SacBカセットが3,400 bpであるため、1%アガロースゲルを実行)によってPCRフラグメントの同一性と純度を確認し、260/230および260/280の値が純粋な核酸と一致していることを確認します。
    3. 午後に、単一のSW102コロニーを5mLのLBに接種し、32°Cで一晩インキュベートします。
  3. 2日目
    1. 一晩培養物1〜2 mLを新鮮な100 mLのLBに接種します。細菌を0.55〜0.7のOD600 に増殖させ、指数関数的な段階を見逃さないようにOD600 を定期的に測定します。
    2. 誘導のために42°Cまでのウォーターバスを準備し、洗浄のために4°C~250 mLの滅菌ddH2Oまで冷却します。
    3. 培養物が目的のODに達したら、50 mLを清潔な円錐形のチューブに移し、42°Cのウォーターバスで15分間インキュベートします。非誘導陰性対照を含めます。
      注:このステップはラムダレッドタンパク質を誘導します。
    4. チューブを氷に10分間放置し、4°Cで3,200 × g で5分間遠心分離します(42°C誘導と非誘導の両方)。
    5. 上清を廃棄し、40 mLの氷冷滅菌ddH2Oを加え、ペレットを再懸濁します(42°C誘導と非誘導の両方)。
    6. 再度8分間遠心分離し(ステップ1.3.4を参照)、洗浄ステップ(ステップ1.3.5)と遠心分離を繰り返します。上清が水のように透明になるまで(濁りや懸濁液がなくなるまで)、洗浄ステップを繰り返します(2〜4回洗浄)。
    7. 最後の遠心分離後、上清を廃棄し、ペレットを200 μLの氷冷滅菌ddH2O(42°C誘導と非誘導の両方)に再懸濁します。
    8. 再懸濁したペレット(50 μLのHSV-1および25 μLのアデノ)のアリコートを予冷した1.5 mLチューブ(42°C誘導および非誘導の両方)に移します。50〜400 ngの精製PCR産物を加えます(5μLを超えないでください)。チューブを渦巻き、氷上で5分間インキュベートします。
    9. 前のステップの混合物を予冷キュベットに移し、2.50 kV(2,500 V、0.2 cmキュベット)でエレクトロポレートします(42°C誘導と非誘導キュベットの両方)。
    10. エレクトロポレーション後、細菌を1 mLのLBで32°Cで1.5時間回収させます。 キュベットに1mLのLBを加えて洗浄し、すべてを集めます。
    11. LB寒天培地+アンピシリン(100μg/mL)、X-Gal(20μg/mL)、IPTG(0.5 mM)に異なる量の細菌(10、50、200 μL)を散布し、32°Cで一晩(ON)増殖させます。
    12. AMP / X-Gal(ステップ1.3.11と同じ濃度)を含むプレートとスクロース5を含むプレートを調製します。
  4. 3日目
    注:この時点で、コロニーが成長し、青色に見えることが予想されますが、細菌を42°Cで誘導し、選択カセットを含むインサートでエレクトロポレーションしたプレートのみです。これが確立されたら、一部のコロニーで選択カセットの完全性を検証する必要があります。
    1. コロニーが<50であるONのプレートを特定して、2つ以上のコロニーのピッキングを回避します。いくつかのコロニー(通常、少なくとも1つの適切なコロニーを同定するには8〜10で十分です)を選択し、約50 μLのH2Oで希釈します。50 μLのH2Oに単一の青色のコロニーを接種し、ネガティブ(LB寒天/スクロース/クロラムフェニコール)とポジティブ(LB寒天/アンピシリン/クロラムフェニコール/X-Gal/IPTG)の両方の選択プレート(ステップ1.1.2および1.3.11と同じ濃度)にストリークします(図2)。
      注:50 μLが広がったプレート上に20〜100個のコロニーが見つかると予想されます。ただし、コロニーの数が少ない場合、必ずしも組換えが損なわれるわけではありません。
    2. ステップ1.4.1の水を5mLのLBに接種し、プレートとLB培養物を32°Cで一晩インキュベートします(図2)。
  5. 4日目
    1. Amp/X-Galプレートで増殖し、スクロースプレートでは増殖しなかった青色のコロニーのみを選択します(図3)。これらの陽性クローン(表2)については、一晩培養の500 μLアリコートを50 mLの新鮮なLBに移します。
  6. 5日目
    1. 陽性クローンごとに、グリセロールスタブを調製し、BACプラスミド(midiprep)を抽出して単離します。
    2. BAC抽出後、品質管理を実行して、組換えが正しく行われたかどうかを確認します。挿入部位のサンガーシーケンシングを行います。すべてが正しいと思われる場合は、2 番目のセクションに進みます。

2. 選択カセットを希望の変更に交換します

  1. 0日目
    1. LB寒天にポジティブクローンをストリークします。32°Cで一晩インキュベートします。
  2. 1日目
    1. PCRを実行して、挿入/修飾を増幅します。3'末端に配列を含むフォワードおよびリバースプライマーを使用して選択カセットをアニールおよび増幅し、5'末端にステップ1.3.1で使用したのと同じ30〜80 bp相同性アームを使用します(表1)。
    2. アガロースゲル電気泳動により、PCRフラグメントの同一性と純度、および260/230および260/280の値が純粋な核酸と一致していることを確認します。
    3. 1つのコロニーを5mLのLBに接種し、32°Cで一晩インキュベートします。
  3. 2日目
    1. 2 mLの一晩培養物を100 mLのLBに移し、OD600 が0.55〜0.7に達するまで32°Cで増殖させます(~2.5〜3時間)。誘導のために42°Cまでのウォーターバスを準備し、洗浄のために4°C~250 mLの滅菌ddH2Oまで冷却します。
    2. 目的のODに達したら、50 mLの培養物を円錐形のチューブに移し、42°Cのウォーターバスで15分間インキュベートして、λ-ファージ組換えタンパク質を誘導します。非誘導コントロールとして、別の50 mLチューブを32°Cに保ちます。
    3. 熱誘導後、チューブを氷の上に10分間置きます。
    4. 4°Cで3,200 × g で8分間遠心分離します(42°C誘導と非誘導の両方)。
      注:この時点から、SW102細胞のコンピテンシーを維持するために氷上で作業します。
    5. 上清を取り除き、ペレットを40 mLの予冷水で穏やかに旋回させて再懸濁します。
    6. 0〜4°Cで3,200× g で5分間遠心分離します。
    7. 洗浄手順(手順2.3.5)を1回繰り返します。
    8. 上清を取り除き、ペレットを100 μLの水に穏やかに再懸濁します。
    9. 再懸濁したペレット(HSV-1 50 μLおよびアデノ25 μL)のアリコートを予冷した1.5 mLチューブ(42°C誘導チューブと非誘導チューブの両方)に移します。50〜400 ngの精製PCR産物を加えます(5 μLを超えないようにしてください)。チューブを回転させ、氷上で5分間インキュベートします。
    10. 前のステップの混合物を予冷キュベットに移し、2.50 kV(42°C誘導と非誘導の両方)でエレクトロポレートします。
    11. 細胞を5 mLのLB培地で32°Cで4〜5時間振とうしながら回収させます。
      注:カセット交換後の残留SacBタンパク質の分解を可能にするために、回復時間は最初の組換えステップよりも長くなります。
    12. スクロース、X-Gal、およびIPTG(ステップ1.1.2および1.3.11と同じ濃度)を含むLB寒天培地ペトリ皿に異なる量(50、200、500 μL)の培養物をプレートします。32°Cで一晩インキュベートします。
  4. 3日目
    1. かなりの数のコロニー(20〜100)をスクリーニングして、目的の修飾を担うフラグメントおよび選択カセットとの組換えに成功した陽性クローンを同定する可能性を高めます。コロニーPCRを使用して第1レベルのスクリーニングを実施します。グリッド付きのシャーレを使用します。特定の象限からコロニーを選択し、ラベルを付けます(図4)。
      注:特に効果的なアプローチは、一方のプライマーが標的領域(ウイルスゲノム上)の外側でアニーリングし、もう一方が組み換えられたフラグメント内でアニーリングする一対のプライマーを使用することです(図5)。
    2. アガロースゲル(1.5%)でPCRアンプリコンの存在とサイズを確認します。
    3. 正しい象限からポジティブクローンを選択し、100 mLのLBに接種します。32°Cで一晩インキュベートします。
  5. 4日目:
    1. midiprepを実行して、細菌培養物からプラスミドを抽出します。
    2. 制限酵素でプラスミドを消化し、アガロースゲルを流して消化パターンを分析します。
    3. 消化パターンが正しい場合は、ウイルスゲノムの修飾領域の配列決定を進めます。
    4. 組換えクローンの分子同一性を確認した後、ウイルス粒子のトランスフェクションとレスキューに進みます。

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結果

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IL12をコードする腫瘍溶解性ヘルペスウイルスの生成
この研究の導入セクションで概説されているように、組換えの潜在的な応用の1つは、免疫治療の可能性を高めることを目的として、腫瘍溶解性ウイルスのゲノムに免疫賦生導入遺伝子を挿入することです。以下に、HSV-1に基づく腫瘍溶解ベクターを用いたそのような応用例を示します。具体的には、この研究では、HSV-1ゲノムのUs1-Us2領域内の遺伝子間遺伝子座への導入遺伝子挿入の影響を調査します。実際、ウイルスゲノム内の挿入はウイルスの機能に有害であることが判明し、複製欠陥を引き起こし、in vivoの抗腫瘍効果と製造収量の両方を損なう可能性があります。このような問題により、最終的には製造プロセスが臨床開発要件と互換性がなくなる可能性があります。本研究では、構成的真核生物プロモーター(増強型CMV)と、それに続く短い5'非翻訳領域(UTR)、マウスIL-12のコード配列、ポリアデニル化シグナル(BGH)を含む発現カセットを挿入することを目的とした。

IL-12 の選択は、抗腫瘍活性を持つさまざまな免疫細胞...

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ディスカッション

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この「RECOMBINEERING」(相同RECOMBInationを介した遺伝的エンジニアリング)プロトコルは、2段階の戦略を使用します:1つ目は、選択カセットを目的のゲノム遺伝子座に統合し、2つ目は、このカセットを目的の修飾に置き換えます(図1)。

使用される選択マーカーには、アンピシリン耐性(AmpR)、ベータガラクトシダーゼ(β-gal)、およびsacBが含まれます。AmpRは抗生物質耐性に基づく選択を可能にし、β-galは青/白スクリーニングを可能にし、sacBは逆選択のためのスクロース感受性を付与します。カセットを統合するコロニーは、誘導プレート上で青色に見えます。非誘導コントロールの成長は、低品質の材料を示唆しています。続行する前に、すべてのマーカーの機能を検証する必要があります。

2番目のステップでは、sacB発現により、スクロースプレート上の逆選択が可能になります。コロニーは、sac...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者には、開示すべき関連する金銭的または非金銭的利益はありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、PRIN 2022-MUR Italy、Grant 20224NCSN5 (PreMeRetHOn) によって支援されました。POR Campania: piattaforma per lo sviluppo di nuove tecnologie vaccinali.PNRR CN3 RNA技術に基づく国立遺伝子治療・医薬品センターPNRR PE13 新興感染症に対するアンメットニーズに対処するワンヘルスの基礎的およびトランスレーショナルリサーチ活動。著者らは、カスタムDNAを提供してくれたGeneart合成サービスに感謝しています。著者らはまた、この研究の成功に貢献したミケーレ・ヴェネルーソ氏にも心からの感謝の意を表します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アンピシリン任意任意分子グレード
オリゴが増幅するために Il-12: CTGGCTAGCGTTTAA
ACGGGCCCTCTAGACTCG
AGCGGCCGCACGCCACCA
TGTGTCCTCAGAAGCTAACC		任意任意HPLC精製
オリゴからAmplofy AmpR/LacZ/SacB へ;カセット: CTGGCTAGCGTTTAAA
CGGGCCCTCTAGACTCGAG
CGGCCGCACGCCACCACC
CCTATTTGTTTTTTTC		任意任意HPLC精製
IPTGの任意任意分子グレード
LB寒天培地
LBミディアム
Phusion ホットスタート II 高忠実度 DNA ポリメラーゼ サーモサイエンティフィックF549S
Il12を増幅するリフレボオリゴ:GGCAACTAGAAGGCA
CAGTCGAGGCTGATCAGC
GGTTTAAACTTAAGCTTTC
AGGCGGAGCTCAGATAG 		任意任意HPLC精製
Rev oligo から amplofy AmpR/LacZ/SacB カセット: GGCAACTAGAAGGCAC
AGTCGAGGCTGATCAGC
GGTTTAAACTTAAGCTTT
TATTTGTTAACTGTTAATTG 		任意任意HPLC精製
SacB/AmpR/LacZ選択カセットこの原稿--
蔗糖任意任意分子グレード
SW102 と BAC-HSV-1 または BAC-Advこの原稿--
トリプトン任意任意分子グレード
ウィザードSVジェルプロメガA9281
エックスギャル任意任意分子グレード
酵母エキス任意任意分子グレード

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers (Basel). 12 (11), 3407(2020).
  2. Froechlich, G., et al. The common H232 STING allele shows impaired activities in DNA sensing, susceptibility to viral infection, and in monocyte cell function, while the HAQ variant possesses wild-type properties. Sci Rep. 13 (1), 19541(2023).
  3. Sasso, E., et al. New viral vectors for infectious diseases and cancer. Semin Immunol. 50 (1), 101430(2020).
  4. Ma, C. C., Wang, Z. L., Xu, T., He, Z. Y., Wei, Y. Q. The approved gene therapy drugs worldwide: from 1998 to 2019. Biotechnol Adv. 40 (3-4), 107502(2020).
  5. Sasso, E., et al. Replicative conditioning of herpes simplex type 1 virus by survivin promoter, combined to ERBB2 retargeting, improves tumour cell-restricted oncolysis. Sci Rep. 10 (1), 4307(2020).
  6. Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. Int J Mol Sci. 22 (2), 477(2021).
  7. De Lucia, M., et al. Retargeted and multi-cytokine-armed herpes virus is a potent cancer endovaccine for local and systemic anti-tumor treatment. Mol Ther Oncolytics. 19 (1), 253-264 (2020).
  8. Sasso, E., et al. One-step recovery of scFv clones from high-throughput sequencing-based screening of phage display libraries challenged to cells expressing native claudin-1. Biomed Res Int. 2015 (1), 703213(2015).
  9. Rusciano, G., Sasso, E., Capaccio, A., Zambrano, N., Sasso, A. Revealing membrane alteration in cells overexpressing CA IX and EGFR by surface-enhanced Raman scattering. Sci Rep. 9 (1), 1832(2019).
  10. Lin, D., Shen, Y., Liang, T. Oncolytic virotherapy: basic principles, recent advances and future directions. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 156(2023).
  11. Troise, F., et al. Prime and pull of T cell responses against cancer-exogenous antigens is effective against CPI-resistant tumors. Mol Ther Oncolytics. 32 (1), 200760(2024).
  12. Shalhout, S. Z., Miller, D. M., Emerick, K. S., Kaufman, H. L. Therapy with oncolytic viruses: progress and challenges. Nat Rev Clin Oncol. 20 (3), 160-177 (2023).
  13. Sasso, E., et al. Massive parallel screening of phage libraries for the generation of repertoires of human immunomodulatory monoclonal antibodies. MAbs. 10 (7), 1060-1072 (2018).
  14. Vetrei, C., et al. Novel combinations of human immunomodulatory mAbs lacking cardiotoxic effects for therapy of TNBC. Cancers (Basel). 14 (1), 121(2021).
  15. Zambrano, N., et al. High-throughput monoclonal antibody discovery from phage libraries: challenging the current preclinical pipeline to keep the pace with the increasing mAb demand. Cancers (Basel). 14 (5), 1325(2022).
  16. Froechlich, G., Sasso, E. We ARE boosting translation: AU-rich elements for enhanced therapeutic mRNA translation. Mol Ther Nucleic Acids. 36 (2), 102531(2025).
  17. Gentile, C., et al. Generation of a retargeted oncolytic herpes virus encoding adenosine deaminase for tumor adenosine clearance. Int J Mol Sci. 22 (24), 13521(2021).
  18. Finizio, A., et al. Integrating system biology and intratumor gene therapy by trans-complementing the appropriate co-stimulatory molecule as payload in oncolytic herpes virus. Cancer Gene Ther. 31 (9), 1335-1343 (2024).
  19. Tripodi, L., et al. Systems biology approaches for the improvement of oncolytic virus-based immunotherapies. Cancers (Basel). 15 (4), 1297(2023).
  20. Wang, H., et al. Cytokine-armed oncolytic herpes simplex viruses: a game-changer in cancer immunotherapy. J Immunother Cancer. 12 (5), e008025(2024).
  21. D'Alise, A. M., et al. Adenovirus encoded adjuvant (AdEnA) anti-CTLA-4, a novel strategy to improve adenovirus based vaccines against infectious diseases and cancer. Front Immunol. 14 (1), 1156714(2023).
  22. Wold, W. S., Toth, K. Adenovirus vectors for gene therapy, vaccination and cancer gene therapy. Curr Gene Ther. 13 (6), 421-433 (2013).
  23. Goins, W. F., Huang, S., Cohen, J. B., Glorioso, J. C. Engineering HSV-1 vectors for gene therapy. Methods Mol Biol. 1144 (1), 63-79 (2014).
  24. De Chiara, A., et al. Peptide nucleic acid-mediated circularization of target RNA as tool to inhibit translation. Int J Biol Macromol. 308 (1), 142230(2025).
  25. Wang, L., Chen, Y., Liu, X., Li, Z., Dai, X. The application of CRISPR/Cas9 technology for cancer immunotherapy: current status and problems. Front Oncol. 11 (1), 704999(2022).
  26. Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G., Court, D. L. Recombineering: a homologous recombination-based method of genetic engineering. Nat Protoc. 4 (2), 206-223 (2009).
  27. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33 (4), e36(2005).
  28. Zhang, W., et al. High-throughput cloning and characterization of emerging adenovirus types 70, 73, 74, and 75. Int J Mol Sci. 21 (17), 6370(2020).

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