MALDIアプローチ による 細菌プロテオミクスプロファイリングを用いた酪農の微生物安全性の評価

サマリー

このプロトコルは、カルチュロミクスとMALDI-TOF MSを組み合わせることで、乳製品中の微生物組成を迅速かつ費用対効果の高い評価を可能にします。従来の培養法よりも短いターンアラウンドタイムで、16S rRNAシーケンシングに匹敵する分類結果を提供します。

要約

我々は、プロテオミクスアプローチ、最新のカルチュロミクス、および食品安全品質管理ラボに迅速として組み込むことができるさまざまなサンプル調製手順を使用して、さまざまな乳製品(バター、モッツァレラチーズ、牛乳、クリーム)中の微生物の存在を監視するためのマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析法(MALDI-TOF MS、以下「MS」という)同定法を使用したプロトコルを提示します。 微生物の安全性を監視するための信頼性が高く堅牢なツール。これには、微生物の単離ステップ、増殖コロニーの選択、サンプル調製手順(インタクト細胞、オンスポットおよびチューブ内抽出)、MS分析パラメータの設定、MSスペクトル(タンパク質フィンガープリント)の生成と収集、そして最後にMSプラットフォームを使用した分類法の取得、その後のデータの解釈と視覚化が含まれます。この方法は、多数の研究によって検証されており、市販の生化学検査システムと比較して、牛乳からの微生物をより信頼性が高く、コスト効率よく同定できます。これは食品微生物学における有望な進歩として際立っており、シンプルなプロトコルと分析時間の大幅な短縮を通じて研究室の多様な要件を満たします。提示されたプロトコルは、製造プロセスに適した適切なターンアラウンドタイム(TAT)で信頼性の高い微生物同定を提供することにより、食品業界のニーズに対応します。

概要

このプロトコルの全体的な目標は、細菌プロテオミクスプロファイリングにMSを使用することにより、バター、チーズ、牛乳、クリームなどのさまざまな乳製品の微生物安全性を監視するための包括的な方法論を提供することです。最新のカルチュロミクスと最適化されたサンプル前処理手順を組み合わせたこのアプローチは、食品安全および品質管理ラボにとって、迅速で信頼性が高く、堅牢なツールとなることを目的としています。この方法論の作成と適用の背後にある理論的根拠は、標準的な微生物同定方法の限界から来ています。長年にわたり、獣医および食品診断研究所は、鑑別培地で細菌の増殖と代謝を調べ、その後さまざまな酵素アッセイを行う従来の生化学検査に依存してきました¹。これらの方法は、多くの場合、BergeyのManual of Determinative Bacteriologyなどの標準的なガイドラインに基づいており、比較的安価で、定量的および定性的データの両方を生成できますが、手間と時間がかかり、広範な培地調製、サンプル希釈、プレーティング、インキュベーション、コロニーカウント、単離、および詳細な特性評価ステップ^2,3を必要とします。

Analytical Profile Index (API)、BBL Crystal、Vitek、Biolog MicroPlates などの商用半自動および自動システムの導入により、生化学的アッセイを使用した微生物同定が合理化され、コストと納期が削減されました。ただし、これらのシステムには、再現性が低い、それぞれのデータベースにエントリがないこと、特に非発酵性細菌またはわずかな生化学的差異を持つ種内の株の場合、株間の表現型の変動を決定することが困難であるなど、いくつかの欠点があり、不正確なin vitro結果につながる可能性があります⁴.これを考慮して、MS は強力な代替手段として進化しており、現在臨床微生物学で一般的であり、獣医診断および牛乳品質研究所で注目を集めています。このアプローチは、いくつかの微生物を検出する際の速度、精度、および費用対効果によって補完されています¹。多くの研究により、MS は牛乳からの微生物をより確実に同定し、市販の生化学検査システムよりも迅速かつ安価な結果が得られることが実証されています ^5,6,7。属レベルまたはグループレベルの同定には生化学的検査で十分な場合がありますが、種レベルの診断には、多くの場合、MS や 16S rRNA シーケンシングなどのより高度な方法が必要になります⁸。実際、MSは、食品微生物分離株を柔軟かつ信頼性の高い同定するための有望なプラットフォームと考えられており、そのシンプルなプロトコルと分析時間の大幅な短縮を通じて食品微生物学研究所の多様な要件を満たし、それによって食品の安全性が強化されます^4,5。試薬の消費量が少ないため運用コストは最小限に抑えられ、サンプル処理により自動化と高スループットが可能になります⁸。ただし、この方法の有用性は、選択された微生物の増殖条件(培地の種類を含む)と参照データベースの種のカバレッジに本質的に依存しており、これらはその有用性を制限する重要な要因として認識されていることに注意する必要があります。

MS は、食中毒病原性乳酸菌 (LAB)、およびその他の発酵細菌を同定および区別することにより、食品微生物学において重要な役割を果たします⁹。その有用性は現代のカルチュロミクスにまで及び、培地で増殖したすべての微生物コロニーの同定を可能にし、コロニー形成ユニット(CFU^)情報の取得を容易にします7。このアプローチは、ヒトの腸に存在する、糖尿病性足感染症に関与する、または尿路に関連するような複雑な微生物群集の発見にすでに成功しており、微生物学的実践における培養依存的な方法を活性化しています^10,11。

このプロトコルは、乳製品の微生物安全性の日常的な評価のためのMSを効果的に実装するためのラボをガイドするために提示され、製造プロセスに適した実用的なターンアラウンドタイム(TAT)内で信頼性の高い微生物同定を求める業界のニーズに応えます。プロトコルは、(1)適切な培地(de Man、RogosaおよびSharpe寒天-MRS寒天、M-17寒天、万能Tween 80寒天-APT寒天、中国ブルーラクトース寒天-CBL寒天、ミルクプレートカウント寒天-MPCA、トリプシン大豆寒天-TSA)およびカスタマイズされたインキュベーション条件;(2) MS 分析のための標準化されたサンプル前処理手順により、さまざまな細菌の種類や実験室のワークフローに対応するために、直接コロニー移送、オンターゲットギ酸抽出、チューブ内エタノール/ギ酸タンパク質抽出などのオプションを提供します。(3)機器のキャリブレーション、最適なスペクトル取得パラメータの定義、および信頼性の高い分類学的割り当てのためのスコア値評価と一貫性チェックを含むデータ解釈のガイドラインを含む体系的なMS分析。このプロトコルは、構造化され検証済みのアプローチを提供することで、乳製品業界における微生物モニタリングの精度と効率を高め、最終的には食品の品質と公衆衛生の向上に貢献することを目的としています。

プロトコル

この研究で使用された試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1. 乳製品関連細菌の分離

1. 液体または固体乳製品からの細菌培養物の取得
   1. 培地の選択
      1. 乳製品サンプルからの細菌分離には、一般的な増殖培地、グラム陰性菌、乳酸菌(LAB)、胞子形成細菌、成長の遅い微生物や気難しい微生物など、予想される微生物グループに従って培地を選択します。
         注:優性種と希少種の両方の回収率を最大化するには、複数の培地を並行して接種する必要があります。乳製品サンプルからのマイクロバイオーム分析用の培地の例のセットを 表1に示します。
   2. 接種とメッキ
      1. 乳製品の代表的なサンプルを入手し、よく混合します。
      2. サンプル1 mL(液体サンプル:牛乳、クリーム、バターミルク)または1 g(固体サンプル:チーズ、バター)を、9 mLの滅菌液体培地(ペプトン水/0.85%NaCl溶液)を含む15 mLコニカル遠心分離管に無菌移送します。固体サンプルの場合は、サンプルを追加する前に液体培地を40〜42°Cに温めます。
      3. 30〜60秒間激しくボルテックスしてサンプルを均質化します。脂肪または硬いサンプルの場合は、均一な懸濁液が得られるまで均質化を続けます。
      4. 1 mLの懸濁液を取り、9 mLの滅菌溶液を含む連続したチューブに移すことにより、一連の10倍希釈液を調製します。各希釈液をよく混ぜます。
         注:サンプルの種類と予想される微生物汚染レベルに応じて、^10-1 から^10-6の範囲の希釈液を調製します。ほとんどのサンプルでは、10^〜3 までの希釈で十分です。ただし、フレッシュミルクやブルーチーズを分析する場合は、さらに希釈液を準備する必要があります。正確な分離とコロニー選択の容易さを確保するために、最適な接種希釈は、プレートあたり30〜300コロニーを与える必要があります。この範囲により、個々のコロニーを明確に区別でき、重複増殖のリスクが最小限に抑えられ、後の分析のために汚染されていない均質な細菌培養物の取得が容易になります。一部の加工乳製品(バターミルクなど)では、希釈されていない新鮮なサンプル(0.1 mLなど)を直接プレーティングに使用する場合があります。
      5. 0.1 mLのサンプルまたはその希釈液を取り、適切な寒天培地を含む事前に調製したペトリ皿の表面に移します。
      6. 滅菌スプレッダーを使用して、接種物を寒天表面に均一に広げます。接種物を培地に15分間吸収させてから、プレートを反転させます。
   3. 潜伏
      1. 好気性インキュベーション:調査したすべてのサンプルについて、APT、M-17、CBL、MPCA、およびTSA寒天プレートを接種し、37°Cおよび30°Cの好気性条件下で24時間インキュベートします。インキュベーション温度は、乳製品の衛生品質(一般的な中温菌の場合は30°C)と公衆衛生上の安全性(ヒト関連病原体および指標生物の場合は37°C)の両方を評価するために重要な、さまざまな微生物グループの最適な増殖要件に基づいて決定されました。
         注:胞子形成細菌の集中的な増殖が予想される場合、TSAの場合、より短い(~12時間)インキュベーション時間が好ましい。
      2. 嫌気性インキュベーション:調査したすべてのサンプルについて、MRS寒天プレートを接種し、37°Cおよび30°Cの嫌気性条件下で24〜72時間インキュベートし、微生物の増殖を毎日チェックします。インキュベーション温度は、ステップ3.1で述べたように決定されました。
         注:嫌気性インキュベーション条件は、酸素を除去し、嫌気性細菌の増殖に適した雰囲気を提供する嫌気性雰囲気発生小袋の入った密閉容器にプレートを入れることによって達成できます。
   4. 純粋な培養物の取得
      1. インキュベーション後、プレートを検査し、形態学的特徴(サイズ、形状、色、質感など)に基づいて成長した単一コロニーを選択します。
      2. 1 μLの微生物ループと同じインキュベーション条件を使用して、同じ寒天培地に継代培養(ストリーキング)することにより、選択したコロニーを精製します。

培地	アプリケーション	培養条件
トリプシン大豆寒天培地(TSA)	幅広い細菌を培養するための一般的な培地	30〜37°C、24〜48時間、好気性
血液寒天培地(BLA、羊の血液5%を含む)	溶血の分化、連鎖球菌、リステリア菌、桿菌に有用	30〜37°C、24〜48時間、好気性
MRS寒天(デマン、ロゴサ、シャープ寒天)	Lactobacillusおよびその他のLABに選択的L. casei、L. delbrueckii、L. helveticus、またはL. acidophilusの増殖をサポートするために、1%のTween-80を追加します。	30°C、48〜72時間、嫌気性または微好気性
M17寒天	Lactococcus、Streptococcus thermophilusに選択的	30°C、48〜72時間、嫌気性または微好気性
APT寒天(万能トゥイーン80寒天)	LABおよび一部のビフィズス菌に対して選択的	30°C、48〜72時間、嫌気性または微好気性
Scheadler寒天	ビフィズス菌、クロストリジウムを含む嫌気性菌の選択的および濃縮、単離	30〜37°C、48〜72時間、嫌気性
CBL寒天(チャイナブルーラクトース寒天)	差動培地, 大腸菌群および他の乳糖発酵菌用	37°C、24〜48時間、好気性
乳板数寒天培地 (MPCA)	普遍的、好気性中温性細菌の総数	30〜37°C、24〜48時間、好気性

表1:特定の培養条件での乳製品サンプルのマイクロバイオーム分析に推奨される培地のリスト。

2. MS分析のための細菌サンプルの調製

1. 開始する前に、MALDIマトリックス溶液を準備します
   注:最も一般的に使用されるマトリックス化合物は、HCCA、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸です。この化合物は感光性であるため、マトリックスを調製して暗い容器または光から離して保管してください。
   1. 50% アセトニトリル (HPLC グレード)、47.5% 水 (HPLC グレード)、および 2.5% トリフルオロ酢酸 (TFA) の割合を使用して溶媒混合物を調製します。
   2. マトリックスを溶媒混合物に溶解して、最終濃度約10 mg / mLにします(または飽和まで-未溶解の結晶が見えるまで)。
   3. 溶液が透明でない場合(結晶が残っている)、溶液を遠心分離またはろ過して(たとえば、0.22 μmのシリンジフィルターを介して)、透明な液体を取得します。
      注意: 冷蔵庫での保管は、霜取りサイクルの数が少ない場合、短期間許可されます。
2. MSを使用して細菌を同定するには、次の3つのサンプル前処理手順のいずれかを使用します。
   1. 直接コロニー移植 - ほとんどのグラム陰性菌など、よく成長し、溶解抵抗性のない細菌を扱う場合は、この最も簡単で最速の方法を使用します。
      1. 滅菌ループまたはつまようじを使用して、少量(~1 μL)の増殖コロニーをMALDIプレート上のスポットに移します。
      2. 細菌物質をMALDIターゲットプレートの指定されたスポットに直接塗抹して、薄く均一な層を作成します。
      3. 乾燥したら、スポットに1 μLのHCCAマトリックス溶液を重ね、室温で自然乾燥させます。
   2. オンターゲットギ酸抽出 - 細胞壁により追加の処理なしでタンパク質を放出することが困難な同定が困難な細菌(グラム陽性菌、酵母など)に使用します。
      1. 使い捨ての微生物ループまたは滅菌つまようじを使用して、単一の細菌コロニーから少量の細菌バイオマスを拾います。
      2. 細菌物質をMALDIターゲットプレートの指定されたスポットに直接塗抹して、薄く均一な層を作成します。
      3. 塗抹した細菌物質に1 μLの70%ギ酸溶液を重ね、室温で自然乾燥させます。
      4. 乾燥したら、スポットに1 μLのHCCAマトリックス溶液を重ね、室温で自然乾燥させます。
   3. チューブ内タンパク質抽出(エタノール/ギ酸法) - この方法は、一部のグラム陽性菌、酵母、マイコバクテリアなど、同定が困難な微生物に使用します。
      1. 滅菌ループまたは綿棒を使用して、寒天培養プレートから300 μLの滅菌水を含む1.5 mLマイクロ遠心チューブに1〜3個の完全なコロニーを移します。
      2. 900 μL の無水エタノールを加えて、最終的なエタノール濃度を約 75% に調整します。数秒間混合または渦巻きします。
      3. サンプルを15,000 x g (室温)で2分間遠心分離します。
      4. 細胞ペレットを乱さずに上清を慎重に廃棄します。
         注:粘液株の場合、4°Cで追加の遠心分離をお勧めします。
      5. すべての残留エタノールが蒸発するまでペレットチューブを開いたままにします(5〜10分、室温)。
      6. 乾燥細胞ペレットに20〜50 μLの70%ギ酸(FA)を加えます。ペレットが完全に再懸濁されるまでピペッティングまたはボルテックスで混合します。
         注:体積は生物学的材料の量に比例する必要があります。
      7. ギ酸懸濁液に等量のアセトニトリル(ACN)を加えます。慎重に混ぜます。
      8. 15,000 x g で 2 分間 (室温) 遠心分離します。
      9. 1 μLの上清をMALDIターゲットプレート上の指定されたスポットに移します。
      10. スポットを室温で完全に自然乾燥させます。
      11. 乾燥したサンプルスポットに1 μLのα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸(HCCA)マトリックス溶液を重ねます。
      12. MS分析の前に、マトリックスを室温で完全に自然乾燥させます(図1)。
          注:70%ギ酸:腐食性;火傷を引き起こします。ドラフトで扱います。アセトニトリル:可燃性で有毒です。炎に近づけ、吸入/接触を避けてください。トリフルオロ酢酸 (TFA): 強く、腐食性があり、揮発性です。皮膚/目の接触や吸入を避けてください。常に白衣、耐薬品性手袋、安全ゴーグルを着用してください。吸入を避けるために、すべての試薬をヒュームフード内で取り扱ってください。皮膚や目の接触を避けてください。裸火から離れて作業してください。酸性および有機溶剤廃棄物は、適切に廃棄するために、明確にラベル付けされた互換性のある容器に収集します。

図1:MS技術 による 細菌分離株の同定に適切なサンプル前処理手順を選択するプロセスを視覚化した決定木。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. MS技術によるスペクトル取得と微生物同定

1. キャリブレーション
   注:MSで正確な質量を決定するには、未知のサンプルを分析する前に、適切な標準を使用して機器を校正してください。信頼性の高い識別には、適切な機器校正が不可欠です。
   1. 1 μLを含むMALDIターゲットプレート上のキャリブレータースポットを調製します:(a)大 腸菌 DH5アルファの抽出物を含む細菌試験標準(BTS)、3.6〜17 kDaの質量範囲をカバー(MBT Biotyperの場合)。(b)大 腸菌 ATCC 25922タンパク質抽出物、リボヌクレアーゼ、およびミオグロビンを含む微生物キャリブレーターで、質量範囲は3.6〜17 kDa(EXS2600システムの場合)。サンプル前処理と同様に、乾燥させたキャリブレータースポットを1 μLのHCCAマトリックス溶液で自然乾燥させます。
   2. 調製したサンプルとキャリブラントスポットを含むMALDIターゲットプレートを装置にロードします。キャリブレーションモード(自動)を使用してキャリブレーションスポットの解析を実行します。
   3. 校正を検証して、質量精度が指定された質量範囲(100〜20 kDa)にわたって許容範囲内(20 ppm)内にあることを確認します。
2. スペクトルの取得
   注:機器が校正されると、調製された各サンプルスポットからの質量スペクトルが取得されます。
   1. 一般的な取得パラメータ
      1. 質量分析計を線形正イオンモードで操作します。
      2. 質量検出範囲を2,000-20,000 m/z(2-20 kDa)に設定します。
   2. 次の機器固有の設定を使用します
      1. イオン源電圧:20kVでイオン源1(IS1)、18kVでイオン源2(IS2)、9kVでレンズ電圧。加速電圧は最大25kVです。
      2. 検出器電圧:約2.65kVに設定。
      3. パルスイオン抽出設定:100 ns、遅延抽出時間は230 nsに固定されています。
      4. レーザー出力設定:手動で調整して、(信号の数と信号強度を考慮して)最高のスペクトル品質を得るため、通常は最小必要な出力の40%〜65%の範囲です。
      5. スペクトルあたりのショット数:各スポットの異なる領域から十分な数のレーザーショットを取得して、良好な信号対雑音比(S/N)の合計スペクトルを生成します→(a)各スポットの4つの異なる領域から50ショットステップで撮影された平均200ショット、または(b)500ショットステップで取得 - AutoXecuteモードを使用してターゲットスポットの10の異なる位置から50ショット。
   3. サンプル測定戦略
      1. アイソレートごとに複数のスポットを測定します(アイソレートごとに少なくとも2つのスポット)。
      2. 各スポットのスペクトルを繰り返して取得し、結果の一貫性と精度を確保し、サンプルごとに一定数の総スペクトル(サンプルあたり少なくとも→回の技術的反復)を目指して、結果の一貫性と精度を確保し→二重で測定します。
         注:生物学的複製を取得するために、生物学的サンプル(少なくとも3つ)を対象とします。

4. 微生物の同定とデータ分析

注:生物の同定は、得られたタンパク質プロファイル(微生物の特定のタンパク質「フィンガープリント」)を参照データベースと比較することによって行われ、結果として生じるシグナル位置と強度の両方の相関関係を使用して、研究対象の生物が対応する参照微生物と一致した信頼レベルを記述する一致値を生成します。処理されたスペクトルを参照データベースと比較することにより、微生物を識別します。

1. スペクトル処理
   1. スペクトル処理には、(a)MALDI Biotyperシステム用のflexAnalysis、またはEXS2600システム用のEX-Accuspecなど、適切なソフトウェアを使用してください。
   2. 平滑化アルゴリズムとして Savitzky-Golay 法を適用します (幅 2 m/z、10 サイクル)。
   3. TopHatアルゴリズム(S/Nしきい値= 2、TopHatフィルター幅0.2 Da)を使用してバックグラウンドノイズを除去するためのベースライン補正を実行します。
   4. ピーク検出アルゴリズムとして重心モードを使用します(S/Nしきい値= 2)。
2. データベースの比較とスコアの解釈
   1. 未知の分離株の処理された質量スペクトルを、微生物同定のMALDIプラットフォームにアップロードします。その後、識別を実行します。
      注:これらの研究では、Biotyperバージョン4.1.100、Ex-AccuspecバージョンV1のソフトウェアが使用されました。MALDI Biotyperソフトウェアの場合、最高のマッチング信頼性を確保するために、生のスペクトルからメインスペクトル(MSP)を作成することをお勧めします。
   2. メーカーの標準しきい値に従って識別結果を評価します。
      注:MALDI BiotyperおよびEXS2600の場合、スコア値は次のとおりです。
      2.300-3.000:可能性が高い種の同定。
      2.000-2.299:安全な属の同定、推定種の同定。
      1.700-1.999:属の同定の可能性。
      0.000-1.699:信頼できる識別ではありません。
      MALDI Biotyperプラットフォームから導き出された同定結果の評価中に、一貫性カテゴリを使用した調査結果:A-種の一貫性→最良の一致であり、同様に高いスコア値(>1.999)を持つ他のすべての一致は同じ種を指します。B-属一貫性のあるベストマッチ→および同様のスコア値(1.700〜1.999)を持つ他の一致は、同じ属を指しますが、種レベルで異なる場合があります。C-種または属レベルの一貫性に関する一貫性→要件が満たされていません。

結果

カルチュロミックアプローチ
培養学的アプローチは、とりわけ、希少種、培養が困難な種、またはこれまで記載されていなかった種を分離する可能性を高めるために、微生物培養の条件を最大限に多様化することを目的とした戦略です¹²。これにより、食品サンプルなど、さまざまなサンプルに存在する微生物叢の生物多様性のより広範な全体像を得ることができます。微生物の多様性の増加は、形態、色、サイズ、および成長速度が異なるコロニーの視覚的評価の段階ですでに観察でき、これは適用された培養物学的アプローチの有効性を反映しています(図2)。

ディスカッション

乳製品の微生物同定に特化したプロトコルは、速度、信頼性、費用対効果に関する最適なコンセンサスを確保することで、従来の方法に比べて重要な進歩をもたらします。それにもかかわらず、プロトコル内のいくつかの重要なステップには細心の注意が必要です。まず、分離と培養の段階が基礎となります。培地とインキュベーション条件は、予想される微生物の多様性と負荷と一致する必要があります。純粋な培養物を得ることが最も重要であり、この段階でのコロニーの分離が不十分であいまいまたは汚染されると、同定があいまいまたは誤った場合があるため、MS同定を混乱させる混合プロファイルを避けるために継代培養が必要になる^{ことがよくあります4。}

第二に、MS分析のためのサンプル前処理は、スペクトル品質の重要な決定要因です。このプロトコルでは、直接コロニー移植、オンターゲット抽出、およびチューブ内タンパク質抽出の 3 つの標準的な方法の概要が説明されています。直接移植は最も簡単ですが、すべての微生物、特に細胞壁が厚い...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
70%の蟻酸	チェンプール	115676307
アセトニ トリル	メルク KGaA	1.00014.1011
APT寒天	メルク KGaA	1.10453.0500
細菌検査基準	ブルーカー・ダルトニック有限会社	8255343
CBLアガー(チャイナブルーラクトースアガー)	メルク KGaA	1.02348.0500
コロンビア・ブラッドの寒天;	オキソイド	CM0331B
M17寒天
ミルクプレートカウントアガー(MPCA)	オキソイド	CM0681
MRS寒天(デ・マン、ロゴサ、シャープ・アガー)	メルク KGaA	1.10660.0500
MSP 96はBCの研磨鋼をターゲットにしています	ブルーカー・ダルトニック有限会社	8280800
ペプトン水	シグマ・オルドリッチ	70179
シェードラー寒天	シグマ・オルドリッチ	91019
羊の血	バイオマキシマ	SL0160-100
トリフルオロ酢酸	シグマ・オルドリッチ	T6508
トリプティック大豆寒天(TSA)	シグマ・オルドリッチ	22091
水	メルク KGaA	1.15333.2500
&α;-シアノ-4-ヒドロキシシンナミ酸	ブルーカー・ダルトニック有限会社	8201344