研究記事

土壌の健康と生物活性に対する廃棄物由来バイオ炭の評価

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DOI:

10.3791/68994

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2025年10月10日

 ,  , 
1Department of Applied Ecology, Faculty of Environmental Sciences, Czech University of Life Sciences Prague

この記事について

サマリー

ここでは、コーヒーかす、使用済みホップ、トウヒの木、タバコの吸い殻から排出される廃棄物由来のバイオ炭が土壌の健康に及ぼす影響を評価し、微生物の活動、植物の成長、および潜在的な無脊椎動物の生態毒性を評価します。

要約

バイオ炭は、バイオマスを高温で熱分解して加熱して得られる生成物で、保水性、pH、栄養素の利用可能性などの土壌特性を改善する可能性から、一般的な土壌改良剤として浮上している。しかし、特定の廃棄物から調製されたバイオ炭は、土壌生物相に生態毒性学的に悪影響を与える可能性があります。この研究の全体的な目的は、微生物の活動、植物の成長、潜在的な生態毒性に焦点を当てて、コーヒーかすり、使用済みホップ、トウヒの木、タバコの吸い殻に由来する選択されたバイオ炭が土壌の健康に及ぼす影響を評価することでした。バイオ炭で改良した土壌を合計15日間インキュベートし、デヒドロゲナーゼ活性、細菌定量、シナピス・アルバの種子を用いた植物毒性バイオアッセイ、エンチトラウス・アルビドゥスを用いた生態毒性試験など、一連のアッセイを実施した。バイオ炭の改良剤は土壌のpHを変化させ、保水に影響を与える可能性がある。たばこと吸い殻のバイオ炭は細菌コロニーの刺激が最も高く、対照反復では8.47×104 CFU/mLと比較して、カウントは最大1.00 × 106 CFU/mLに達しましたが、コーヒーかすバイオ炭はデヒドロゲナーゼ活性(3.53 × 10-3 mU/g)を高め、より高い微生物代謝能力を示唆しました。植物毒性試験では、ホップ(162.96%)とトウヒ材バイオ炭(206.66%)によって植物の生育が促進されたのに対し、タバコ吸い殻バイオ炭の施用率が高いほど苗の成長が抑制された(62.36%阻害)ことが示された。Enchytraeus albidusを用いた生態毒性試験では、タバコの吸い殻バイオ炭(33%刺激)を除くすべてのバイオ炭が有害な影響を及ぼすことが示された。この研究の結果は、土壌の健康に対するバイオ炭の影響は供給源に依存しており、土壌管理に重要な意味があることを浮き彫りにしています。この研究は、土壌システムへの潜在的な危険を最小限に抑えながら、その利点を最大化するために、濃度と種類に基づいてバイオ炭の施用を調整する必要性を明らかにしました。

概要

近年、バイオ炭は農業1に応用される多機能で環境に優しい土壌改良剤として、また地球温暖化を緩和する手段として浮上しています2。世界が土地の劣化、作物の生産性の低下、炭素排出量の増加に取り組む中、バイオ炭は従来の肥料3や炭素隔離アプローチ4に代わるグリーンな代替品として浮上しています。合成肥料とは対照的に、バイオ炭は本質的に土壌の肥沃度を高め5、栄養素の損失を減らし6、保水力を高める7ため、土壌が劣化した地域や肥沃度の低い地域で非常に有用である。さらに、バイオ炭は、有機物の分解と栄養循環に重要な有益な土壌微生物に安定した生息地と炭素源を提供することにより、微生物の機能を強化します8。

バイオ炭は農業以外にも、農業残渣、森林残渣、食品廃棄物などのバイオマス残渣を長期炭素材料に変換するため、廃棄物処理のためのグリーンソリューションとしても機能します9。これにより、廃棄物の蓄積が制限されるだけでなく、二酸化炭素 (CO2) またはメタン (CH4) として逃げる炭素を回収することで温室効果ガスを相殺します。炭素隔離の他のメカニズムと比較して、バイオ炭は大気中のCO2を緩和し、健康な土壌と高収量をサポートする長期的で統合された土壌戦略を提供します10。

土壌肥沃度の向上、保水能力、微生物刺激特性などの利点が認められているにもかかわらず、土壌生物相に対する潜在的な生態毒性学的影響に関する懸念が続いています11。バイオ炭は一般に微生物の活動と多様性にプラスですが、特定の原料や加工条件では、土壌微生物とその生態学的機能に害を及ぼす有毒化合物を生成する可能性があります12。

バイオ炭の潜在的なリスクを評価するには、生態毒性学的評価が必要です。細菌(分解者)、植物(生産者)、無脊椎動物(消費者)は、土壌と堆積物の生態毒性の研究で使用される分類学的グループの1つです。これらの分類群は、陸生環境と水生環境の両方を表します13。

土壌生態系機能におけるミミズとのエンチトレイドの相補的な機能は、これらの生物のバイオアッセイの開発の基礎です。バイオアッセイでは、エンチトレイドは、農薬(ジメトエート、アトラジン、カルベンダジムなど)や微量金属(鉛、亜鉛、銅、カドミウムなど)などの化学物質の影響を調査するための陸生生物学的モデルとして機能します14。

生物ベースのアッセイに加えて、微生物の酵素活性も土壌の健康状態を評価する方法です。土壌デヒドロゲナーゼ活性は、微生物の酸化活性の指標です15。土壌とバイオ炭の混合物中のデヒドロゲナーゼ試験は、微生物の活動と土壌全体の健康状態を定量化するのに効果的です。デヒドロゲナーゼ酵素は微生物の呼吸に関与しているため、その活性は土壌の生物学的に活性を反映しています。これは、土壌の質、肥沃度、バイオ炭が微生物に及ぼす影響を評価するのに役立ちます。このアッセイでは、塩化トリフェニルテトラゾリウム(TTC)からトリフェニルホルマザン(TPF)への還元を測定し、分光光度法で測定します。TPFの生産量が多いほど、微生物の活動が高いことを示す指標です。

さまざまな原料から生産されたバイオ炭は、土壌の健康に独特の影響を与えると予想しています。これらの影響は、土壌の物理化学的パラメータを変化させ、微生物の活動、植物の成長、土壌生物の毒性に影響を与える可能性のある化学的および物理的特性に依存します。

この研究では、pH、微生物活動、植物の成長、無脊椎動物の生存率など、複数の土壌健康指標に対する廃棄物由来のバイオ炭の影響を評価します(図1)。4つの異なる廃棄物由来のバイオ炭の3つの濃度(1%、5%、10%w / w)を庭の土壌に混合し、上記の影響を評価しました。水分含有量、pH、および試験生物の選択は、研究の生態学的関連性を確保するために慎重に管理されました。

プロトコル

1. バイオ炭の調製

注:ここで試験材料として使用されるバイオ炭の詳細については、材料表を参照してください。熱分解条件、元素組成、および近接分析データは、生産者から提供されました(表1)。

注意: 熱分解は、常に適切な排気またはヒュームシステムを備えた換気の良いラボで行ってください。耐熱手袋、白衣、安全ゴーグルを着用し、必要に応じてフェイスシールドを着用してください。

表1:試験したバイオ炭の基本特性。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

2. バイオ炭の化学的特性評価

  1. マイクロ波支援分解後の濃度に基づいて、すべてのバイオ炭の元素組成を分析します(誘導結合プラズマ原子発光分光法(ICP OES)または誘導結合プラズマ質量分析(ICP MS)を使用して、濃度に基づいて実行します(表2)。

3. 土壌とバイオ炭の混合物の調製

  1. 土壌の収集と実験のセットアップ
    1. 実験場から表土を採取します。
    2. 表面の破片を手動で取り除きます。土を5mm未満の粒子サイズにふるいにかけ、破片を取り除きます。
    3. ふるいにかけた土100gを重さを量り、試験容器に加えます。
  2. バイオ炭の改良とインキュベーション
    1. 土壌100gあたり、各バイオ炭タイプを1g、5g、または10g添加して、1%、5%、および10%(w / wベース)の土壌バイオ炭改良剤を作成します。
    2. 蒸留水を加えて、最大保水能力(WHC)の60%に達します。
    3. へらを使ってよく混ぜます。
    4. 各容器の重量を量り、パラフィルムで覆い、蒸発を最小限に抑えます。
    5. 混合物を27°Cで10日間インキュベートします。
      注:この混合物は、水分損失測定、pH変化、植物毒性、および細菌定量アッセイに使用されます。
      使用済みの土壌は、地域のバイオソリッドプロトコルに従って収集および廃棄する必要があります。

4. 土壌とバイオ炭の混合物のpH測定

  1. 各土壌とバイオ炭の混合物10 gを50 mLの円錐形チューブに秤量します。
  2. チューブに25mLの蒸留水を加えます。
  3. チューブを手動で30秒間振るか、ボルテックスミキサーを中速で使用します。Whatman No.1ろ紙を使用して混合物を清潔な100 mLビーカーにろ過します。
  4. 校正済みのpHメーターを使用して、室温(20〜25°C)で濾液のpHを測定します。

5. Enchytraeus albidus 毒性試験

  1. 経済協力開発機構 (OECD) 2016、テスト番号 22016 に従ってテストを実施します。
  2. 試験用の土壌の準備
    1. このテストにはOECD人工土壌を使用します。
    2. セクション4で説明した手順に従って土壌のpHを測定します。
    3. 分析グレードの炭酸カルシウム(CaCO3)を土壌に徐々に添加し、完全に混合することにより、pH 6.0±0.5に調整します。
    4. 蒸留水または脱イオン水を加えて、水分含有量を最大WHCの40〜60%に調整します。
      注:一貫性を手作業で確認します。土壌は湿っている必要がありますが、塊状ではありません。
  3. ワームの順応と選択
    1. ワームを蒸留水で優しくすすぎ、輸送用生理食塩水を取り除きます。
    2. ワームを準備したOECD土壌に入れ、6,000ルクスで16時間の光/8時間の暗サイクル下で20°Cで24時間順応させます。
    3. クリテルムの存在に基づいて実体顕微鏡を使用して、セットアップごとに15匹の健康な成虫を選択します。
  4. テストのセットアップとインキュベーション
    1. 準備したOECD土壌100gと各バイオ炭タイプ5gを清潔な容器に入れて混合します。
    2. 100 gの未修正のOECD土壌を使用して対照を準備します。
    3. pHと水分含有量が必要な範囲(pH - 6.0 ± 0.5、水分含有量 - 最大WHCの40〜60%)にあることを確認します。
    4. 先端が柔らかい鉗子を使用して、各テストおよびコントロール容器に15匹の成虫を導入します。
    5. 細かく挽いた圧延オーツ麦を25mgを土壌表面の食料源として加えます。
    6. 空気交換を可能にするために、穴あきアルミホイルで容器を覆います。
    7. 容器を20°Cで5日間、6,000ルクスで16時間の光/8時間の暗サイクル下でインキュベートします。
    8. 容器の重量を毎日計量し、適切な量の蒸留水または脱イオン水を加えて減量を補い、一定の水分含有量を維持します。
    9. ワームの活動を監視し、テスト中に目に見える死亡率を記録します。
    10. テスト終了後、次の式を使用して致死効果(%)を計算します。
      figure-protocol-1
      どこ：
      Wi - テスト開始時の初期ワーム数
      Wf - テスト終了時の最終ワーム数
      注:テストを有効にするには、コントロールセットアップでの成人死亡率がテストの終了時に20%を超えてはなりません。
    11. 試験後、試験土壌を105°Cで乾燥させて不活化し、局所的なバイオソリッドプロトコルに従って廃棄します。

6. 植物毒性試験

  1. 国際標準化機構 (ISO) 18763:201617 に従ってテストを実施します。
  2. シャーレのセットアップ
    1. インキュベートした土壌とバイオ炭の混合物20 gを9 cmのきれいなペトリ皿に加えます。清潔なヘラを使用して表面をそっと平らにします。
    2. バイオ炭濃度ごとに3回の反復を調製し、2つの未修正のコントロールを含めます。
  3. 種の植え付けと孵化
    1. 10個の シナピスアルバ の種を各皿に等間隔で土の表面に置きます。
      注:種子を土に押し込まないでください。湿気で自然に固まらせます。
    2. 皿に蓋をして、直射日光を当たらさずに25°C±2°Cのインキュベーターに5日間入れます。
    3. インキュベーション後、プラスチック定規を使用して、種子の端から根の端までの根の長さを測定します。cmまたはmmで報告してください。種子がひび割れたばかりの場合は、0.1cmまたは1mmと記載してください。
    4. 次の式を使用して阻害効果(%)を計算します。
      figure-protocol-2
      どこ：
      RLc - 対照皿の種子の平均根長
      RLt - 試験皿内の種子の平均根長
      注:テストを有効にするには、対照の種子の発芽が少なくとも80%(10個の種子のうち8個が発芽)であることを確認することが重要です。

7. 細菌コロニーの定量化

  1. 土壌の懸濁と希釈
    1. インキュベートした各土壌とバイオ炭の混合物5 gを50 mLの滅菌コニカルチューブに秤量します。
    2. 25 mLの滅菌蒸留水を加え、30秒間よく振とうします。
    3. 懸濁液を室温で2時間均質化させます。
    4. 滅菌ガーゼまたはメッシュを使用して懸濁液をろ過し、この原液を使用して連続希釈液を調製します。
    5. それぞれ9mLの滅菌蒸留水を含む5本の試験管を準備します。
    6. 滅菌ピペットを使用して10倍の連続希釈を実行します(たとえば、ストック溶液から1 mLを最初のチューブ= 10-1に移し、次に1 mLを次のチューブ= 10-2に移すなど)。
    7. めっきには10〜2の希釈液を使用してください。
  2. コロニーのメッキとカウント
    1. 0.2 mLの10-2 希釈液を滅菌栄養寒天プレートにピペットでかけます。
    2. 滅菌済みスプレッダーを使用してサンプルを均一に広げます。
    3. プレートを27°Cの逆位置で24時間インキュベートします。
    4. コロニーカウンターを使用してコロニーをカウントします。
    5. 次の式を使用して、混合物のコロニー形成単位(CFU)mL-1 を計算します。
      figure-protocol-3
      注: 可能であれば、バイオセーフティキャビネットの下で作業してください。汚染を避けるために、サンプル間のツールを火炎滅菌します。
      廃棄する前に、すべてのプレートを70%エタノールまたはオートクレーブで消毒してください。

8. 乾物(DM)の測定

注意: 熱いボウルを取り扱うときは、耐熱手袋を使用してください。

  1. 耐熱ガラスまたは磁器のボウルに土10gを重さを量ります。
  2. ボウルを105°Cに予熱した乾燥オーブンに入れ、2時間乾燥させます。
  3. 乾燥後、ボウルをデシケーターに移し、空気からの水分の吸収を防ぐために10分間冷まします。
  4. 分析天びんを使用して、冷却したボウルを再度計量します。
  5. 精度を確保するために、少なくとも3つのサンプルに対して手順を繰り返します。
  6. 次の式を使用して乾物 (DM) 含有量を計算します。
    figure-protocol-4
    どこ：
    DM - 乾物含有量(%)
    Md - 乾燥サンプル重量(g)
    Mw - 未乾燥(元の)サンプル重量(g)

9. デヒドロゲナーゼ活性(DHA)試験

  1. 標準プロトコル(ISO 23753-1:2019)に従ってテストを実施します18。
  2. 試薬調製
    1. TRIS緩衝液(100 mmol / L、pH 7.6)。
      1. 12.12 gのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(TRIS)を800 mLの蒸留水に溶解します。
      2. 1 M塩酸(HCl)を使用してpHを7.6に調整します。
      3. 蒸留水で総量を1Lに調整します。
      4. 4°Cで保存し、1週間以内に使用してください。
    2. TTC基板溶液(300mmol/L)
      1. 調製したトリス緩衝液10mLにTTC1gを溶解する。
      2. 4°Cの暗所で保存し、1週間以内に使用してください。
    3. 検量線用のTPF標準溶液を調製します。
      1. 100 mgのTPFを10 mLの96%エタノールに加え、完全に溶解するまで撹拌してTPFストック溶液(33 mmol / L)を得る。
      2. 調製したTPFストック溶液0.5 mLを50 mLのエタノールで希釈して、TPF作業溶液(330 nmol / mL)を取得します。
      3. 作業溶液から0、0.1、0.2、0.5、および1.0 mLの作業標準を調製し、エタノールで希釈して最終容量3 mLにします。
      4. 485 nm で吸光度を測定して、検量線を生成します。
  3. サンプル前処理
    1. 各土壌とバイオ炭の混合物5 gを50 mLの円錐形チューブに加えます。
    2. 4 mLのTrisバッファー(100 mmol/L、pH 7.6)と1 mLのTTC溶液をテストセットアップに加えます。
    3. 4 mLのTrisバッファーのみをコントロールセットアップに追加します。
    4. 穏やかな反転によってチューブを手動で混合し、暗闇の中で25°Cで6時間インキュベートします。
  4. ホルマザンの抽出
    1. インキュベーション後、各チューブに25 mLのエタノールを加えます。
    2. サンプルを暗所で1時間(250 min-1、25°C)オービタル撹拌下に置きます。
    3. 撹拌後、1 mLのTTCをコントロールチューブに加えます。
    4. すべてのチューブを2,000 × g で25°Cで5分間遠心分離し、上清を分離します。
  5. 測定と計算
    1. 上清をきれいなキュベットに移します。
    2. 分光光度計を使用して485nmの吸光度を読み取ります。
    3. 検量線を使用して、サンプル中のTPFの濃度(nmol/L)を測定します。
    4. 次の式を使用してデヒドロゲナーゼ活性を計算します。
      figure-protocol-5
      どこ：
      A - 乾燥土壌のmU g-1 (またはnmol min-1 g-1)における酵素活性
      Cs - 試験サンプル中のTPF濃度(nmol mL-1)
      Cb - nmol mL-1 単位の対照サンプル中の TPF 濃度
      V - 総反応量(基質、緩衝液、エタノールの量の合計、mL)
      RT - 分単位の反応持続時間
      M - チューブあたりの土壌質量 (g)
      DM - 土壌の乾物含有量 (%)
      注:TTCとTPFは突然変異原の可能性があるため、手袋をはめて取り扱ってください。エタノールベースの試薬を調製するときは、ヒュームフードを使用してください。
      試験後、エタノールおよびTTC含有廃棄物は、指定された化学廃棄物容器に廃棄してください。

figure-protocol-6
図1:実験ワークフローの概略図。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

結果

化学的特性評価
バイオ炭は元素組成に有意差を示しました(表2)。カルシウム(Ca)とカリウム(K)は、タバコの吸い殻と使用済みホップのバイオ炭で最も高かった。トウヒ材のバイオ炭には、アルミニウム(Al)と鉄(Fe)が最も多く含まれていました。銅(Cu)とマグネシウム(Mg)は、使用済みホップバイオ炭に強く豊富に含まれています。鉛(Pb)、カドミウム(Cd)、およびその他の微量金属は、すべてのサンプルに少量存在していました。

表2:バイオ炭の化学組成。 研究で使用されたさまざまなバイオ炭の主な元素含有量。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

潜伏期間にわたるpHの変動
すべての処理において、土壌とバイオ炭の混合物のpHは時間の経過とともにわずかに上昇する傾向がありました(図2)。タバコの吸い殻バイオ炭との混合物では、10% w/w で最高の pH 値が記録され、15 日目に 9.48 に達しました。この治療は、時間の経過とともに最大の増加を示しました。コーヒーかすバイオ炭も徐々に増加し、15日目には10%w/wで最大pHが8.94になりました。ホップバイオ炭はpHを16.57%上昇させ、10%w/wで最大9.20上昇した。対照的に、トウヒと木材のバイオ炭混合物は、10% w/w で pH 8.56 に達しました。対照は、経時変化が最小限で、6.57から7.66の範囲で最も低いpHを示しました。

figure-results-1
図2:土壌とバイオ炭の混合物の経時的なpH変化。 0日目、10日目、15日目に、バイオ炭改良ごとに1%、5%、および10%w/wで測定された土壌pH。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

保水と減量
すべての種類のバイオ炭の保水能力は、バイオ炭を使用しない対照土壌よりも低かった(図3)。対照は15日間で体重の3.67%を失い、最も高い水分保持を示しています。バイオ炭の中で、たばこ吸い殻処理は水分損失が最も少なく、インキュベーションに比べて5.89%減少したため、バイオ炭の中で最も保持力が高かった。ホップバイオ炭でも同様の、より中程度のパターンが観察されました(総重量減少は9.22%、濃度が高いほど損失が大きくなります)。コーヒーかすバイオ炭は最大の重量減少(最大16.56%)を示し、保水率が最も低いことを示しています。トウヒと木材の混合物は平均10.22%減少しました。

figure-results-2
図3:インキュベーション中の土壌とバイオ炭の混合物の重量減少。 すべてのバイオ炭と濃度について、15日間にわたる保水の指標としての重量変化。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

E.アルビダス 毒性および繁殖試験
の繁殖 E. albidus 5% w/w バイオ炭での顕著な原料依存性を示しました。OECD土壌管理では、人口は15人から24人に増加しました(60%増加、 図4)。トウヒ材のバイオ炭はわずか7人の生存者をもたらしました(53%の阻害、 図5)。ホップとコーヒーかすのバイオ炭は、それぞれ12人の生存者をもたらしました(20%の阻害、 図5)。タバコの吸い殻バイオ炭は繁殖を33%刺激し、子孫を含む合計20匹のワームが繁殖しました。

figure-results-3
図4:の正味個體群変化 E . albidus バイオ炭処理土壌中。 最初と最後のワームは5日後にカウントされます。各バイオ炭の5%w/w濃度を試験した。データは平均±標準偏差(n = 3)を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-4
図5:E.アルビドゥスに対する毒性または刺激効果。対照と比較したワームに対する正味の効果。正の値は抑制を示します。負の値は刺激を示します。データは平均±標準偏差を表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

薬害
根の伸長 S. alba 1%、5%、および10% w / wで10日間のインキュベーション後に測定されました(図6)。未改良の土壌では、平均根の長さは237mmでした。1% w/w のコーヒーかすバイオ炭は 79.16% の刺激を生成しました。高濃度は阻害を引き起こし、5% w/w で最大 47.08% に達しました。トウヒ材のバイオ炭は、すべての濃度で成長を刺激し、10% w/wで206.66%でピークに達しました。タバコの吸い殻バイオ炭は、1% w/w で 41.01% の刺激をもたらしましたが、5% と 10% w/w で成長を阻害し、10% w/w で 62.36% の阻害に達しました。ホップバイオ炭は、すべての速度で成長を刺激しました(それぞれ38.97%、31.75%、162.96%、1%、1%、w/wで5%)。

figure-results-5
図6:シナピスアルバに対する植物毒性の影響。すべてのバイオ炭処理における10日間の成長後の対照に対する根の成長阻害または刺激。正の値は抑制を示します。負の値は刺激を示します。データは平均±標準偏差(n = 3)を表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

細菌コロニーの定量化
細菌コロニー数は10日後に評価されました(図7)。対照は平均 8.47 × 104 CFU/mL でした。コーヒーバイオ炭は、1% w/w で 7.33 ×10 4 CFU/mL を生成し、5% w/w でそれぞれ 1.18 × 105 および 1.50 × 105 CFU/mL に増加しました。トウヒ材のバイオ炭は、1% w/w で 1.97 × 105 CFU/mL を生成し、5% および 10% w/w で 9.73 × 104 および 4.93 × 104 CFU/mL に減少しました。タバコの吸い殻バイオ炭は、1% w/w で 5.40 × 104 CFU/mL を生成し、10% w/w (1.00 × 106 CFU/mL) で最高の刺激を生成しました。ホップバイオ炭はすべての濃度でわずかな刺激を示し、5% w/w で 1.07 × 105 CFU/mL でピークに達しました。

figure-results-6
図7:バイオ炭で処理した土壌中の細菌の増殖。 すべての処理と濃度について、10日間のインキュベーション後の細菌CFU/mL。比較のためにコントロールが含まれています。データは平均±標準偏差(n = 3)を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

デヒドロゲナーゼ活性
コーヒーかすバイオ炭は、濃度全体で最高のデヒドロゲナーゼ活性を生成し、1% w/w(3.53 × 10-3 mU/g)でピークに達し、5%および10% w/w(2.38 × 10-3 および2.62 × 10-3 mU/g)で同等のままでした( 図8を参照)。ホップバイオ炭は、1% w/w(2.39 × 10-3 mU/g)で活性を高めましたが、5%(6.34 × 10-4 mU/g)で減少し、10% w/w(-8.30 × 10-4 mU/g)でマイナスになりました。タバコの吸い殻バイオ炭は、1% w/w(1.29 × 10-3 mU/g)で陽性であり、5%および10% w/wで-7.26×10-4 および-8.53×10-4 mU/gに減少しました。トウヒ材バイオ炭は、すべての濃度で陰性でした(1%および5% w/wで-5.53 × 10-4 および-5.19 ×10-4 mU/g、10% w/wで-3.11×10-4 mU/g)、対照よりも低いままでした。

figure-results-7
図8:バイオ炭で改良された土壌中のデヒドロゲナーゼ活性。 すべてのバイオ炭の種類と濃度にわたる微生物酵素活性。値は、バイオ炭を添加していない対照土壌に対する相対的な値です。正の値は対照と比較して酵素活性が高いことを示し、負の値は対照よりも酵素活性が低いことを示します。データは平均±標準偏差(n = 3)を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

結果の概要については、 表3 および 表4 を参照してください。

表3:土壌pHと保水に対するバイオ炭の影響。 初期および最終pH値、ΔpH、およびインキュベーション中の水分損失率を示します。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表4:生物学的効果とDHAの結果の概要。 すべての治療におけるワームの繁殖、植物毒性、微生物数、酵素活性に関する複合データ。 figure-results-8 は刺激を示し、 figure-results-9 は抑制を示します。DHAの結果では、正の値は対照と比較して酵素活性が高いことを示し、負の値は対照よりも酵素活性が低いことを示します。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

データの可用性:
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ディスカッション

土壌と使用済みコーヒーかすの混合物のバイオ炭は、pH 8.94 と高いアルカリ性を示し、以前に報告された pH 9.419 と一致しました。バイオ炭はまた、対照サンプルと比較して重量損失の最大の増加を示し、保湿能力が低いことを示していますが、これは表面積が少なく、水の吸着傾向を制限している可能性があります20,21。これらの物理的特性は、 E. albidus、ワームの生存と繁殖に20%の阻害を引き起こしました。

植物毒性試験では、S. alba は 1% w/w 濃度で 79.16% の刺激を示しましたが、より高い濃度 (5% w/w) では、バイオ炭は根の伸長を 47.08% 阻害しました。これは、コーヒーかすバイオ炭がラクトゥカ・サティバに及ぼす植物毒性作用がカルボン酸によって引き起こされたという報告22と一致している。さらに、研究によると、可溶性フェノール類とカルボン酸もオーキシン輸送を妨害し、その結果、植物毒性閾値が生じることが示されています23。

細菌コロニー数は、コーヒーバイオ炭濃度の増加(10%w/w濃度で1.50×10-5 CFU/mL)とともに増加し、このバイオ炭が培養可能な細菌に好ましい条件を提供したことを示しています。コーヒーバイオ炭はまた、最も高いDHA活性(3.53×10-3 mU / g)を示し、培養可能な微生物集団と栽培不可能な微生物集団の両方を刺激したことを示唆しています。これは、土壌酵素活性に対するコーヒーバイオ炭の有益な影響を観察した研究24 によってさらに裏付けられました。

ホップバイオ炭は土壌のアルカリ度の増加と中程度の平均体重減少(10%)を引き起こしました。植物毒性試験では、バイオ炭は、特に高濃度(162.96%刺激)で、根の伸長刺激に有益でした。微生物の活性に関しては、ホップバイオ炭は細菌数に顕著な変化を示さず(最大1.00×10-5 CFU/mL)、これは化学組成のバランスが原因である可能性があります。ホップバイオ炭には、細菌の酵素系を阻害するため微生物に有毒である可能性のある銅(Cu)が最も多く含まれていましたが25、カリウム(K)やリン(P)などの元素も高レベルで含まれており、苗木のクロロフィル合成を改善することで微生物の増殖をサポートするはずです26。DHA活性もこの中立的な効果を反映しており、生物学的影響が限定的で安定した反応を示している。

タバコの吸い殻のバイオ炭は、時間の経過とともに土壌のアルカリ度を増加させました(最大pH 9.48)。より高い熱分解温度(700°C)で製造されたため、細菌の増殖をサポートするアルカリ性のバイオ炭が得られた。この観察結果は、バイオ炭が土壌のpHを改善し、生息地の状態を改善することを報告した以前の研究27と一致しています。すべての処理の中で、タバコの吸い殻のバイオ炭は最も高い水分含有量(最大94%)を保持しており、これは E.albidus の生存と繁殖に対する刺激効果も説明できる可能性があります。高い保湿性は、700°Cでの微細構造の変化に関連しており、水膜を捕捉する微細孔を生成します28。刺激効果のもう一つの原因は、タバコの吸い殻のバイオ炭に含まれるカルシウム(Ca)、P、Kの含有量が高いためであり、これらはワームの生存と繁殖に有益な要素である。

微生物評価では、タバコの吸い殻のバイオ炭は、同じレベルの増加を示さなかったDHA活性とは異なり、高濃度で約1.00×10〜6 CFU/mLに達する最高の細菌刺激を示しました。この発見は、微生物群集全体ではなく、培養可能な細菌の選択的刺激を示唆しています。

土壌とトウヒの木のバイオ炭の混合物は、針葉樹由来のバイオ炭のpHが7.87であると報告した研究29でも、pHのわずかな上昇を引き起こしませんでした。その製造温度は、この研究で使用されたすべてのバイオ炭の中で最も低かった(600°C)。バイオ炭の保水能力は、極端な重量減少を示さなかったため、他の種類のバイオ炭に比べて中程度でした。

しかし、 Eisenia foetida の生存と繁殖の場合、トウヒの木のバイオ炭が最も高い毒性を示しました(致死効果53%)。考えられる原因の 1 つは、ミミズの腸内 pH 調節を妨げ、酸化ストレスを引き起こすため、ミミズにとって有毒であることが知られているアルミニウム (Al)、鉄 (Fe)、マンガン (Mn) などの元素のレベルの上昇である可能性があります30。同様の結果は、 農 薬の過剰使用による土壌中の重金属毒性によりバイオマスの大幅な減少に見舞われた研究でも報告されました31。

トウヒの木のバイオ炭は、植物毒性アッセイで最大の根の伸び刺激を引き起こしました(最大206%の刺激)。これは、ワームに対する感受性とは異なり、高濃度の金属が S. alba のような植物種にとって必須の微量栄養素として機能する可能性があることを示唆しています。このバイオ炭の低濃度は細菌コロニーを刺激しました。しかし、コロニー数は集中度が高まるにつれて減少しました。この効果は、低レベルのKおよびPおよび高い有毒元素含有量(Al、Fe、Mn)に対する細菌の感受性を示しています。この観察結果は、おそらく水素対炭素(H / C)比が低く、炭素が利用できなかったため、対照土壌よりも低かった測定されたDHA活性と一致しています32。これらの発見は、トウヒの木のバイオ炭が栄養素含有量が低いか、阻害化合物であるため、微生物の増殖をサポートしていないことを示唆しています。

バイオ炭は外部研究所から試験材料として入手され、異なる熱分解温度を含む各プロバイダーが日常的に適用する条件下で製造された。私たちの目標は、供給された代表的な廃棄物由来のバイオ炭を評価することであり、原料全体の温度の影響を分離することでした。したがって、この研究では、温度の影響を原料の影響から完全に切り離すことはできません。加熱速度、ガス雰囲気、滞留時間などの詳細な生産パラメータはサプライヤーから入手できませんでした。提供された温度と元素特性のみが報告されました( 表1 および 表2を参照)。

この研究の結果を考慮すると、ホップバイオ炭は中程度の環境副作用を伴う全体的にバランスの取れた効果を持っていたと結論付けることができます。あらゆる濃度で植物の成長をサポートし、適度なpH変化と保水能力を示し、さらに、他の試験バイオ炭と比較して土壌微生物やワームに劇的な影響を与えませんでした。

これらの結果は、悪影響を引き起こすことなく、土壌の質と植物の成長を実際に改善するために、土壌改良に適したバイオ炭の種類とその適切な濃度を選択することがいかに重要であるかを示しています。

熱分解温度やバイオ炭の散布速度など、プロトコルのいくつかのステップが、この研究の結果に顕著な影響を与えました。熱分解温度が高いほどバイオ炭のアルカリ度が高くなり、タバコの吸い殻のバイオ炭に見られるように、ワームの繁殖と細菌の増殖の刺激に影響を与えた。対照的に、熱分解温度が低いほどアルカリ性バイオ炭が少なくなり、トウヒ材バイオ炭の場合のように、ワーム毒性が最も高く、微生物活性が低下しました。施用量の影響は、バイオ炭の種類と試験した生物に依存していました。コーヒーかすのバイオ炭の濃度が低いと、根の伸長と高いDHA活性に刺激効果があり、タバコの吸い殻のバイオ炭が高濃度になると、培養可能な細菌の増殖が最も高くなります。

コロニー数の不一致などの一般的な問題を解決するために、研究方法に特定の調整が加えられました。これには、土壌懸濁液の2時間の均質化を可能にし、10-2 の連続希釈を使用して最適で同等のコロニー数を得ることが含まれます。さらに、OECD ガイドラインのテスト番号 220 は、エンチトラエイドワームに対するテスト化学物質の影響を評価するように設計されています。これは、距離探知試験でテストされたさまざまな化学物質濃度から導き出された致死濃度 50 (LC50) の計算を示唆しています。この研究の目的は、ワームの生存と繁殖に対する廃棄物由来のバイオ炭の全体的な毒性効果を評価することでした。したがって、致死効果は、テストの開始から終了までのワーム数の変化率によって決定され、致死効果%として報告されました。

このプロトコルは、実験室条件下および小規模(例えば、100 gサンプル)で再現可能です。ただし、土壌量を増やすためにスケールアップすると、結果に違いが生じる可能性があります。これは、土壌と使用済みバイオ炭を適切に機械的に混合し、一定の水分レベルを維持するための制御された灌漑システムによって制御できます。さらに、バイオ炭の効果は原料の種類と熱分解温度によって大きく変化しており、適用前に各材料を個別に特性評価する将来の研究が示唆されている。

このプロトコルは、pHや水分保持などの物理化学的パラメーターと、さまざまな種類のバイオ炭で土壌を改良することに対する生物学的反応の組み合わせを提供するという点で、他の土壌健康評価技術とは異なります。従来の微生物コロニー数とともに酵素活性分析を含めることで、培養不可能な微生物機能についての洞察が得られます。さらに、この研究は複数の濃度の異なるバイオ炭原料に基づいており、現実世界の土壌改良戦略に実際的な関連性が加わります。

将来の研究では、肥料、籾殻、下水汚泥などの追加の原料をテストして、土壌生態系への影響を比較する可能性があります。長期の圃場試験は、季節の影響や作物の収量の結果を評価するために適応させることもできます。この研究は、廃棄物由来のバイオ炭が土壌の健康に及ぼす原料および濃度依存の影響を示しています。特定のバイオ炭は微生物の活動と植物の成長を刺激しましたが、他のバイオ炭は土壌生物に抑制性または毒性反応を引き起こしました。適切なバイオ炭の種類と施用量を選択することは、土壌管理のリスクを最小限に抑えながら利益を最大化するために不可欠です。

開示事項

著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

提示された研究は、プロジェクト BIOCIRKL (登録番号。TN02000044)、2023年から2028年にかけて、チェコ復興計画とチェコ共和国技術庁が国家能力センタープログラム内で支援します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1,3,5- トリフェニルテトラゾリウム・フォルマザンシグマ・アルドリッヒ、チェコ共和国93145
2,3,5- トリフェニルテトラゾリウム塩化物 シグマ・アルドリッヒ、チェコ共和国T8877
オートクレーブ CertoClav クラシックチェルトクラフ、オーストリア8510174
炭酸カルシウムなど;シグマ・アルドリッヒ、チェコ共和国239216
遠心分離機 MPW-251MPW 医学機器、ポーランド10251
吸い殻のバイオチャードイツ・ホーエンハイム大学700度で生産され、注記;
コロニーカウンター CC-200コール・パーマー14212-04
<エム>エンチトラエウス・アルビドゥス <も>インバイタルアクアS.R.O.
エタノール ペンタ、チェコ共和国70390-11003
ホップバイオマスバイオチャーチェコ共和国科学アカデミー研究所650 & 70°Fで生産され、注記;
インキュベーターQセルPol-Lab、ポーランド
電子レンジアントン・パール、マルチウェーブPRO
ノートパソコン DELL Latitude 3510デル・プロダクツ、アイルランド
栄養土培養基 OXOID、チェコ共和国CM0003B
OECD土壌 マイクロバイオテスト、ベルギー
pHメーター WTW inoLab pH 7110 ザイルム・アナリティクス、ドイツ1AA112
シナピス・アルバの種子とnbsp;マイクロバイオテスト、ベルギー
分光光度計 M4 UV-可視分光器VWR76520-716
使い終わったコーヒーかすバイオチャーチェコ共和国科学アカデミー研究所650 & 70°Fで生産され、注記;
トウヒ材バイオチャーオレスニツェ、チェコ共和国600度&7度で生産;注記;
立体顕微鏡 MSZ5000-T-IL-TLA.Kruss Optronic、ドイツMSZ5000-T-IL-TL
トリス・ベース シグマ・アルドリッヒ、チェコ共和国252859
ビデオ接眼レンズ VOPC93 USB 2.0A.Kruss Optronic、ドイツ VOPC93
体重計 ケルン EMB ケルン、ドイツ

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