シングルセル質量分析メタボロミクス研究のためのサンプル前処理:細胞洗浄、急冷、乾燥、保管の組み合わせ

細胞間の不均一性は、特に疾患の進行、薬剤耐性、および細胞分化の文脈において、生物学的システムの基本原理として浮上しています^1,2。多細胞生物では、同じ微小環境内の遺伝的に同一の細胞でさえ、トランスクリプトーム³、プロテオミクス⁴、そして決定的にメタボロームレベル⁵の違いから生じる異なる表現型を示す可能性があります。単一細胞ゲノミクスとトランスクリプトミクスは過去10年間で大きな注目を集めてきましたが、単一細胞メタボロミクスは、代謝産物の固有の複雑さと急速なダイナミクスのために、比較的未発達のまま^です6。代謝産物は環境の手がかりに非常に敏感で、多様な化学構造と^極性7を持ち、小細胞体積⁸に低濃度で存在します。これらの特性により、個々の細胞からの信頼性の高い測定は分析上の課題となります。メタボロミクスは細胞のリアルタイムの機能状態の最も近いスナップショットを提供するため、細胞生理学と病理学のより深い理解には、単一細胞分解能でメタボロームを堅牢に研究する方法を進歩させることが不可欠です⁷。

従来のバルクメタボロミクス技術は、大きな細胞集団全体のシグナルを平均化し、細胞の不均一性を隠し、まれではあるが重要な代謝シグネチャを覆い隠す可能性があります。対照的に、単一細胞メタボロミクスは、個々の細胞レベルで独自の生化学的プロファイルを明らかにし、幹細胞の分化、薬物応答、疾患メカニズムなどのプロセスの研究に非常に貴重です6,9,10,11,12,13。マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)MSや二次イオン(SI)MSなどの質量分析(MS)ベースの方法は、この分野を進歩させましたが、複雑な調製、真空要件、破壊的イオン化などの課題に直面しており、生細胞分析を制限しています^9,14。特に、機器の最近の開発により、レーザー誘起位置イオン化(t-MALDI-2¹⁵)およびOrbitrap二次イオン質量分析(OrbiSIMS)^16,17と組み合わせた透過モードMALDIなどの最先端の技術がもたらされ、単一細胞および細胞内レベルでのラベルフリーの高解像度3D代謝イメージングが可能になり、優れた質量精度と空間分解能を提供しました。

アンビエントイオン化MSは、これらの問題に対処します。代表的なアンビエントSCMS技術には、ライブシングルセルビデオ質量分析(Video-MS)¹⁸、DESI¹⁹、およびnano-DESI²⁰が含まれます。その中で、シングルプローブSCMSは、デュアルキャピラリーシステム21,22,23,24を使用して、生細胞をリアルタイムで直接サンプリングしてイオン化する能力で際立っている技術の1つです。この技術は、高解像度のin situ代謝プロファイリングを可能にしながらサンプルの乱れを最小限に抑え、薬物の取り込みと細胞代謝^{への影響22、25、26、27、28、29、30}、環境応答^31、32、および代謝の不均一性³³の研究にうまく適用されています^。個々のセル間で34,35,36。

多くのアンビエントSCMS法は生細胞分析を可能にしますが、個々の細胞の選択に必要な手作業による処理のために、通常、スループットが低いことに悩まされます23,37,38。細胞代謝は非常に動的であるため、サンプル前処理を延長すると代謝物プロファイルが変化する可能性があります。これに対処するために、研究者は細胞を単離した直後に消光技術を適用します^39,40。クエンチは、急速冷却41,42,43,44または酵素変性43,45,46,47のいずれかによって代謝活動を停止し、特定の瞬間に細胞の生化学的状態を維持します。このステップは、正確で時間的に関連するメタボロミクス データを確保するために不可欠です。効果的な消光プロトコルは、細胞内代謝活動を迅速かつ徹底的に停止する必要があります。冷等張生理食塩水⁴⁸、冷却アセトニトリル⁴⁶、冷メタノール 44,47,48,49、氷冷リン酸緩衝液 (PBS)^43,50、LN₂ 43,44,51、さらには熱風処理⁵² など、さまざまな方法が評価されています.これらの多くはもともとバルクセルメタボロミクス用に開発されましたが、コールドメタノールやアセトニトリルなどの一部は、Pico-ESI-MS³⁹やMALDI-MS⁴⁶などの単一細胞技術に適応されています。それらの有効性にもかかわらず、各方法には欠点があります:有機溶媒は代謝産物の漏出と細胞膜の損傷を引き起こす可能性があり^48,53、不揮発性塩溶液はイオン抑制を引き起こし⁵⁴、感度を低下させ、データの精度を損なうことによりMSを妨害する可能性があります^47,55。

LN₂ スナップ凍結は、不揮発性塩を残さずに細胞代謝を急速に停止させ、SCMS に適しているため、生物学研究⁵⁶ で一般的に使用されています。ただし、細胞膜に損傷を与える可能性があり、SCMS^57,58 では問題があります。この損傷を軽減するために、いくつかの研究では、高速ろ過、低温NaCl洗浄、およびLN₂凍結を含む方法が使用され、代謝回転の速い代謝産物を保持するのに役立ちます^53,59。それでも、この方法は、個々の細胞を単離することが困難であり、塩残基からマトリックス効果が発生する可能性があるため、SCMSには理想的ではありません。-80°Cでの保存も一般的な保存方法ですが、単一細胞代謝産物プロファイルへの影響は不明のままです。細胞を最初に揮発性のMS適合AF溶液で洗浄し、次にLN₂で急冷し、真空凍結乾燥し、低温(-80°C)で保存するという複数の重要なステップを組み合わせることで、これらの制限に対処するための研究を以前に報告しました⁶⁰。現在のアプローチでは、細胞の損傷と代謝産物の分解が最小限に抑えられ、より正確な SCMS 測定が可能になります。この研究は実験の詳細に焦点を当てており、堅牢なSCMS技術へのこの細胞調製法の採用を促進することを目的としています。

認定されたクラスIIバイオセーフティラボと無菌条件下ですべてのステップを実行します。本研究では、HCT-116細胞株をモデルシステムとして用い、完全培地で細胞を培養しました。リージェントと使用される機器は 、材料表に記載されています。

1. 細胞培養

1. 完全な培地を準備します。McCoy's 5A培地に10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを補給します。37°Cに温めます。
2. 細胞を5%CO₂を含む加湿インキュベーターで37°Cでインキュベートします。コンフルエントを毎日監視し、培養物が~80%のコンフルエンシーに達したときに継代します。
3. 細胞を継代します(~2日ごと)。
   1. 培地を吸引し、5 mlの1x PBSで1回すすいでください。
   2. 2 mLの0.25%トリプシン-EDTAを培養皿に加え、細胞の剥離を促進するために37°Cで3分間インキュベートします。
   3. 予熱した完全培地8 mLを加え、穏やかにピペッティングして細胞を分散させることにより、トリプシンを中和します。
   4. 1 mLの懸濁液を9 mLの新鮮な完全培地に移します。
   5. 細胞を数えます。
      注:細胞は、製造元の指示に従ってTC20自動セルカウンターを使用してカウントされました。トリパンブルーやその他の染色剤は使用しませんでした。
4. カバーガラス上のシードセル。
   1. 細胞を~1 × 10⁶ 細胞/mLの最終濃度に希釈します。
   2. 個々の18 mmガラスカバーガラスを12ウェルプレートのウェルに入れます。
      注:ガラスカバーガラスは、細胞培養に使用する前にオートクレーブ滅菌する必要があります。
   3. 2 mLの完全培地と200 μLの細胞懸濁液(~2 × 10⁵ 細胞/ウェル)を加えます。
   4. 細胞を一晩インキュベートして、細胞の付着を可能にします。
      注:細胞が正常な増殖状態にあることを確認するには、細胞の形態とその増殖状態を定期的にチェックし(顕微鏡を使用)、潜在的なマイコプラズマ汚染を調べます(マイコプラズマ検出キットを使用)。

2. ギ酸アンモニウム(AF)溶液による細胞洗浄

注:毎回新鮮なAF溶液を準備してください。

1. AF洗浄バッファーを準備します。ギ酸アンモニウム 0.45 g を計量し、50 mL の LC/MS グレードの水に溶解します。ギ酸アンモニウムの最終濃度は0.14 M(0.9%w / w)です。
   注:使用するまで溶液を氷冷(0〜4°C)に保ちます。
2. 12ウェルプレートの各ウェルに2 mLの冷AF溶液を加えます。
3. カバーガラスをすすぎます。一対の滅菌鉗子を使用して、接着細胞を含む各カバーガラスをウェルからそっと持ち上げ、次に短時間(2〜3秒間)2 mLの冷たい0.9%ギ酸アンモニウム(AF)溶液で事前に充填された別のウェルに入れます。すすぎプロセスを繰り返します。
   注:洗浄ステップ中に細胞を乱さないように、細胞すすぎを非常に穏やかに行ってください。

3. 液体窒素によるセル消光(LN₂)

1. AFすすぎた各カバーガラス(セルが上を向いている)をアルミホイル容器内のペトリ皿に入れます。
   注: 極低温定格の手袋、安全ゴーグル、白衣を着用してください。すべてのLN₂ の取り扱いは、換気の良い場所で行ってください。アルミホイルは、LN₂ 焼入れ用の容器を折りたたむために使用できます。
2. カバーガラスの上に10〜20mLの液体窒素をゆっくりと注ぎ、完全に覆われるようにします。
3. すぐにピンセットでペトリ皿を傾けて、残っている液体窒素をデカントします。
   注意: 残留洗浄水分による大きな氷結晶の形成を防ぐために、このアクションを数秒以内に完了してください。

4. 真空中でのセル凍結乾燥

1. 解凍を防ぐために、LN₂ 焼入れ後すぐに凍結乾燥します。
   メモ: SpeedVacのローターを取り外して、100 mmのペトリ皿を収容する平らなプラットフォームを作成します。
2. 極低温手袋と絶縁ピンセットを使用して、LN₂ チルド カバーガラスを含むペトリ皿を真空濃縮器チャンバーに置きます。
3. 標準真空設定を使用して処理し、目に見えるLN₂ が蒸発し、カバーガラスが乾燥しているように見えるまで5〜7分間続けます。乾燥したカバーガラスには、LN₂ と氷の結晶が残っていてはなりません。

5. -80°C冷凍庫での細胞保存

1. 容器をペーパータオルで包み、-80°Cの冷凍庫に48時間移します。
2. 保管後、すぐにペトリ皿を含むカバーガラスを室温のデシケーターに~10分間移します。カバーガラスに付着した結露した霜や水が完全に消えたから、デシケーターから取り出してください。
   注:カバーガラスをデシケーターにすばやく移すと、結露が最小限に抑えられます。表面のわずかな濡れでも、乾燥した代謝産物を溶解する可能性があります。
3. AF 洗浄後、サンプルを 2 つのグループ (グループ 1 とグループ 2) に分けます。次の処理プロトコルを適用します。
   グループ1:LN₂ 急冷→凍結乾燥→SCMS分析(保管なし)。
   グループ2:LN₂ 急冷→凍結乾燥→-80°C保存→SCMS分析。
4. SCMS解析を下記で行います。
   注:異なる条件を使用して、より多くの細胞群を調製できます。グループ 1 とグループ 2 は、一般的なプロトコルを説明するために使用されます。

6. シングルプローブの製造とSCMSのセットアップ

注:シングルプローブは、確立された手順^{21、24、60、61}に従って製造され、ここでは簡単なプロトコルのみを提供します。

1. レーザープーラーを使用してデュアルボア石英針を引っ張り、~10 μmの先端を生成します。溶融シリカキャピラリーとナノESIエミッターをデュアルボア石英針に挿入して、シングルプローブを組み立てます。すべてのコンポーネントをクイックセットエポキシでスライドガラスに固定します。
2. シングルプローブをXYZステージに取り付けます。シングルプローブをデジタル顕微鏡の下に配置された電動XYZマニピュレーターに取り付けます。
3. セットアップを質量分析計に結合して、SCMS 分析を行います。
4. 0.1%ギ酸を含むアセトニトリル(≥99.9%)を抽出溶媒として、シリンジポンプで供給する150nL/minの流量で使用します。
5. MSパラメータを設定します。
   正イオンモード:m/z 200-1500、+2.9 kV、質量分解能120 k(m/z 200時)。
   マイナスイオンモード:m / z 70-900、-2.1 kV、質量分解能120 k(m / z 200)。
   注:マイナスイオンは一般に、プラスイオンよりも低いm/z範囲で検出されるため、これら2つのイオンモードには異なるm/z範囲を使用できます。追加の MS 設定には、最大注入時間 100 ms、マイクロスキャン 1 回、標準自動ゲイン制御(AGC)、フルスキャンモード(MS 分析用)、正規化衝突エネルギー(NCE)10-35 の高エネルギー衝突解離(HCD)(MS/MS 分析用)、イオントランスファーチューブ温度の 320 °C が含まれます。各スキャン/時点でトータルイオンクロマトグラム(TIC)を生成し、シグナルの安定性とシングルセル検出をモニタリングしました。

7. シングルプローブSCMS実験

1. 2つのカバーガラス(グループ1とグループ2)を、シングルプローブSCMSセットアップ^21、24、61の電動XYZステージに一緒に配置します。
2. バッチ効果を最小限に抑えるには、顕微鏡下で細胞をランダムに選択します。
3. 正イオンモード質量スペクトルと負イオンモード質量スペクトルを取得します。グループごとに複数の(例:~30)セルを同じシングルプローブ、溶媒流量、イオン化電圧で分析します。
   注:データの比較可能性を確保するために、すべての実験で同じシングルプローブ、溶媒流量、およびイオン化電圧を使用してください。Orbitrapは、取得前に毎日校正してください。MS分析とMS/MS分析はどちらもシングルセルレベルで実行できます。MSデータを収集して、ノンターゲット分析における代謝物プロファイルと暫定標識の研究のための正確なm/z値を取得します。ターゲット分析で分子同定のために選択されたイオンのMS/MS分析を実施します。データは、互換性のあるデータ収集および解釈ソフトウェアを使用して取得されました。

8. データ分析

1. カスタム R スクリプトを使用して生の SCMS データを前処理します。前処理ステップには、バックグラウンドおよびノイズの除去、およびTIC^11、12、23へのイオン強度の正規化が含まれます。
2. Python パッケージ ms_deisotopeを使用して SCMS データを脱同位体化します。
3. 社内のPythonスクリプト⁶⁰を用いてピークアライメントを行う。ビン化には、ビン幅 0.01 m/z を使用します。ピークアライメントには、0.01 m/z または 5 ppm の質量公差を使用します。
4. MetaboAnalyst 6.0⁶²を使用して統計データ分析を実行します。t検定を実施し、ヒートマップ(相対代謝産物レベル)を生成します。[T検定/ANOVAで上位100個を使用]を選択して、比較から有意な差(p < 0.05)で、p値で低いものから高いものまでランク付けされた上位100個の代謝物を生成します。これらの上位100の代謝物を使用してヒートマップをプロットします。
5. 正確なm/z値とMS/MSスペクトルをヒトメタボロームデータベース(HMDB⁶³)に対して検索します。MS データベース検索では、質量許容誤差 10 ppm を使用します。
   注:LipidMaps⁶⁴などの他のデータベースをデータベース検索に使用できます。

本レポートでは、細胞洗浄、急速細胞急冷、真空乾燥、-80°Cでの保存を統合した方法論について説明しています(図1)。具体的には、このアプローチは、SCMS分析前に細胞のメタボロミクス状態を維持するように設計されています。このプロトコルの有効性は、2つの異なる条件下で細胞を調製することによってテストされました:新鮮な急冷および乾燥細胞(グループ1、対照として機能する)、および急冷、乾燥、および-80°C保存された細胞(グループ2)。各グループは、正イオンモードと負イオンモードの両方でシングルプローブSCMS法を使用して分析されました。主成分分析(PCA)とヒートマップの視覚化を使用して、グループ間のメタボロミクスプロファイルの違いを評価しました。

正イオンモードでのPCA結果(図2A)は、グループ1とグループ2が同様の全体的な代謝産物プロファイルを持っていることを明らかにしました。グループ1とグループ2のほぼ同じプロファイルは、-80°Cで48時間保存しても、細胞が乾燥前に適切にクエンチされていれば、メタボロームが有意に変化しないことを示しています。負イオンモード(図2B)では、同様のパターンが観察されますが、グループ2は、特定の代謝産物クラス間のイオン化の違いにより、わずかに異なるように見えますが、たとえば、ホスファチジルコリンはポジティブモードでよりよく検出されますが、脂肪酸はネガティブモードでより効率的にイオン化します60。この変動にもかかわらず、両方のモードにわたるグループ1と2の間の一貫したクラスタリングは、統合された焼入れ-乾燥-貯蔵プロトコルが代謝の完全性を維持するという結論を裏付けています。

ヒートマップ分析により、2つのグループにわたる上位100の代謝産物の相対的な存在量を示すことにより、PCAの調査結果がさらに検証されました。 図3に示すように、上位100の代謝物は、両方のイオンモードでグループ1とグループ2の間で非常に一貫した存在量パターンを示します。大きなシフトやグループ固有のクラスタリングは観察されませんが、いくつかの代謝物クラスターのわずかな変動は、イオン化効率または代謝物の安定性の違いを反映している可能性があります。これらの結果は、焼入れ-乾燥-保管ワークフローが細胞メタボロミクスプロファイルを忠実度で維持し、周囲のSCMSアプリケーションに適していることを総合的に示しています。

図1:LN2 のクエンチングと-80°Cでの48時間の保存が単一細胞の代謝物プロファイルにどのように影響するかを調べるシングルセル質量分析(SCMS)分析の一般的なワークフロー。 (A)細胞を播種し、インキュベートし、アンモニウムフォーマット(AF)溶液を使用してすすぎました。(B)2つの細胞グループを調製しました-グループ1:細胞を洗浄、急冷、凍結乾燥して、保存せずに即時SCMS実験を行いました。グループ2:細胞を洗浄、急冷、凍結乾燥し、-80°Cで保存しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:(A)正イオンモードおよび(B)負イオンモードの実験群におけるHCT-116細胞からのSCMSデータの主成分分析(PCA)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:(A)正イオンモードと(B)負イオンモードについて提示された、さまざまな条件下で調製された単一のHCT-116細胞で検出された上位100の代謝産物の相対レベルを示すヒートマップ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

著者には開示すべき利益相反はありません。