方法論記事

マウスにおける咳とくしゃみ反射の精密誘導と区別

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DOI:

10.3791/68999

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2025年10月3日

 ,  , 
1School of Basic Medical Sciences, The Fifth Affiliated Hospital, Guangzhou Medical University, 2Guangzhou National Laboratory, 3Bioland Laboratory (Guangzhou Regenerative Medicine and Health Guangdong Laboratory)

この記事について

サマリー

本研究では、気管と鼻腔に特定の刺激を加えることでマウスの咳とくしゃみのモデルを構築し、マウスの音響信号の違いを解析することでマウスの咳とくしゃみを区別する音声ベースの方法を開発しました。

要約

咳とくしゃみは、重要な呼吸防御反射として、従来のモデルに固有の非特異的刺激によって制限されるメカニズムに関する研究が行われてきました。カプサイシンやクエン酸噴霧などの既存の方法は、咳 (気管 C 線維によって媒介される) とくしゃみ (鼻の三叉神経によって媒介される) を同時に活性化し、混乱した行動観察につながる可能性があります。これまでの研究では、呼吸パターンや音響の特徴を分析することで咳とくしゃみを区別しようと試みられてきましたが、これらの研究には気管と鼻腔を特異的に刺激できるモデルがありません。ここでは、気管(咳を誘発するため)と鼻腔(くしゃみを引き起こすため)の部位特異的刺激を利用したマウスモデルを開発しました。同期マルチモーダル記録、全身プレチスモグラフィー(WBP)、広帯域超音波マイク(0-250 kHz)、および高速ビデオ撮影(160 fps)を使用して、咳とくしゃみの異なる生理学的特徴を定量化しました。私たちの調査結果は、咳とくしゃみの両方がシングルピークとダブルピークの呼吸パターンを示し、それらのオーディオ周波数スペクトルの組成に大きな違いがあることを明らかにしました。音声の特徴に基づいて座標系を構築することで、咳とくしゃみを効果的に区別し、座標軸の異なる象限にマッピングすることができました。この研究は、解剖学的に特異的な刺激と音響的特徴分析を通じて、咳とくしゃみを定量的に区別できるマウスモデルを確立し、気道防御反射の調査と標的治療法の開発のための高精度の実験方法を提供しました。

概要

咳やくしゃみは、体が気道から異物を取り除くための重要な防御反射であり、それに関連する神経経路の異常は、慢性咳嗽や鼻炎などの慢性疾患を引き起こすことがよくあります。どちらの反射も、吸気期、圧縮期、呼気期を含みます 1,2。咳反射は、主に迷走神経によって神経支配される気道感覚ニューロンによって媒介されます 3,4,5。迷走神経細胞は気道から機械的、化学的、または電気的刺激を受け取り、その信号を延髄の孤立核(NTS)に伝達します6。NTS はこの情報を統合し、その後、髄質と橋の呼吸中枢に投影します7。これらのセンターは、最終的に関連する呼吸筋群(横隔膜、肋間筋、喉頭筋など)を調整して咳作用を実行し、潜在的に有害な刺激物や粘液を口腔を介して気道から排出します8,9,10。くしゃみ反射は、主に三叉神経節内の鼻感覚ニューロンによって媒介されます11,12。それらの機械的または化学的刺激は脊髄三叉神経核(SP5)に伝達され、三叉神経核は情報を呼吸中枢に中継します13,14,15,16。これらの中枢は、くしゃみを開始するために関連する筋肉(呼吸筋、口蓋筋、顔面筋など)を調節します17。くしゃみの強力な呼気の爆発により、空気の大部分が鼻から押し出され、刺激物が排出されます 9,18。咳やくしゃみの研究は、呼吸防御の神経機構の解明に役立つだけでなく、慢性的な咳や鼻炎の治療標的にもなります。この目的のためには、堅実で信頼性の高い動物モデルを確立することが最も重要です。

近年、マウスは咳やくしゃみの神経経路を研究するための極めて重要なモデル生物として浮上しています 19,20,21。現在の主要な方法論は、エアロゾル化された覚醒剤化合物8,20,22の吸入を介してこれらの反射行動を誘導することを依然として含んでいる。この吸入アプローチの重大な制限は、刺激が鼻腔と気管の両方に同時に作用し、くしゃみ (三叉神経経路経由) と咳 (迷走神経経路経由) を媒介する異なる感覚求心性系を非特異的に活性化することです。これは、実験で誘発された行動タイプを正確に区別する上で大きな課題となります。この矛盾は文献で明らかです:いくつかの研究は、マウスのカプサイシン誘発性呼吸反射をくしゃみとして定義しています21、他の研究は、これらの反射が咳とくしゃみの両方の成分を含むと報告しています8,22。

この課題に対処するために、異なる反射行動を分類するための呼吸パターンと軌道の分析を含む高度な方法論が開発されました8。別の研究では、咳とくしゃみは、持続時間、周波数変調などの時間的およびスペクトル的特性に顕著な違いを示すことが示されています22。彼らの研究は、咳はより低いピーク周波数範囲(20〜80 kHz)でエネルギー集中を示すのに対し、くしゃみは90 kHzを超えて拡張する成分を示すことを強調しました22。これらの音響発散は、従来の呼吸波形分析を補完する、行動識別のための新しい非侵襲的なフレームワークを提供します。これらの革新にもかかわらず、既存のモデルには刺激伝達における解剖学的特異性が欠けており、気管反射経路と鼻反射経路が交絡することが多いという重大なギャップが残っています。この制限は、呼吸反射をターゲットにして研究するためのより良い方法が必要であることを示しています。

気道の機械的および化学的刺激によって引き起こされる咳やくしゃみの根底にあるメカニズムに関する研究は、大型動物モデル(猫など)で広く行われています17。ただし、小動物モデル (モルモット、ラット、マウスなど) では、技術的な制限により、通常、化学刺激を達成するためにエアロゾル化化合物 (カプサイシンやクエン酸など) に依存する必要がありました。

このプロトコルは、マウスに咳のようなくしゃみのような行動を誘発するための新しい方法を提案し、これらの呼吸反射を定量化および特徴付けるための新しい一連の方法を確立します。このアプローチは、特徴的な発声を特定し、そのスペクトル特徴と音響強度を分析することにより、マウスの咳のような行動とくしゃみのような行動を区別する戦略を確立します。この新しい方法論は、マウスの呼吸反射の定量化を標準化し、実験の再現性を高め、咳やくしゃみの神経生理学のメカニズムの理解を深める可能性を秘めています。

プロトコル

すべての実験は、広州研究所の動物使用およびケアプロトコル (GZLAB-AUCP- 2024-04-A10) のガイドラインに従って実施されました。この研究では、生後8〜10週の雌マウスおよび雄マウスの特異的病原体を含まないC57BL / 6マウスを使用しました。

1. 実験準備

  1. 実験動物の調製
    1. マウスを餌や水に自由にアクセスできるケージに入れ、標準的な12時間の明暗サイクルで22±1°Cに維持します。
  2. カプサイシン溶液の調製
    1. 10%エタノールと10%トゥイーン-80を含むPBSに30.5 mgのカプサイシン粉末を溶解して、10 mMのストック溶液を調製します。
    2. 原液を生理食塩水で1:100に希釈して、100μMの作業溶液を調製します。
  3. トリブロモエタノール(アバーチン)の調製
    1. 0.5 g のトリブロモエタノールを 1.5 mL のエッペンドルフチューブに入れます。1 mLの2-メチル-2-ブタノールを加えます。
    2. 55°Cで、完全に溶解するまで(~20分)暗所で撹拌(400〜600 rpm)インキュベートします。
    3. ビーカーに生理食塩水40mLを入れます。撹拌しながら、溶解したトリブロモエタノール溶液を滴下する。溶解した結晶が完全に消散するまで撹拌を続けます(~40分)。
    4. NaOHを使用してpHを7.0〜7.3に調整します。

2. 咳様行動モデルの確立と記録

  1. 移植用カニューレの準備
    1. 28 Gの針(内径:0.19 mm、外径:0.35 mm)を~5 mmのカニューレに切断します。鉗子を使用して研磨紙で両端を滑らかにします。一端をシリコンチューブ(内径:0.3 mm、外径:0.8 mm)に取り付けます。1 mLのシリンジに接続し、カニューレを水で洗い流して開存性を確認します。
    2. カニューレを2:3のアーム比で90°曲げます。長いアームをシリコンチューブに挿入します(内径:0.3 mm、外径:0.8 mm、長さ5 cm; 図1A)。気管移植用の曲がった端を指定します。固定のためにシリコーンチューブを気管から頭蓋骨まで伸ばします(図1B)。
  2. 録音機器のセットアップ準備
    1. 全身プレチスモグラフィー(WBP)システム、超音波レコーダー、高速度カメラ、マイクロインジェクションポンプを準備します。
  3. マウスグループの割り当て
    1. マウスをランダムに3つのグループ(n = 6 /グループ)に割り当てます。i)対照群:正常な未治療状態を維持します。ii) 偽グループ: 刺激なしで気管カニューレを埋め込みます。iii) 刺激群:気管カニューレを埋め込み、カプサイシンを投与して咳を誘発します。
  4. 手術
    1. トリブロモエタノール(125-250 mg/kg)の腹腔内注射によりマウスを麻酔し、つま先のつまみに対する反応がないことで完全麻酔を確認します。
    2. 麻酔をかけたマウスを仰臥位で固定します。頭蓋毛と頸部の毛を剃ります。ヨードフォアで消毒します。手術用ハサミを使用して、頭皮の直径約5 mmの円形部分をトリミングして頭蓋骨を露出させます。
    3. 顕微鏡下で:子宮頸部の皮膚を約1cm切開します。組織や筋肉を鈍く解剖して気管を露出させます。輪状軟骨と気管軟骨の間の軟部組織を32G針で穿刺します。眼科用ハサミで最小限の気管開口部を作成します。
      注:組織の損傷を防ぐために、開口部のサイズはカニューレの直径に十分な大きさにしてください。
    4. 金属カニューレ(シリコンシース)を気管内腔に~1mm挿入します。カニューレと気管の接合部を7-0縫合糸で固定します。
      注:呼吸障害を避けるために、挿入深さを1mmに制限してください。
    5. 首から頭蓋骨まで皮下に鈍くトンネルを掘ります。シリコンチューブを頭蓋骨に配線し、歯科用セメントで固定します。
    6. 縫合頸部切開。マウスが意識が回復するまで、マウスを加熱パッドの上に置きます。ケージに5日間閉じ込めます。
    7. 気管カニューレ/チューブを毎日 1 mL の空気注射器で洗い流します。
      注:咳誘発前の24時間以内に紅潮を省略してください。
  5. 咳の記録
    1. 超音波プローブをポート互換のシールリングに取り付けます。プローブをWBPチャンバーポートに挿入して、気密接触を確保します。
    2. WBPチャンバー、フローセンサー、バイアスフローを接続します。ソフトウェア で 校正します。
    3. 頭蓋骨で固定されたシリコンチューブを30cmの延長チューブに取り付けます。マウスをWBPチャンバーに入れます。上部のポートを通してチューブを伸ばします。ポートをモデリング粘土で密閉します。呼吸波形のピークが4±2以内に収まることを確認し、チャンバーの気密性を検証します。
    4. 1 mLのシリンジに5 mLのカプサイシン溶液をロードします。気泡をなくします。延長チューブに接続します。シリンジをマイクロインジェクションポンプに取り付け、流量を10 μL min-1に設定します。
      注:過剰な流れはカプサイシンを鼻腔に運ぶ可能性があります。
    5. 高速度カメラをチャンバーに向かって配置します。距離と焦点を調整します。サンプリングレートを160fps(最大)に設定します。
    6. WBP、超音波、カメラソフトウェアを同時に起動します。ポンプをトリガーしてカプサイシンを注入します。10分間の記録的な咳数。

3. くしゃみのような行動モデルの確立と記録

  1. 実験装置の準備
    1. マウスの鼻骨に刺激カニューレとして固定するための滅菌PEチューブ(内径:0.5 mm、外径:1 mm)を1本準備します。
    2. 経カニューレ鼻刺激用に直径0.25mmの滅菌ナイロンフィラメントを1本準備します。Vonfreyの校正方法を利用すると、長さ5cmのフィラメントを約45°に曲がるまで天びんに垂直に押し付けると、測定された力は0.6gになります。
  2. 記録機器のセットアップ
    1. 全身プレチスモグラフィー(WBP)システム1台、超音波レコーダー1台、高速度カメラ1台を用意。
  3. マウスグループの割り当て
    1. マウスをランダムに3つのグループ(n = 6/グループ)に割り当てます。i)対照群:未治療のベースライン状態を維持します。ii) 偽グループ: 刺激なしで鼻カニューレを固定します。iii) 刺激グループ: 鼻カニューレを固定する + フィラメント刺激 によって くしゃみを誘発します。
  4. 手術
    1. トリブロモエタノール(125-250 mg/kg)の腹腔内注射によりマウスを麻酔し、つま先のつまみに対する反応がないことで完全麻酔を確認します。
    2. 頭蓋骨と鼻梁の毛を剃ります。
    3. マウスを定位固定フレームに固定します。ヨードフォアで消毒します。頭蓋骨と鼻骨の上の皮膚を切開します。鼻骨を露出させます。
    4. マイクロドリルを使用して、鼻骨と鼻中隔軟骨の外側突起の間の接合部に0.5mmの穴を開けます。鼻粘膜を露出させます。
      注:組織の損傷を防ぐために、穴のサイズを0.5mmに制限してください。
    5. 32Gの針で鼻粘膜をそっと持ち上げます。鼻腔を露出させます。
    6. PEチューブを定位固定アームに取り付けます。チューブの先端をバリ穴と同じ高さに配置します。歯科用セメントでチューブを鼻の骨に固定します。
    7. 意識が戻るまでマウスを加熱パッドの上に置きます。
  5. くしゃみの録音
    1. WBPチャンバー、フローセンサー、バイアスフローをマニュアルに従って接続します。ソフトウェアを使用して校正します。
    2. 超音波プローブにポート適合ガスケットを取り付けます。プローブをチャンバーに挿入します。気密性を確認します。
    3. マウスをWBPチャンバーに移します。PEチューブを上部ポートに通します。チューブの周りのモデリング粘土でポートを密閉します。呼吸波形のピークが4±2以内に収まることを確認し、チャンバーの気密性を検証します。
    4. 高速度カメラをチャンバーに向かって配置します。距離と焦点を調整します。サンプリングレートを160fps(最大)に設定します。
    5. 直径0.25 mmのナイロンフィラメントを柔らかいチューブを通して鼻腔内に0〜3 mmの深さまで進めます。手持ちチューブから突き出たフィラメントの部分の長さは5cmです。刺激中、この自由端が45°に曲がるまで押し、鼻粘膜に~0.6 gの力を1秒間与え、30秒に1回繰り返します。くしゃみの反応を10分間記録します。

4.マウスのカプサイシン誘発性咳とくしゃみ

  1. グループ割り当て
    1. マウスを偽手術群と手術群に分けます(n = 5 /グループ)。偽グループ: 両側の前篩骨神経と眼窩下神経を露出させます。手術群: 横断両側前篩骨神経および眼窩下神経。
  2. 超音波噴霧
    1. 行動室(20 cm×14 cm×17 cm)を準備します。
    2. 最適なモニタリングのために超音波レコーダーとカメラを配置します。
    3. ネブライザーに100μMのカプサイシン溶液をロードします。2分ごとに30秒のエアロゾルパルスを10分間供給します。
    4. 超音波レコーダーとカメラを使用して行動を連続的に記録します。

5. データ分析プロセス

  1. 全身プレチスモグラフィー(WBP)呼吸追跡分析
    1. WBPで録音したテキストファイルをSpike2ソフトウェアにインポートし、オーディオ信号と同期させます。
    2. シングルピークとダブルピークの呼吸パターンに対応するオーディオ信号を解析し、各パターンの圧縮フェーズの持続時間を記録します。
    3. 呼気期の最低点を中間点として選択し、平均値を計算するために前後の30秒のデータを取得します。
  2. オーディオ波形解析
    1. オーディオファイルをSpike2ソフトウェアにインポートし、個々の咳またはくしゃみのオーディオを選択して、TXT形式(サンプリングレートを100kHzに設定し、持続時間を0.1秒に設定)としてエクスポートします。
    2. TXTファイルをExcelにインポートし、オーディオ信号の絶対値に変換します。
    3. GraphPad Prismソフトウェアを使用して、50ポイントのスムージングスプラインを使用してオーディオ波形の絶対値をスムージングします。
      注:過度の変曲点を避けながら、曲線が元のデータに近づけるようにするには、50点の平滑化スプラインを選択するのが最適です。50 ポイントを超える値で生成された曲線は、50 パラメータ曲線からの偏差は無視できます。
    4. 平滑化されたオーディオ波形に基づいて、始点から最高点までの傾きkを計算します。
  3. オーディオスペクトル解析
    1. オーディオファイルをSpike2ソフトウェアにインポートします。
    2. スペクトル分析のために個々の咳やくしゃみの音声の開始時点と終了時点を選択し、スペクトル分析結果をエクスポートします。
    3. GraphPad Prismを使用して、スペクトル解析曲線を生成し、曲線の下の面積を計算します。
    4. 咳とくしゃみを区別するために、30〜60kHzと0〜30kHzの周波数帯域の間の曲線下面積の比率を計算します。
  4. 複合指数の計算
    1. データの識別可能性を高めるために、傾きkとスペクトル解析曲線下の面積の比率に対して自然対数変換(ln)を実行します。

6. 統計分析

  1. データは SEM ±平均として表示されます。2 つのグループ間の統計的比較は、t 検定と二元配置分散分析を使用して実行され、 P < 0.05 は統計的に有意であると見なされました。すべての分析は、GraphPad Prismソフトウェアを使用して実施されました。

結果

本研究では、全身プレチスモグラフィー(WBP)と超音波記録技術を用いて、マウスの咳やくしゃみ行動の呼吸パターンを詳細に解析した。結果は、気管または鼻の手術を受けたマウスが、ナイーブ対照と同等の咳とくしゃみの反応性を示すことを示しました。しかし、カプサイシン(化学的)および機械的刺激は、これらの外科的に準備された動物に咳とくしゃみの反射を効果的に誘発します(図2A、B)。WBPの結果、両方の行動がシングルピークおよびダブルピークパターンを示し、呼吸パターンの排出段階で音声信号が現れることが明らかになりました(図3A、C、E、G)。さらなる超音波分析により、明確な音響プロファイルが明らかになりました:咳音は突然発症し、ピーク強度は瞬間的に発生し、主に0〜30kHzの周波数範囲内で発生し、持続時間が短かった(図3B、D; サポートビデオS1)。くしゃみの音は、最大振幅、広帯域周波数分布(0〜80 kHz)、および持続時間の延長まで徐々に強度が蓄積することを示しました(図3F、H; サポートビデオS2)。統計分析により、シングルピーク咳行動の平均圧迫段階は 32.39 ± 0.73 ミリ秒であり、ダブルピーク咳行動の 53.17 ± 2.29 ミリ秒よりも大幅に短いことが明らかになりました (図 4A、B、C)。シングルピークくしゃみ行動の平均圧縮段階は44.03±1.84msで、ダブルピーク咳行動の平均値よりも低く、ダブルピークくしゃみ行動の平均圧縮段階は74.24±1.29msで、シングルピークくしゃみ行動の平均圧縮段階よりも有意に長かった(図4E、F、G)。また、咳行動におけるシングルピークパターンの発生率は77.55%±2.10%(図4D)であるのに対し、くしゃみ行動では、シングルピークパターンは32.42±5.88%にとどまり、ダブルピークパターンは67.58%±5.88%を占めた(図4H)。音声持続時間の統計分析では、咳とくしゃみの音声時間の間に有意差があることが示されましたが、両者の間にはかなりの重複がありました(図5A)。咳とくしゃみの超音波音声のスペクトル分析により、咳の音声の周波数スペクトルは主に0〜30kHzの範囲に集中しているのに対し、くしゃみの音声は0〜60kHzの範囲でより高い割合を持っていることがわかりました(図5B)。咳の音も30〜120kHzの範囲の周波数を持っていましたが、低周波の割合は常に高周波よりも高かったです。そこで、始点から最大値までの音の強さの傾き(図5C)を垂直座標とし、30〜60kHzから0〜30kHzのエネルギー比(図5D)を水平座標として、咳やくしゃみの音を効果的に区別できる座標系を確立しました。さらに、この座標系では、シングルピークとダブルピークの咳、およびシングルピークとダブルピークのくしゃみの間に有意差はありませんでした(図5E)。

次に、マウスのカプサイシン噴霧によって誘発される咳やくしゃみ行動を分類するために、前述の分類法を採用しました。カプサイシン噴霧によって誘発される咳やくしゃみの行動は、同じ座標位置での特定の刺激によって引き起こされる行動と重複することがわかりました(図5F、G)。鼻の感覚求心性神経(前篩骨神経および眼窩下神経)の切断に続いて、カプサイシン噴霧はくしゃみ関連の音響信号を大幅に減少させましたが、咳関連の音声プロファイルは影響を受けませんでした(図5H、I)。

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図1:刺激された気管および鼻腔モデルでの手術の概略図。 (A) 気管に埋め込まれたカテーテルの概略図。(B)前頭(左)および冠状(右)面は、マウスの気管に埋め込まれたカテーテルの位置を示しています。(C)矢状面は、鼻腔内のカテーテル移植の位置とフィラメント繊維刺激の位置を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:部位特異的刺激によって誘発される咳やくしゃみのような行動の定量化。 (A) 正常対照群、偽群、および機械的鼻刺激群のくしゃみの定量化。偽のグループは、対照群と同等のくしゃみの頻度を示しました。機械的鼻刺激は、くしゃみイベントの有意な増加を引き起こしました。(B) 正常対照群、偽群、およびカプサイシン気管チャレンジ群の咳の定量化。偽のグループでは、対照と比較して咳の頻度に有意差は見られませんでした。カプサイシン気管刺激は咳の数を大幅に増加させました。データは、SEM±平均、***P < 0.001、****P < 0.0001として表されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:咳とくしゃみの呼吸痕跡と音響オシログラム。 (A)カプサイシンによって誘発された咳中の単一のピーク呼吸痕跡と音声録音を示す代表的な画像。(B) Aの咳の音声録音のサウンドオシログラム(上)とスペクトログラム(下)。(C) カプサイシンによって誘発された咳中の二重ピークの呼吸痕跡と音声録音を示す代表的な画像。(D) Cでの咳の音声録音のサウンドオシログラム(上)とスペクトログラム(下)。(E) 機械的刺激によって誘発されたくしゃみ中の単一ピークの呼吸痕跡と音声録音を示す代表的な画像。(F) Eのくしゃみ音声録音のサウンドオシログラム(上)とスペクトログラム(下)。(G) 機械的刺激によって誘発されたくしゃみ中の二重ピークの呼吸痕跡と音声録音を示す代表的な画像。(H) Gのくしゃみ音声録音のサウンドオシログラム(上)とスペクトログラム(下)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:咳のような行動とくしゃみのような行動の呼吸痕跡の単一および二重ピーク。 (A)単一の呼吸ピーク(n = 52)を持つ咳のような行動の平均(赤)および個々の(灰色)および平均(赤)呼吸痕跡。(B)二重呼吸ピーク(n = 29)を伴う咳のような行動の平均(赤)および個別(灰色)および平均(赤)呼吸痕跡。(C)カプサイシンによって誘発される咳の単一および二重呼吸ピークの圧縮期の持続時間(単一ピークn = 52、二重ピークn = 29)。(D)咳における単一および二重呼吸ピークトレースの平均比率(n = 6マウス)。(E)単一の呼吸ピーク(n = 40)を伴うくしゃみのような行動の平均(赤)および個々の(灰色)および平均(赤)の呼吸痕跡。(F)二重呼吸ピーク(n = 74)を伴うくしゃみのような行動の平均(赤)および個々の(灰色)および平均(赤)呼吸痕跡。(G) 機械的刺激によって誘発されたくしゃみの単一および二重呼吸ピークの圧縮期の持続時間 (単一ピーク n = 40、二重ピーク n = 74)。(H)くしゃみにおける単一および二重呼吸ピークトレースの平均比率(n = 6マウス)。データは、SEM±平均値として表され、****P <0.0001です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:咳とくしゃみの音オシログラムの周波数と波形の分類。 (A)咳とくしゃみの超音波検査時間の定量化。(B)機械的刺激誘発性くしゃみ(n = 69、黒)およびカプサイシン誘発性咳(n = 140、赤)の平均スペクトログラム分析。(C)音響オシログラムの傾きを計算するための代表的な模式図。スムージングスプラインの比較分析により、25ポイントでは過度のスムージングにより元のデータ特徴が不明瞭になるのに対し、50ポイントを超える値(例:75ポイント)は50スプライン曲線とかなりの重複を示しますが、追加の変曲点が生じます。(D)スペクトル解析結果を使用して、GraphPad Prismの異なる周波数曲線下の面積を計算した、面積比計算の代表的な概略図。面積比は、30〜60kHz曲線の下の面積と0〜30kHz曲線の下の面積に等しくなります。(E)機械的刺激誘発性くしゃみおよびカプサイシン誘発性咳音オシログラムの周波数と波形の分類で、y軸はベースラインからピークまでの音波形の傾きの指数を表し、x軸は30〜60 kHzと0〜30 kHzの間の音波の比率の指数を表します。(F)カプサイシン噴霧誘発くしゃみ(n = 36、黒)およびカプサイシン噴霧誘発性咳(n = 42、赤)の平均スペクトログラム分析。(G)カプサイシン噴霧誘発くしゃみ(n = 36、黒)およびカプサイシン噴霧誘発咳(n = 42、赤)サウンドオシログラムの周波数と波形の分類で、y軸はベースラインからピークまでの音波の傾きの指数を表し、x軸は30〜60 kHzと0〜30 kHzの間の音波の比率の指数を表します。(H) 前篩骨神経および眼窩下神経を切断したグループと偽手術群におけるカプサイシン誘発くしゃみ反射に関する統計データ。(I) 前篩骨神経および眼窩下神経を切断したグループと偽手術群におけるカプサイシン誘発性咳反射に関する統計データ。データは、SEM±平均、**P < 0.01、****P < 0.0001として表されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足ビデオ1: 咳のような行動のビデオは、通常の速度と0.1倍速で表示されたオーディオスペクトログラムと同期しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ビデオ2: くしゃみのような行動のビデオは、オーディオスペクトログラムと同期し、通常および0.1倍速で表示されます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

本研究では、カプサイシンで気管を特異的に刺激し、鼻腔を機械的に刺激することで、マウスの咳やくしゃみ行動を誘導することに成功しました8,17。全身プレチスモグラフィー(WBP)、オーディオ、およびビデオ記録からデータを同期的に収集し、オーディオ周波数比と音の強度の傾きがマウスの咳とくしゃみの行動を効果的に区別できることを発見しました8,23。

関連する外科手術のデリケートな性質を考慮すると、いくつかの重要なステップに特別な注意を払う必要があります。まず、気管手術中、呼吸困難や死亡につながる可能性のある気道閉塞を避けるために、埋め込まれた気管内カニューレはできるだけ薄く、浅い深さに挿入する必要があります。さらに、気管内の分泌物はカテーテルを塞ぎやすいため、毎日のカテーテルクリアランスが重要です。カプサイシンを投与するときは、くしゃみ反射を引き起こす可能性のある鼻腔への逆行性流れを防ぐために、注射速度を慎重に制御する必要があります。第二に、鼻骨移植手術では、マウスへの過度の損傷を避けるために、開けられた穴のサイズが重要です。カテーテルは、鼻腔の過度の刺激や正常な呼吸の妨げを防ぐために、深く挿入しすぎずに鼻骨の高さに配置する必要があります。最終的には、正確な外科手術の実施が実験に不可欠です。マウスの怪我を最小限に抑えることで、回復を早めることができるだけでなく、より正確な実験行動反応を記録することができます。このような外科的方法は、モデルの信頼性を高め、高品質のデータを確保するのに役立ち、それによって咳やくしゃみなどの呼吸反射行動を研究するための強固な実験基盤を提供します。

伝統的に、咳行動のモデリングは、咳を誘発するためにカプサイシンやクエン酸などの化合物の噴霧に依存してきました24,25。ただし、このアプローチには顕著な制限があり、咳を引き起こすだけでなく、同時にくしゃみ反射を引き起こす可能性があります8,22。さらに、エアロゾル化された刺激に対する感受性の有意な個人差が観察されており26、マウスのサブセットは咳反応をまったく示さなかった。対照的に、この研究で開発された新しい機械的刺激パラダイムは、交換可能なアクチュエーターを介して刺激を柔軟にカスタマイズしながら、安定した咳のような挙動を実現します。同様に、エアロゾル化剤を使用する従来のくしゃみモデルは、側副咳を頻繁に誘発するため、行動特異性が低く、22、それによってこれらの異なる呼吸反射間の区別が複雑になります。

以前の研究では、カプサイシンを使用してマウスの咳とくしゃみのモデルが確立され、全身プレチスモグラフィー(WBP)8によって記録された呼吸パターン(シングルピークまたはダブルピーク)の特性に基づいて2つを区別しました。私たちの研究データによると、誘発された咳行動では、シングルピーク呼吸パターンが発生の 77.55 ± 2.10% を占め、くしゃみ行動ではシングルピーク パターンが 32.42 ± 5.88% を占めました。これらの結果は、WBP 呼吸パターンに基づく分類方法がほとんどの場合有効であるが、限界があり、2 つの行動を完全に区別できないことを裏付けています。さらに、いくつかの研究では、音声信号の持続時間と周波数特性を使用して咳とくしゃみを区別しようと試みています22。くしゃみ行動の音声信号の平均持続時間は通常、咳よりも長くなりますが、個々のイベントの持続時間の間にはかなりの重複が存在します。したがって、オーディオの長さを識別指標として依存すると、十分な識別力が欠けている可能性があります。さらに、咳とくしゃみのスペクトル分析では、軽度の咳は低周波信号としてのみ現れる可能性があるのに対し、激しい咳はくしゃみと同様のスペクトル特性を持つ、重要な高周波成分を含む音を生成する可能性があるという明確な境界は明らかになっていません。特に、咳イベントは一貫して低周波エネルギーの割合が高いことを示します。対照的に、高周波エネルギーと低周波エネルギーの比率 (高周波と低周波エネルギー比) は、咳とくしゃみの行動を区別するためのより識別的な音響的特徴を提供する可能性があります。

当社のイノベーションは、空間的に制約された機械的刺激を通じてこれらの制限に対処します。洗練された行動モデルは、(1) 刺激適用安定化プローブのミリメートルレベルの精度、および (2) 行動特異性の向上という 2 つの利点を示しています。さらに、咳やくしゃみの音響を広範囲に分析したところ、これらの行動は異なる音の強度プロファイルを示し、高周波エネルギー比と低周波エネルギー比に統計的に有意な違いがあることが明らかになりました。さらに、咳やくしゃみのイベントの包括的な音響分析により、これらの行動間の独特の音の強度プロファイルが明らかになり、高周波エネルギー比と低周波エネルギー比に統計的に有意な違いが伴います。さらに、この分類方法は、カプサイシン噴霧によって誘発される咳やくしゃみ行動の音響記録でも実現可能です。これらの音響パラメータを総合すると、咳とくしゃみを区別するための客観的で定量化可能な標準を確立する多次元特徴空間の開発が可能になりました。この結果は、交絡因子を減らし、再現性を向上させた気道防御メカニズムを調査するための優れた基準を確立します。これにより、呼吸反射研究における長年の課題が解決されるだけでなく、咳やくしゃみの神経回路の正確な神経調節研究への道も開かれます。

この方法はマウスの咳やくしゃみの行動を効果的に誘発しますが、まだいくつかの制限があります。噴霧導入と比べると、手術中のダメージを最小限にとどめるよう努めても、マウスにある程度の怪我を負わせることがあります。それにもかかわらず、手術は依然として咳やくしゃみの行動を安定的に引き起こすことができ、手術自体がこれらの刺激に対するマウスの感受性を低下させないことを示しています。行動表現型解析においても技術的な課題が浮上しました。音響信号の忠実度を高めるには、振幅の飽和を避けながら信号対雑音比のバランスをとるために、被験者からのマイクの配置を正確にキャリブレーションする必要がありました。さらに、刺激送達カテーテルと全身プレチスモグラフィー (WBP) チャンバーの統合には、カテーテルがマウスの自然な動きや刺激の送達を妨げることなくチャンバーの上部から伸びる必要があるという特殊な設計が必要でした。要約すると、手術方法の限界にもかかわらず、マウスの咳やくしゃみ行動を安定的に誘発する効果的な手段を提供し、慎重に設計された実験プロセスにより、マウスへの損傷を最小限に抑え、正確な行動データ収集を保証できます。

結論として、これらの繊細な外科的操作と厳密な実験計画を通じて、マウスの咳とくしゃみの行動を安定的に誘発するモデルを確立し、これら 2 つの呼吸反射行動のさらなる研究のための信頼できる実験基盤を提供しました。

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、中国国家重点研究開発プログラム (STI2030-主要プロジェクト - 2021ZD0202400 から CS)、中国国家自然科学基金 (32422032 および 32271069 から CS)、広東省特別支援計画 (2023TQ07A609 から CS)、広州国家研究所の主要プロジェクト (MP-GZNL2024A02001-02 および助成金番号GZNL2024A02001 C.S.へ)。すべてのデータは広州国立研究所にアーカイブされています。

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