マウス早産卵巣機能不全モデルの準備と評価

サマリー

このプロトコルは、シクロホスファミド注射 を介して 早発卵巣機能不全マウスモデルを構築する方法を概説しています。このモデルは、ヒトの早発卵巣機能不全の病理学的進行を効果的、容易、適応性を持って再現し、高い信頼性と費用対効果を実証します。

要約

卵巣早期機能不全 (POI) は女性の不妊症につながる重大な状態であり、機構および治療研究には信頼できる動物モデルが必要です。ここでは、シクロホスファミド(CTX)誘導POIマウスモデルを確立および評価するための標準化されたプロトコルを提示します。発情周期が規則的である6〜8週間齢の雌マウスを選択し、腹腔内CTX注射を受けました:1日目に100 mg / kgの初期用量、その後の14日間20 mg / kgの毎日の用量。発情周期の動的変化は、ライト染色による膣塗抹細胞診 によって 監視されました。エストラジオール (E2)、卵胞刺激ホルモン (FSH)、および抗ミュラー管ホルモン (AMH) の血清レベルは、内分泌の変化を評価するために ELISA を使用して定量化されました。卵巣の組織病理学は、卵胞閉鎖症を定量化するためにパラフィン包埋切片のヘマトキシリン-エオシン (H&E) 染色によって評価され、顆粒膜細胞のアポトーシスを検出するために切断されたカスパーゼ-3 の免疫組織化学的分析が行われました。結果は、CTX処理マウスにおける発情周期の中断、E2およびAMHレベルの有意な低下、FSH濃度の上昇、濾胞閉鎖の増加、および顆粒膜細胞のアポトーシスの増強を示し、POIモデリングの成功を確認しました。このモデル構築方法は、化学療法による卵巣損傷のメカニズムを高度に模倣することができ、卵胞予備能の枯渇や性ホルモン障害などの典型的な病理学的特徴を示します。これは、化学療法の生殖毒性メカニズムを明らかにし、卵巣保護薬をスクリーニングし、妊孕性温存戦略を最適化するための信頼できる実験プラットフォームを提供します。さらに、このモデルは操作が比較的簡単で、低コストで、生産サイクルが短いため、実行と普及が容易です。この方法論は、視覚化可能な段階的な実験デモンストレーションのための JoVE の要件と一致しています。

概要

女性の生殖老化障害の最も一般的な形態である早発卵巣機能不全(POI)は、エストロゲン欠乏症の症状や生殖機能障害を通じて患者の身体的および精神的健康を著しく損なうだけでなく、骨折、自己免疫疾患、心血管疾患、真性糖尿病などの併存疾患を発症するリスクも高め^ます1。.したがって、効率的で安全な治療戦略の開発は、現代医学において非常に緊急の優先事項となっています。POI 研究に関連する臨床サンプルの入手可能性、多因子病因、および高い倫理的リスクを考慮すると、体系的な機構調査と安全性検証を可能にする信頼性の高い動物モデルの確立が不可欠になっています。

現在、化学療法誘発性卵巣損傷モデルは POI 研究に広く利用されています。免疫抑制特性を持つアルキル化剤であるシクロホスファミド (CTX) は、強力な性腺毒性化合物として同定されています。そのメカニズムには、細胞増殖を抑制するためのDNA架橋損傷が含まれており²、卵巣予^備細胞のアポトーシスにつながります^3,4。CTX ベースのモデルは、原始卵胞枯渇、低エストロゲン血症、卵胞刺激ホルモン (FSH) レベルの上昇など、POI の臨床的特徴を効果的に再現します。マウスへの腹腔内 CTX 注射には、迅速な腹膜吸収による高いバイオアベイラビリティ、技術的ばらつきを最小限に抑えた標準化された操作性、大規模研究の費用対効果など、明確な利点があります。特に、マウスの卵巣構造は人間の卵巣構造と非常に類似しており、卵胞の枯渇とホルモンの変化の動的な観察が容易です。さらに、マウスは低コストで繁殖率が速いため、大規模なサンプル研究の要件を満たしています。

これらの利点にもかかわらず、CTX 投与計画 (単回ボーラス注射と分割注射など) と一時的投与期間の不均一性により、研究間で一貫性のないモデリング結果が生じています。このギャップに対処するために、マウスにおける POI 誘導のための CTX 投与量と投与頻度を最適化する体系的なプロトコルを提示します。この研究は、卵巣予備能の枯渇、ホルモン調節不全、および組織病理学的相関の定量的評価を通じて再現可能なモデルを確立し、それによってメカニズムの探索と治療スクリーニングのための堅牢なプラットフォームを提供することを目的としています。

プロトコル

このプロトコルは、Anhui Shendong Biotechnology Development Co., Ltd. の倫理委員会によって審査および承認されています (倫理番号: SDLL202502281)。この研究は、すべての動物実験手順における実験用げっ歯類のケアと使用に関する国立衛生研究所のガイドラインに準拠しています。この実験で使用した雌のC57BL / 6マウスは6〜8週齢で、特定の病原体のない(SPF)条件下で維持されました。C57系統の近交系および亜系として、C57BL / 6マウスは黒い被毛が特徴です。実験に先立ち、マウスは、制御された温度と湿度の条件下で動物実験室で1週間順応させ、自然な概日リズムを模倣するために12時間の明暗サイクルを行いました。順応期間を通じて、マウスは自由に食物と 水にアクセスできました 。

1.動物の準備

注:正常な発情周期を持つ6〜8週齢の24匹の雌のSPFグレードC57BL / 6マウスを選択します。午前9:00にマウスから膣洗浄液を10日間連続して収集し、剥離した膣細胞の塗抹標本を調製します。発情周期を観察し、少なくとも1つの連続した完全な周期を持つマウスを選択します。

1. 実験前にマウスを1週間環境に順応させます。適応期間の後に耳パンチを使用してマウスにマークを付けます。マーキング後すぐに体重測定値を記録します。
2. 自然なストレス誘発性排尿が起こるまで、マウスをしっかりと握ります。左手の親指と人差し指で首の背側の皮膚をつまんで固定します。マウスの頭を下にして、腹部を完全に露出させます。
3. 滅菌ピペットチップをマイクロピペットにロードします。10 μLの滅菌生理食塩水を吸引します。膣管を通る3回の連続したフラッシュサイクルを実行します。ピペットチップ内に洗浄液を保持します。
4. 洗浄液をガラス顕微鏡スライド全体に均等に分配します。室温で完全に自然乾燥スライドします。保存のために細胞を95%エタノールに浸して固定します。スライドに実験パラメータを包括的にラベル付けし、処理しないときは4°Cの耐光スライドボックスに保護して保管します。
5. ライトの染色プロトコル
   1. スライドを95%エタノールに浸します(3〜10分間)。蒸留水の流れの下でよくすすいでください。
   2. 95%エタノール浴にスライドを移します(1分間)。
   3. きれいなろ紙を使用して、ヘマトキシリン溶液表面から酸化したフィルムをこすり落とします。スライドをろ過したヘマトキシリンに浸します(5分間)。
   4. スライドを蒸留水ですすいでください。1%HCl溶液に短時間(<1秒)浸します。長時間の蒸留水すすぎで完了します。
   5. Orange GおよびEA50溶液を使用して混合染色剤を調製します。混合物に染みを滑らせます(3分間)。
   6. スライドを3つの連続した95%エタノール浴(5秒間隔)に通します。
   7. キシレンで2段階(各2分)で処理します。
      注意: キシレン蒸気の吸入を避けるために、ヒュームフード内で操作してください。使用後はすぐに容器を閉じてください。
   8. 中性樹脂の封入剤を使用して試料を永久保存
6. スライドを顕微鏡で読むときは、有核上皮細胞として淡いピンク色の細胞質と濃い紫色の核を持つ細胞、角質化上皮細胞として不規則な鱗状の無核淡いピンク色の細胞、白血球として小さな丸い青色の細胞を同定します。
   注:以下の細胞学的特徴に基づいて発情周期の段階を決定します:(1)発情前期:優勢な有核上皮細胞。個々のセルとクラスター化されたシートの両方として表示されます。まばらな白血球の存在(視野<5%)。(2)発情期:豊富な無核角化上皮細胞。特徴:不規則な境界を持つ大きな平らな形態。白血球と有核細胞がほぼ存在しない(合計<2%)。(3)メテストラス期:角質化細胞集団の減少。新たな白血球浸潤再出現する有核上皮細胞(20%〜40%の組成);(4)発情期:優性白血球および有核細胞(>80%)。角質化細胞の事実上の欠如 (<1%)⁵.パターン検証のために、 図1 の標準化された細胞学的アトラスを参照してください。
7. データを整理・分析し、発情周期が正常なマウス24匹を選定する。

2. シクロホスファミド注射液の調製

注:シクロホスファミドは光に対して不安定であるため、プロセス全体を通して暗闇の中で取り扱う必要があります。シクロホスファミドは有毒であるため、手術中は防護服、二層ニトリル手袋、マスクを着用する必要があります。

1. 200 mgの滅菌医薬品グレードのシクロホスファミド粉末を10 mLの滅菌生理食塩水に加えます。完全に混合して、20 mg/mLのシクロホスファミド溶液を得る。すぐに使用するために1回分を予約してください。残りで追加の濃度を調製します。
2. 200 μLの20 mg/mLストックをアルミホイルで包んだ1.5 mL遠心分離管に移します。800 μLの滅菌生理食塩水を加えて、総容量1 mLにします。ボルテックス混合を30秒間行い、4 mg/mL溶液を得る。14個の同一のアリコート(各1 mL)を調製します。すべてのアリコートを-20°Cで垂直ラックに保管します。

3. シクロホスファミド溶液の注入

注:コンピュータ化されたシステムを使用して、24匹のマウスを3つのコホートに無作為に割り付けます:(1)ブランク:治療なし(n = 8);(2) NS: 生理食塩水コントロール (n = 8);(3)POI:シクロホスファミド基(n = 8)。毎朝9:00にマウスに注射します。POI グループの場合、初日に 100 mg/kg のシクロホスファミド溶液を腹腔内に注射し、その後 14 日間 20 mg/kg のシクロホスファミド溶液を継続的に注射します。NS グループに同量の生理食塩水を腹腔内に注入し、BALNK グループは治療せずに残します。各注射前に毎日すべてのマウスの体重を量り、注射後に塗抹するために膣剥離細胞を収集します。

1. 鉗子でイソフルランを浸した綿球を密閉可能な容器に入れます。マウスを容器内に配置して、10秒間の吸入麻酔を行います。
   注:イソフルランは、特定の毒性と刺激性を持つ揮発性麻酔薬です。手術は、施設で承認されたプロトコルに従って、換気の良い環境で実施する必要があります。
2. 注入量の計算:体重(g)×5 = μL。75%エタノール綿棒で右下象限を消毒します。26 Gの針を30〜45°の角度(ベベルアップ方向)で挿入します。「ポップ」感がするまで腹壁を5mm進めます。50 μL/s の速度で溶液を供給します。
3. 残留液体と汚染された機器は、「感光性廃棄物」と表示された遮光廃棄物容器に入れます。イソフルランに浸した綿球は、透明な有害廃棄物ラベルが貼られた指定された密閉容器に廃棄してください。
4. 凍結した4mg/mLのアリコートを37°Cのウォーターバス(3分)で解凍します。1日の用量を再計算する:体重(g)×5 = μL。シリンジを装填する前に、溶液の透明度を確認してください。

4.血清採取

注:シクロホスファミド溶液注射の15日後、すべてのマウスの心臓の頂点から血液を採取します。遠心分離して血清を取得します。対照群とNS群のマウスは、ダイストラス期にサンプリングする必要があります。POI群マウスは、対照/NS群マウスとペアになった時間一致サンプリングを受け、発情状態にあることが確認されました。

1. マウスの麻酔
   1. イソフルラン飽和綿球を含む透明で気密なチャンバーにマウスを入れます。
   2. マウスの動作を観察します。正位反射の喪失(ゆっくり仰臥位になったときに姿勢を自己修正できない)は、適切な麻酔導入を示しています。このプロセスには通常2〜3分かかります。
   3. コンテナからマウスを取り出します。左手で頭を固定し、人差し指で上まぶたを軽く押します。滅菌綿棒を右手に持ち、エリスロマイシン眼軟膏に浸して直径1〜2mmの量を集めます。
      1. 軟膏を眼球表面とまぶたの内側に均一に塗布します。まぶたを閉じてから、指先で10秒間優しくマッサージして、軟膏を均一に分散させます。乾いた綿棒を使用して、目の周りの余分な軟膏を拭き取ります。
2. マウスを発泡ボードの上に仰臥位で置きます。手術用ハサミを使用して胸毛を切り取ります。胸部と腹部を75%エタノールで消毒します。
   1. 正中線に沿って皮膚と皮下組織を切開します。肋間筋を胸骨の左側に沿って縦方向に切ります。心をさらけ出します。
3. 注射器(針の面取りを上に向けて)を心臓の頂点に約30°の角度で挿入します。針をゆっくりと進め、優しく吸引します。得られた血液を1.5mLの遠心分離管に注入します。
4. 得られた血液を遠心分離機に入れます。遠心分離機を850 × g に4°Cで10分間設定します。 ピペットを使用して上層血清を取り出し、0.5 mLの遠心分離管に入れます。-80°Cで保管してください。

5. 血清エストロゲン、FSH、AMHの検出

1. 冷凍血清を4°Cの冷蔵庫に一晩入れてゆっくり解凍します。
2. ELISAキットを冷蔵庫から30分前に取り出し、その中の試薬を室温に戻します。
3. キットの指示に従って、標準希釈剤を使用して標準の連続希釈を実行します。一般に、0、10、20、40、80、160 pg/mL などの複数の濃度勾配を設定します。
4. 希釈した標準試料と試験する血清サンプルをELISAプレートの対応するウェルに100 μL/ウェル加えます。同時に、ブランクコントロールウェルをセットアップし、100 μLのサンプル希釈液を追加します。
5. ELISAプレートを37°Cのインキュベーターに1〜2時間入れて、抗原と抗体が完全に結合できるようにします。
6. インキュベーションが終わったら、ウェル内の液体を慎重に吸引します。ELISAプレートを洗浄液で3〜5回洗浄します。洗浄のたびに、ELISAプレートを軽くたたいて乾かし、残留洗浄液を取り除きます。
7. 酵素標識抗体作業溶液をウェルあたり100 μL添加します。37°Cのインキュベーターで1時間インキュベートを続けます。
8. 上記の洗浄手順を繰り返し、3〜5回洗浄し、ELISAプレートを軽くたたいて乾かします。
9. 各ウェルに100 μLの基質溶液を加えます。振ってやさしく混ぜます。透明な青色が現れるまで、37°Cの暗所で15〜30分間インキュベートします。
10. 各ウェルに100 μLの終端溶液を加えて反応を停止します。青から黄色への色の変化を観察します。
11. マイクロプレートリーダーを使用して、450nmの波長で各ウェルの吸光度値(A値)を読み取り、データを記録します。
12. 標準の濃度を横軸とし、対応する吸光度値を縦座標として標準曲線を描きます。一般に、多項式フィッティングを使用して、標準曲線の相関係数r²が0.99より大きくなるようにします。
    1. 標準曲線に従って、検査する血清サンプルの吸光度値を標準曲線式に代入して、サンプル中のホルモン濃度を計算します。

6.卵巣組織の収集

1. まだ麻酔をかけたマウスを頸部脱臼によって安楽死させ(施設で承認されたプロトコルに従って)、手術用ハサミを使用してマウスの腹部を開きます。
2. 卵巣は腎臓の下にあり、白い脂肪パッドで包まれています。鉗子で脂肪パッドをそっと持ち上げて、卵巣と卵管を露出させます。はさみを使用して卵巣を周囲の結合組織から分離します。
3. 除去した卵巣組織を4%パラホルムアルデヒドに入れ、24時間固定します。

7. パラフィン切片の調製

1. 脱水:卵巣を取り出し、異なる濃度(75%、85%、95%、100%)のエタノール溶液に順番に通し、各ステップを1時間持続させます。
2. 透明処理:まず、キシレンとエタノールの混合物で卵巣を15分間処理します。次に、キシレンIとキシレンIIにそれぞれ15分間浸漬します。
3. ワックス含浸: 卵巣をキシレンとパラフィンの混合物に浸します。次に、それらをパラフィンI、パラフィンII、およびパラフィンIIIにそれぞれ0.5時間移します。
4. 埋め込み: ワックスを含浸させた卵巣を埋め込み型に入れます。組織の向きを調整します(切断面を下に向けて)。溶かしたパラフィンを型に流し込み、冷まして固めます。
5. セクショニング:ミクロトームを使用してパラフィンブロックを厚さ5μmの切片に切断します。連続切片化を実行し、ブラシでリボンをそっと転写し、水浴に浮かべたときに歪みなく平らに横たわる均一な半透明のバンドを形成するようにします

8. H&E染色

1. 脱ろう:パラフィン包埋切片をキシレンIに10分間浸漬します。次に、切片をキシレンIIに移し、さらに10分間浸します。
2. 再水和: 100% エタノール、95% エタノール、85% エタノール、75% エタノールの異なる濃度の一連のエタノール溶液を順番に切片に通し、それぞれ 5 分間の浸漬時間で通します。最後に、セクションを蒸留水で1分間すすぎます。
3. ヘマトキシリン染色:切片をヘマトキシリン染色液に5分間浸します。セクションを流水で30秒間すすいでください。
4. 分化:切片を1%塩酸-エタノール溶液に1〜3秒間浸漬します。流水で1〜2分間セクションをすすぎます。
5. 細胞質染色:エオシンY溶液に浸漬します(1分)。余分な汚れを濾紙で吸い取ります。
6. 脱水:セクションを一連のエタノール溶液(85%エタノール、95%エタノール、および100%エタノール(2回)に通し、それぞれ5秒の浸漬時間で通します。
7. クリアリング:切片をキシレンIに5分間浸漬します。次に、切片をキシレンIIに移し、さらに5分間浸します。
8. 取り付け:染色部分に中性樹脂を落とします。セクションの上にカバーガラスを慎重に置きます。
9. 卵胞カウント:染色された切片を顕微鏡で観察します。さまざまな発達段階の卵胞の数を数えて記録します。

9. 卵巣組織におけるカスパーゼ-3の免疫組織化学

1. 抗原回収:脱ワックスおよび再水和した切片をクエン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.0)に入れます。電子レンジでセクションを高出力で5分間加熱します。次に、取り出して冷まします。
   1. 加熱プロセスをさらに2回繰り返し、合計3回加熱します。自然冷却後、切片をPBSで3回、毎回5分間洗浄します。
2. 内因性ペルオキシダーゼの除去:3%H₂O₂を切片に滴下添加します。切片を室温で暗所で10分間インキュベートします。切片をPBSで3回、毎回3分間洗浄します。
3. 血清ブロッキングおよび抗体インキュベーション:ウサギ抗カスパーゼ-3一次抗体を切片に滴下添加します。切片をウェットボックス内で4°Cで一晩インキュベートします。翌日、切片を室温に戻して30分間待ちます。切片をPBSで3回、毎回5分間洗浄します。
4. 発色、対比染色、および実装:発色にはDABを使用しますが、通常約1〜5分かかります。ヘマトキシリンで切片を2分間対比染色します。対比染色後、切片を5分間洗浄します。
   1. 次に、セクションをアンモニア水に1分間入れて青色にします。最後に、エタノールの勾配による脱水を行い、セクションをクリアして取り付けます。

結果

POIマウスモデルを確立するプロセスを 図2に示します。マウスの体重と発情周期は、薬物注射の初日から記録されました。CTX注射15日後、POI群のマウスの平均体重減少率(3.717%±1.463%)は、BLANK群(0.2526%±0.1469%)およびNS群(0.4305%±0.2494%)よりも有意に高かった(p < 0.0001)。NS群とBLANK群の間で体重に統計的に有意な差はありませんでした(p > 0.05)。(図3A)。

マウスの発情周期は、膣剥離細胞塗抹標本に基づいて監視されました。結果は、POI群のマウスの発情周期が乱れており、膣剥離細胞の長引く排痛または継続的な不規則な変化として現れることを示しました。発情周期の規則性には、BLANK群とNS群の間で有意差はなかった。通常、マウスの発情周期は卵胞の連続的な発達、成熟、排卵に依存しています。したがって、発情周期の混乱は卵巣機能障害を直接反映していま...

ディスカッション

卵巣早期機能不全 (POI) は女性の身体的健康と生活の質に深刻な影響を及ぼしており、その世界的な有病率は年々増加しています。しかし、現時点では、POI の安全で効果的な治療法がまだ不足しています。信頼性が高く再現性のある動物モデルを確立することは、POI の研究を進めるために非常に重要です。臨床的には、POI の原因は多様であり、化学療法薬は重要な既知の病原性因子です⁸。アルキル化剤の化学療法薬として、CTX は主に酸化ストレスと顆粒膜細胞のアポトーシスを通じて卵巣毒性を引き起こし、濾胞閉鎖症の加速を引き起こします⁹。アルキル化剤シクロホスファミドを使用して動物モデルを構築すると、化学療法による卵巣損傷をシミュレートできるため、POI 研究の的を絞ったものになります。

既存の研究では、シクロホスファミドのさまざまな注射レジメンがあります。例えば、雌のICRマウスに、50mg/kg CTXを14

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4%パラホルムアルデヒド	サンゴンバイオエンジニアリング株式会社	A500684-0500
アルコール度数75%	山東徳新康医療技術有限公司	200603
無水エタノール	蚌埠化学試薬工場
遠心分離管	バイオシャープ	BS-15-M
コールドテーブル	クアンリンメディカル	QL-LT20230003
コットンボール	山東ブリリアンス株式会社	20241008
カバースリップ	江蘇石泰実験装置有限公司	80312-3412
シクロホスファミド	バクスターオンコロジーGmbH	3K645A
脱水	湖北省小感海国医療技術有限公司	KH-TS
染色機	湖北省小感海国医療技術有限公司	KH-S101
EA50染色液	湖北泰康医療機器有限公司	J7EC20
イヤータグプライヤー	深センRuiwodeライフサイエンスアンドテクノロジー	C22002-10
パラフィンの効率的な切片化	桐郷華凌ワックス工業有限公司	20241018
電気ブラスト乾燥炉(オーブン)	上海Yuejin医療機器有限公司	HCZF-11
電気加熱式サーモスタットウォーターインキュベーター	上海Yuejin医療機器有限公司	HSW-600型
埋埋機	Prisstar 常州医療機器有限公司	PMB-A
エオシン染色	シーウェルバイオテクノロジー株式会社	G1005-2
ヘマトキシリン分化液	シーウェルバイオテクノロジー株式会社	G1039-500ML型
ヘマトキシリン染色液	シーウェルバイオテクノロジー株式会社	G1005-1
イソフルラン	山東アンテ畜産技術有限公司	2024101501
顕微鏡	安徽嘉尚バイオテクノロジー株式会社	SQS-12P
マウス抗ミュラー管ホルモン(AMH)ELISAキット	恒源バイオテクノロジー	HB1334-ミュー
マウスエストラジオール(E2)酵素結合免疫測定キット	恒源バイオテクノロジー	HB975-ミュー
マウス卵胞刺激ホルモン(FSH)ELISAキット	恒源バイオテクノロジー	HB967-ミュー
ニュートラルガム	南昌玉露実験装置有限公司	240504
病的組織漂白装置	Prisstar 常州医療機器有限公司	PHY-III型
PBSバッファー	バイオシャープ	BL302A型
ピペットチップ	バイオシャープ	BS-10-T
ピペット	ダロン医療機器株式会社	YE213AT0257922
急速組織脱水機	湖北省小感海国医療技術有限公司	KH-TS
スライサー	ゲディ	YD-315
スライド	江蘇石泰実験装置有限公司	80312-3161
塗抹機	湖北泰康医療機器有限公司	131001305
塩化ナトリウム注射	武漢濱湖双河製薬有限公司	240525K04
注射器	江蘇Zhiyu医療機器有限公司
振動スライサー	上海智信計器有限公司	ZQP-86
キシレン	天津開通化学試薬有限公司	20240102