マルチプレックスリアルタイム蛍光PCRによる黄色 ブドウ球菌 およびメチシリン耐性 黄色ブドウ球菌 の迅速検出

Summary

このプロトコルは、SA特異的nucおよびMRSA mecA遺伝子を標的とするプライマー/プローブを使用したマルチプレックスリアルタイムPCRを使用します。これにより、ヒト喀痰サンプル中のSA/MRSA核酸を迅速(<1時間)定性的に検出することができ、培養ベースの方法の限界を克服します。

Abstract

黄色ブドウ球菌 (S.aureus) は、局所的な表在性病変や食中毒から致命的な全身感染症に至るまで、さまざまな臨床症状を呈する、市中感染および院内感染を引き起こす一般的なグラム陽性ヒト病原体です。抗生物質の発見により死亡率は大幅に低下しましたが、その後、薬剤耐性の問題はますます顕著になっています。1960 年に MRSA が初めて同定されて以来、この株は世界的な公衆衛生上の脅威として浮上しています。MRSAは院内感染の主要な病原体であり、心内膜炎、慢性骨髄炎、肺炎、化膿性関節炎、菌血症などのさまざまな重篤な疾患を引き起こす可能性があります。したがって、 黄色ブドウ球菌 とその薬剤耐性を迅速かつ正確に検出することは、臨床治療を導くために非常に重要です。

黄色ブドウ球菌とMRSAの現在の日常的な検出方法には、重大な制限があります。何十年にもわたって「ゴールドスタンダード」として機能してきた従来の細菌培養法は、決定的な種の同定と薬剤感受性の結果を提供できますが、プロセスには時間がかかり、48〜72時間かかります。さらに、この方法は汚染を受けやすく、専門の実験施設と熟練した技術者に依存している。血清学的検査は、患者の血清中の黄色ブドウ球菌抗体を検出することで非侵襲的診断を実現しますが、活動性感染症と過去の感染症を区別することはできず、薬剤耐性株(MRSAなど)を特定することもできません。

この研究は、上記の制限を克服するための新しいマルチプレックスリアルタイム蛍光PCR検出法の開発に焦点を当てています。この方法は、 黄色ブドウ球菌 の種特異的nuc遺伝子とメチシリン耐性を媒介するmecA遺伝子を標的とする特異的プライマーとTaqMan蛍光プローブを設計し、単一の反応システムで 黄色ブドウ球菌 とMRSAの同時増幅と検出を可能にします。この技術により検出時間が大幅に短縮され、 黄色ブドウ球菌 およびMRSAの検出に迅速、正確、かつコスト効率の高いソリューションが提供されます。この革新的なアプローチにより、臨床診断効率が大幅に向上し、標的抗生物質療法の早期実施が容易になり、薬剤耐性細菌感染症の制御に重要な貢献をします。

Introduction

黄色ブドウ球菌は、健康な人の鼻粘膜にコロニーを形成する広範なグラム陽性条件付き病原体です ^1,2。宿主免疫が損なわれると、局所的な皮膚感染症、深部組織の浸潤、または全身性疾患(肺炎、心内膜炎、骨髄炎、菌血症^{など)を引き起こす可能性があります}3。半合成ペニシリンであるメチシリンは、1959年に黄色ブドウ球菌感染症に臨床的に適用され、その2年後には英国でMRSAが出現し、デンマーク、フランス、スイスなどのヨーロッパ諸国に急速に広がりました⁴。β-ラクタム系抗生物質に対するMRSA耐性は、臨床管理を複雑にするだけでなく、感染リスクを大幅に高めます⁵。制御不能なコロニー形成/広がり、高額な予防コスト、抗生物質の過剰使用など、複数の要因が総合的に MRSA 感染率を押し上げています⁶。MRSA感染は、その急速な感染と複雑な耐性メカニズムにより、高い致死率と関連しており^、EU諸国では年間約150,000人の症例と>7,000人の死亡が報告されています7。CHINETのサーベイランスデータによると、中国におけるMRSA感染率は過去5年間、30%を超えて推移しています⁸。院内交差感染のリスクが高いため、公衆衛生上の負担がさらに増大し、医療システムに負担がかかります ^9,10。したがって、効率的かつ正確なMRSA迅速検出技術の開発は、早期診断、個別化治療、死亡率の低下、伝播連鎖の遮断を達成するために臨床的に緊急です。

黄色ブドウ球菌とMRSAの現在の検出技術は、表現型検出、ゲノム検出、トランスクリプトーム検出、プロテオミクス検出、質量分析技術、バイオインフォマティクスベースの分析など、複数の分野にまたがっています¹¹。

ディスク拡散法 (KB 法) や最小阻害濃度法 (MIC 法) などの表現型検出方法は、臨床検査基準協会 (CLSI) および欧州抗菌薬感受性試験委員会 (EUCAST) によって「ゴールド スタンダード」として推奨されています。これらの方法には、特殊な機器が不要であるという利点があり、耐性スペクトルの監視や疫学調査に広く使用されています。しかし、それらの欠点も明らかです:長い培養期間(24時間以上)、およびいくつかの新しい抗生物質のKB法の結果はMIC値による検証を必要とし、ブレークポイント株の結果はヒューマンファクターの影響を受けやすい^12,13。

従来のPCRは、ゲノムレベルの検出法の中でも、高感度で特異性が高いという特徴があり、耐性の予備判断と実験時間の短縮を低コスト・高効率で実現します。しかし、その限界は、既知の耐性遺伝子のみを検出でき、特殊な機器に依存することにあります¹⁴。微生物耐性のメカニズムは非常に複雑であるため、未知の耐性表現型をカバーし、迅速な同定を可能にする技術的手法を開発することが重要です。新しいGoPhAST-R(RNA検出による遺伝子型と表現型ASTの組み合わせ)技術は、mRNA発現レベルを検出することにより耐性表現型を決定し、複数の病原体にわたる異なる耐性関連遺伝子の同時検出を可能にし、実験ターンアラウンドタイムを短縮し、機械学習と組み合わせると94〜99%の精度を達成します¹⁵。

プロテオミクスレベルの検出法の中で、PBP2aラテックス凝集法は抗原抗体特異的結合に基づいており、操作が簡単で結果が迅速で、MRSAに対して高い特異性と感度を持っています。ただし、異なる種のブドウ球菌を区別することはできず、市販キットの検出感度はいくらか低下しているため、オキサシリン⁸ による導入後に再検査する必要があります。

DOT-MGA(DNA Oligonucleotide Tag-Microarray Detection of Genomic Amplification)法などのMALDI-TOF MSベースの検出法は、6〜8時間のインキュベーションで最適な分析性能を達成し、検出率は96.4%と高く、感度と特異度の両方が100%です。しかし、コストが高く、ターゲットプレート上の位置が限られているため、数百のサンプルを同時に検出することが困難になります^16,17。

バイオインフォマティクス解析技術とオミクスデータを組み合わせた耐性予測技術の中でも、全ゲノムシークエンシング技術は、その高分解能と包括的な情報解析能力で際立っています。Resfinderなどの耐性遺伝子解析データベースと組み合わせることで、株が特定の耐性遺伝子を持っているかどうかを分析し、耐性の可能性を予測し、一塩基多型(SNP)および耐性関連遺伝子変異体を検出しながら、全ゲノムデータの保存と再分析をサポートできます¹⁸。ただし、この方法はバイオインフォマティクスのバックグラウンドを持つ専門家による操作が必要であり、日常の検査で使用されることはめったになく、病原体の疫学分析や分子サーベイランスに一般的に使用されています¹⁹。

前述の方法論は、コストが高く、時間がかかるか、まだ研究開発段階にあります。臨床的には、「即時性」と「正確性」のバランスをとるソリューションが緊急に必要とされており、新しいマルチプレックス蛍光PCR技術は、1本のチューブでnuc/mecA遺伝子を同時に増幅し、検出サイクルを1時間に圧縮することで、このギャップを埋めます。これは、従来の「緊急スクリーニング - 耐性タイピング」プロセスの時間枠のギャップを正確に埋め、院内感染の予防と制御のためのより時間効率の高い分子診断ツールを提供します。この特異的なPCRアッセイは、主に呼吸器検体の検出に利用され、典型的な例として喀痰検体があります。抗菌剤の影響を受けず、500コピー/mLの感度と高い特異性を示します。これらの良好な性能特性により、この PCR アッセイは、気道感染症の診断および MRSA によって引き起こされる院内感染の監視に大きな応用価値を持っています。

Protocol

この研究は、広東省人民病院の倫理委員会によって承認されました (倫理番号: KY2025-510-01)。この研究で使用した材料(試薬、化学薬品、機器、およびソフトウェア)に関する詳細情報は、 材料表に記載されています。

1. 検体採取と保存のプロトコル

1. 包含基準:品質管理材料を除き、ゴールドスタンダード法(培養ベースのアッセイ)を使用して、収集されたすべてのサンプルを陽性検体として識別します。
2. 人間の喀痰収集
   1. 滅菌サンプリングチューブを使用して、被験者の下気道から1〜3mLの深い咳をした痰を収集します。すぐにチューブを密封し、分析のために輸送します。テストのためにサンプルをすぐに処理します。
3. 検体の保管:
   1. 上記の方法で採取したサンプルを速やかに分析してください。短期保管は、次の条件で許可されます。
      2-8°C:≤7日
      -20°C±5°C:≤6ヶ月
      -70°C±5°C:≤24ヶ月
      注:この研究では、喀痰サンプルは防腐剤(BHIブロス+グリセロールなど)で処理されませんでした。採取後は上記の条件で保管し、凍結・解凍を繰り返すことは厳重に避けた。凍結融解サイクルを繰り返さないでください。最大許容凍結融解サイクル:≤3。

2. 核酸抽出

注意: 汚染を避けるために、バイオセーフティキャビネット内のすべての手順を完了してください。

1. 喀痰サンプルの前処理では、サンプルを4%NaOH溶液と1:4の比率で混合し(喀痰サンプル:4%NaOH溶液)、粘性のある喀痰検体を液化し、干渉する不純物を除去し、徹底的にボルテックスし(30秒)、室温(22〜25°C)で30分間インキュベートして液化します。
2. 核酸抽出試薬の調製
   1. キットからパッケージ化された96ウェルプレートを取り出します。96ウェルプレートを軽くフリックして、試薬と磁気ビーズを96ウェルプレートの底に濃縮します。
   2. 液体が飛び散らないように、96ウェルプレートを振動させないように、アルミホイルシールフィルムを慎重に剥がします。
   3. 96ウェルプレートのカラム1およびカラム7の溶液中:最初に20 μLのプロテイナーゼKを加え、次に200〜300 μLのサンプルを抽出します。
3. 自動核酸抽出(磁気ビーズ法)
   1. サンプルを追加したパッケージ化された96ウェルプレートを、自動核酸抽出装置の対応するスロットに入れます。
   2. 以下に説明するように、核酸抽出プロセスに従ってください。
      1. ラボチャンバーのマグネットスティックを使用して、核酸で吸着された磁気ビーズをさまざまな試薬穴に移します。
      2. 撹拌セットを使用して液体を急速かつ繰り返し混合し、液体と磁気ビーズが均一に混合されるようにします。
      3. 液体ビーズと磁気ビーズが調和して結合すると、自動核酸抽出機は、細胞溶解、核酸吸着(70°C、15分、磁気吸着の3回)、洗浄(3回、毎回2分間混合、次に磁気吸着を2回(各15秒)行い、溶出(2回、毎回5分間混合、 磁気吸着の3倍)、最終的には高純度の核酸が得られます。
      4. 分光光度計を使用して核酸濃度と純度を検証します。核酸サンプルの量は50 μLで、濃度は50〜100 ng / μLの範囲で、A260 / A280比は1.8±0.2でした。
   3. プログラム終了後、核酸を含む溶出液を列6および列12から直接吸引し、その後の検査を行います。必要に応じて、抽出した残りの核酸サンプルを-20°Cで保存し、長期保存および将来の使用のために保存します。

3. 黄色ブドウ球菌 核酸とMRSA核酸のqPCR検出

1. 増幅試薬の調製
   1. キットから核酸増幅反応液とnuc/mecA反応液を取り出します(黄色ブドウ球菌の場合はnuc遺伝子特異的プライマー/プローブ、MRSAの場合はmecA)。22〜25°Cで解凍した後、完全に振動させて均一に混合し、瞬間遠心分離(~6000 g、15秒、22〜25°C)を行います。
   2. 検査するサンプルの数 N に応じて、N+2 の総量に基づいて試薬を調製します (N はサンプル数、2 は陰性と陽性の品質管理です)。具体的な手順は次のとおりです。
      1. 反応系ミックス(16 μL核酸増幅反応溶液(バッファー、dNTP、DNAポリメラーゼ、UDG酵素)+ 4 μL nuc/mecA反応溶液(標的検出遺伝子nuc、mecA、およびGAPDH内部リファレンスのプライマーおよびプローブ)を調製します。
      2. 適切なサイズの遠心分離管に入れ、完全に振動させて均一に混合し、瞬時遠心分離(~6000 g、15秒、22°C-25°C)を行います。次に、チューブあたり20 μLをPCR反応チューブに分注します。
2. 核酸と品質管理サンプルを追加します。
   1. 上記で調製したPCR反応チューブ(20 μL)に、それぞれ試験サンプル、ポジティブコントロール、ネガティブコントロールから5 μLの核酸を加え、チューブあたり25 μLの最終容量を達成します。
   2. チューブにしっかりとキャップをし、瞬間遠心分離(~6000 × g、15秒、22-25°C)を実行してから、チューブをPCR装置に入れます。
3. PCR増幅:
   1. サイクリングプログラムを次のように設定します。事前変性:97°C、90秒、1サイクル。次の2つのステップを42サイクルで行います:97°C変性2秒、55°Cアニーリング15秒。
   2. 蛍光シグナル検出パラメータを次のように設定します。 nuc 遺伝子のFAM蛍光標識を使用します。 mecA 遺伝子のVIC蛍光標識;キットの内部対照としての GAPDH 遺伝子の CY5 蛍光標識。55°Cでデータを収集します。 反応が完了したら、将来の分析のためにデータが保存されていることを確認してください。
   3. qPCR専用ソフトウェア(SLAN 96P)を使用してデータを分析します。
      1. サンプル情報:ソフトウェアのウェルプレートレイアウト図で、サンプルローディング位置に対応するサンプルタイプ(ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、未知サンプル、内部参照遺伝子など)にラベルを付けます。
      2. 反応チューブの配置:装置の加熱モジュールの蓋を開け、密封されたPCRプレート/チューブを内部にしっかりと置き、加熱モジュールに密着することを確認し、モジュールの蓋をしっかりと閉めます(温度ムラを避けるため)
      3. 反応の開始:ソフトウェアのプログラム設定が正しいことを確認したら、[ 実行の開始] をクリックし、後で参照できるように実験IDを記録します。
      4. 実行の停止とチューブの取り外し:プログラムの実行が終了したら、加熱モジュールの温度が50°Cを下回るのを待ってから、蓋を開けてPCRプレート/チューブを取り外し、サンプルを適切に取り扱います。
4. データ分析
   1. データ分析の前に、次の 3 つの視覚的結果を確認します。1) すべてのサンプル (内部コントロールを含む) の増幅曲線は典型的な S 字型を示し、平坦または異常に遅延した上昇曲線はありません。2)蛍光閾値線が曲線の指数位相を横切り、内部対照(GAPDHなど)のCt値は≤38サイクル以内(変動係数<5%)です。3) 汚染の可能性を監視するために、実験全体を通してネガティブ/ポジティブコントロールが含まれます。
      1. 実験が制御不能な場合は、バッチ全体を再確認します。サンプルに異常な増幅(非定型Sカーブや臨界範囲内のCt値など)が見られる場合は、その特定の検体を再確認してください。
   2. ソフトウェアで実験データを呼び出し、閾値とベースラインを設定し、装置がベースライン閾値を自動的に選択するため、Ct値を自動または手動で計算します。最終的な正の決定値を Ct ≤ 36 に設定します。内部参照遺伝子の参照範囲には、Ct ≤ 38が必要です。それらの増幅曲線が特徴的なS字型プロファイルを示していることを確認します。

Results

qPCRを用いた黄色ブドウ球菌とMRSAの検出
黄色ブドウ球菌の種特異的nuc遺伝子とMRSAのmecA薬剤耐性遺伝子に基づいて、qPCR検出用の異なる蛍光色素で標識されたプライマーとプローブを設計しました。qPCR実験全体を通してのすべての品質管理結果は一貫して推奨閾値内に収まり、検出結果の信頼性が確認されました(図1)。

この研究では、アッセイキットの感度(検出限界)、精度、および陽性/陰性の一致率を検証しました。

検出限界(LOD):低存在量の核酸を検出するキットの能力を評価するために、500コピー/mLの品質管理材料に対して8回の反復試験を実施しました。結果は、nucのCt値が33.56から34.69の範囲で、mecAが34.33から35.35の範囲であることを示しました。すべての増幅プロットは、効率的な指数関数的増...

Discussion

メチシリン耐性の正確かつ早期の検出は、 黄色ブドウ球菌によって引き起こされる感染症の予後にとって重要です。 黄色ブドウ球菌 とMRSAを早期に同定することで、広域抗生物質の誤用を減らし、細菌耐性の出現と拡大につながる選択圧を低下させることができます。

セフォキシチンディスク拡散などの従来の表現型検出法は、18〜24時間の培養期間を必要とし、ヘテロ耐性株に対して高い偽陰性率を示すため、重度の感染症の迅速な診断ニーズを満たすことが困難になります²⁰。リアルタイム蛍光 PCR 技術の出現により、病原体同定は表現型依存性推論から直接遺伝子型検出への移行が進みました。標的核酸配列の特異性の高い認識により、耐性遺伝子の迅速なタイピングを可能にし、正確な臨床管理のための分子基盤を提供します。

PCR技術はMRSA検出に長い間適用されており、マルチプレックスPCRはMRSA検出の重要な方法にな...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
自動核酸抽出器	DAANさん	スマート32	DNA抽出用
BSC-1500IIA2-X	バイオベース	セダ20143222263	バイオセーフティキャビネット
E-遠心分離機	ウィールテック		チューブの壁から残留液体を遠心分離します
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌薬剤耐性遺伝子検出キット	ボジエ	ZC-HX-38-2	メチシリン耐性黄色ブドウ球菌耐性遺伝子の検出
核酸抽出キット	ボジエ	TQ-BG-001-96B	核酸を抽出する
SLAN 全自動医療用PCR分析システム	ホンシ		データ分析
SLAN-96S リアルタイムPCR装置	ホンシ	スラン-96S	蛍光定量PCR増幅
サーモサイエンティフィックナノドロップ	サーモサイエンティフィック	ナノドロップワン	DNA、RNA、タンパク質の定量分析
超低温冷凍庫(DW-YL450)	メリング	セダ20172220091	-20 & 度;試薬を保管するためのC
ボルテックス-5	キリンベル		混合試薬用