酵母細胞におけるストレス後生存を定量化するためのフローサイトメトリーと組み合わせた最適化されたLIVE/DEADアッセイ

サマリー

ここでは、酵母サンプルにおけるストレス後の生存を定量化するためのプロトコルを提示します。このアッセイでは、原形質膜の完全性を定量するために、SYTO 9 とヨウ化プロピジウム (PI) の 2 つの蛍光色素を使用します。フローサイトメトリーを使用して、酸化ストレス後サンプルの生細胞、死細胞、損傷細胞画分の定量的かつ再現性のある推定値を提供します。

要約

生存率の定量化は、酵母研究において一般的かつ重要なタスクです。原形質膜の完全性に基づくLIVE/DEAD染色は、フローサイトメトリーと組み合わせることで、酵母の生存のための迅速かつハイスループットなアッセイを提供します。ただし、染色バッファー、色素濃度、インキュベーション時間、フローサイトメトリー設定のばらつきは、データの品質と再現性に影響を与える可能性があります。このプロトコルは、フローサイトメトリーを使用した酵母のストレス後生存定量のための標準化されたLIVE/DEADアッセイを提示します。日和見酵母病原体である カンジダ・グラブラタを異なる用量の過酸化水素で処理した後、ストレス後のサンプルをSYTO 9とヨウ化プロピジウム(PI)からなる2成分LIVE/DEAD染色で染色しました。フローサイトメトリーを使用して、生細胞集団、損傷細胞集団、死細胞集団を区別し、各サンプル中のそれらのパーセンテージを定量化しました。生きた統計量の割合に基づく生存推定値を、同じサンプルのコロニー形成単位(CFU)の結果と比較しました。2つの方法は、模擬線量および致死線量(1 M H₂O₂)処理されたサンプルで一貫した結果をもたらしました。100 mM H₂O₂の亜致死量では、SYTO 9 / PIはCFUよりも高い生存率を推定し、ここで提示されたプロトコルはストレス直後の細胞生存率を評価し、CFUは回復および繁殖できる細胞の割合を定量化します。したがって、このプロトコルは、細胞死プロセスの初期段階での生存率を測定します。要約すると、ここで説明するプロトコルは、酵母のストレス後生存定量のためのCFUに代わる高速でスケーラブルな代替手段を提供します。その結果は、早期段階での生存を評価し、死んだ細胞と損傷した細胞を区別することにより、CFU に補完的な情報を提供します。

概要

出芽酵母亜門には、多くの重要な生物学的およびバイオテクノロジーモデルが含まれています。酵母研究における一般的かつ重要なタスクは、ストレスや薬物治療を含む遺伝的または環境的摂動の影響を定量化することです。たとえば、工業発酵では、生産者は発^{酵プロセスの効率}と品質を確保するために酵母培養の生存率を監視する必要があります^1,2。病原性酵母種を研究する場合、抗真菌耐性などの感染関連形質の遺伝的および機構的基盤を理解するには、ストレスまたは抗真菌治療後の生存率を測定することが重要です。カテーテルと表面の生存率を測定することも、臨床現場で重要なタスクです³.これらの多様なシナリオはすべて、薬物治療とストレス治療の結果を迅速かつ正確に測定できる定量的アプローチを必要とします。

上記の目標を達成するための既存の方法は、測定対象に基づいて 3 つの主要なカテゴリに分類されます。最初のカテゴリーは、 クローノゲン性、つまりストレス後に個々の酵母細胞が単一のコロニーを形成する能力を測定します。このカテゴリの代表的な方法は、コロニー形成ユニット(CFU)アッセイです。2番目のカテゴリ は、生細胞の酵素活性の検出に依存する活力を測定します。例としては、FUN-1色素⁴などの化学プローブが挙げられる。3番目のカテゴリーの方法は、原形質膜の完全性を測定します-原形質膜の完全性の不可逆的な喪失は、細胞死の「後戻りできないポイント」と見なされ^ます5。このカテゴリの例には、ヨウ化プロピジウム (PI) などの蛍光色素が含まれます。

この研究は、ストレス処理後の酵母生存の迅速かつスケーラブルな定量を達成するために、フローサイトメトリーと組み合わせた最適化されたLIVE/DEADアッセイを提示します。この膜透過性ベースのアッセイはCFUよりも高速で、コロニーが形成されるまでのインキュベーションに24〜48時間かかるのに対し、染色には15〜30分かかります。また、LIVE/DEAD染色で染色されたサンプルは、数秒で数万個の細胞を測定し、ハイスループットアッセイのために96ウェルサンプルを簡単に処理できる顕微鏡法に加えて、フローサイトメトリーを使用して容易にアッセイできます。その結果、このアッセイは迅速、定量的、かつスケーラブルです。このプロトコルでは、SYTO 9とPIからなる2成分LIVE/DEAD染色を使用して、強化された分解能を実現します。SYTO 9は、生体または死体を問わずすべての細胞に標識しますが、PIは原形質膜が損なわれた細胞にのみ侵入します^6,7。したがって、生細胞はSYTO 9のみを蓄積し、死細胞はSYTO 9とPIの両方を蓄積します。PIは核酸に対してSYTO 9よりも高い親和性を持っているため、細胞⁸で後者を競合的に除外します。また、2つの色素はフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)ペアを形成し、SYTO 9の放出は励起としてPIに吸収されます。その結果、死んだ細胞は落ち着いた緑色と強い赤色の蛍光を示します。対照的に、生細胞は明るい緑色の蛍光^{を示します8。}この違いにより、各グループ内の蛍光強度の変動が存在する場合に、生細胞と死細胞の区別が容易になります。

2004年に酵母への応用が最初に報告されて以来、酵母研究におけるSYTO 9 / PIの使用はむらがあり、顕微鏡7,9,10,11,12,13,14,15を使用した定性的評価に大きく限定されています。酵母生存の定量的アッセイとしての採用における主な制限は、体系的な特性評価と、CFU などの広く使用されている方法との比較が欠如していることです。このプロトコルは、染色バッファー、色素濃度、染色時間、およびフローサイトメトリー設定を含む標準化されたアッセイを記述しており、これらは、C. glabrataおよび他の2つの酵母種に適用すると、アーティファクトを最小限に抑え、再現性のある結果を生成することがわかりました¹⁶。SYTO 9/PI染色は、染色パターンが生細胞と死細胞の両方とは異なる中間の「損傷した」細胞集団を明らかにするため、酵母細胞に対するストレス処理の影響に関するより微妙な情報を明らかにすることでCFUを補完することができ、新しいアプリケーションを可能にする可能性があります。

プロトコル

この研究で使用した試薬と機器の詳細は 、材料表に記載されています。

1. 過酸化水素応力の適用

1. 実験の少なくとも前日に、 C.glabrata の一晩培養物を、縞模様を塗ったばかりのプレート上の単一コロニーから3 mLの合成完全(SC)培地(1.7 g / L酵母窒素塩基、完全アミノ酸混合物、2%w / vグルコース、水)に接種し、ガラス管をローラードラムに入れて培養し、30°Cで増殖させます。 あるいは、ガラス管を斜めに置き、培養物を200rpmで振とうことで、オービタルシェーカーを使用することもできます。
   1. 翌朝、一晩培養物の光学密度(OD₆₀₀)を測定し、新鮮なSC培地で総容量10 mLでOD₆₀₀ ~0.2に希釈します。中間対数(OD₆₀₀ ~1)段階に達するまで、約4時間かかる2倍の間成長させます。
      例:オーバーナイト培養のOD₆₀₀ = 10の場合、この培養物200 μLを9.8 mL SC培地に加えます。
2. ストレス処理の30分前までに、過酸化水素ストレス媒体を準備します。過酸化水素を30%ストック(9.798 M)から合成完全(SC)培地に所望の濃度まで連続希釈します。模擬治療(過酸化水素を添加していないSC)と致死量( C.glabrataには1 Mが適しています)を含めます。
   例:100 mMの過酸化水素ストレス培地を作るには、10.3 μLの9.798 M過酸化水素ストックを1 mL SCに加えます。ピペットで穏やかに混合します。10 mMの過酸化水素ストレス培地を作るには、500 μLの100 mM過酸化水素ストレス培地を4.5 mLのSCに希釈します。
3. ミッドログ培養のOD₆₀₀ を測定し、SC培地を追加して、たとえばOD₆₀₀ = 1に標準化します。
   例: 中間対数カルチャは OD₆₀₀ = 1.2 です。培養物1 mLあたり0.2 mLのSC培地を加えます。
4. 試験条件ごとに600 μLのミッドログ培養を96ディープウェルプレートに移します。室温で3,000 x g で5分間遠心分離することにより細胞をペレット化します。細胞ペレットを乱すことなく、吸引によって上清を慎重に除去します。
5. ステップ1.2で調製したモックまたは過酸化水素ストレス培地600 μLを各ウェルに加え、静かにピペットで細胞を再懸濁します。
6. プレートを30°Cで120分間インキュベートし、300rpmで振とうします。
   注:インキュベーション時間は、関心のある生物学的問題によって異なります。

2. SYTO 9/PI染色の塗布

1. 実験の前に、少なくとも10 mLの滅菌0.85%生理食塩水バッファーを調製します。
   注:0.85%生理食塩水緩衝液は、脱イオン水または増殖培地と比較して、模擬処理されたサンプルで染色アーティファクト、すなわち染色されていない死んだような細胞を生成することがわかりました¹⁶。
2. 滅菌脱イオン水を使用して、0.2 mMのPIの作業原液を調製します。
   注:このPIの作業ストックは、4°Cで最大6か月間保存できます。
3. 実験の直前に、滅菌脱イオン水で33.4μMの作業SYTO 9ストック溶液を調製します。
   注:実験ごとにSYTO 9作業ストックを新鮮に準備します。保管して再利用しないでください。
4. 静かにピペットで、治療プレートから各ウェルの細胞を混合します。各処理条件のOD₆₀₀ を測定し、細胞をOD₆₀₀ 1に再懸濁するために必要なバッファーの量を計算します。
   注:マルチチャンネルピペットは、効率的で均一な混合に使用できます。サンプルを過剰に混合しないでください。
5. モックまたはストレス処理後に、3,000 x g で5分間遠心分離して酵母細胞を収集します。吸引によって上清を慎重に取り除きます。細胞を滅菌0.85%生理食塩水バッファーにOD₆₀₀ = 1に再懸濁します(ステップ2.4で計算)。
   注:マルチチャンネルピペットを使用して細胞を再懸濁します。処理後のすべての培養物は慎重に取り扱い、過剰混合を避けてください。
6. 各サンプルの50 μLを、未染色および単一色素の染色コントロールとして予約します。
   注:野生型 C.glabrata では、SYTO 9とPIの両方のチャネルで最小限の自家蛍光が見られました。ただし、染色されていないサンプルの自家蛍光を常にチェックし、適切なバックグラウンド減算を実行するか、低自家蛍光増殖培地を使用してください。
7. 0.85%生理食塩水バッファーに再懸濁した16 μLの後処理サンプルを50 μLのPCRチューブにアリコートします。2 μLの0.2 mM作業ストックのPIを細胞懸濁液に加えます。次に、SYTO 9の33.4 μMワーキングストックを2 μLを同じチューブに加え、最終容量は20 μLになります。
   1. PI と SYTO 9 の最終濃度は、それぞれ 20 μM と 3.34 μM になります。穏やかにピペットで混合し、室温で暗所で30分間インキュベートします(ブラックボックスを使用できます)。

3. フローサイトメーターのセットアップと校正

注:これは、新しい装置ごとに、および異なる種/株、新しいストレッサー、または増殖プロトコルなど、SYTO 9 / PI染色の新しいアプリケーションでも行う必要があります。以下の設定は、Attune NxTフローサイトメーターで開発されました。具体的な手順については、使用中の機器のユーザーマニュアルを参照してください。

1. フローサイトメーターに適切な蛍光チャネル/フィルターを選択します:530 nm±30 nmのバンドパスフィルター(BL1)と600 nmのロングパスフィルター(>600 nm、BL3)を使用して、緑(SYTO 9)および赤色(PIおよびSYTO 9)チャネルのシグナルを収集しました。二人とも488nmの青色レーザーで興奮していました。
2. 流量を200 μL/minに設定し、少なくとも30,000のイベントが収集されたら停止します。
   注:サンプルあたりのイベント数は、パーセンテージの堅牢な推定値を達成することを目的として調整できます。イベント(セル)が少なすぎるサンプルは除外する必要があります。次のステップは、初期セットアップ中にFSCおよびSSCチャネルの電圧を調整することです。
3. 16 μLの模擬処理された未染色サンプルを200 μLの滅菌0.85%生理食塩水バッファーに希釈します。フローサイトメトリーの直前に穏やかにピペットで混合します。このサンプルを実行し、FSC チャネルと SSC チャネルの電圧を調整して、母集団が FSC 対 FSC の中心になるようにします。SSC密度プロット。
   注:FSCとSSCには、それぞれ345mVと399mVの電圧が使用されました。次のステップは、初期セットアップ中にコレクション(BL1およびBL3)チャネルの電圧を調整することです。
4. 24 μLの模擬処理サンプルを24 μLの1000 mM過酸化水素処理または熱殺傷サンプルと混合します。
5. 混合された生細胞と死細胞サンプルを、それぞれ16 μLの3本のチューブに分けます。3本のチューブを(1)2 μL SYTO 9および2 μLの水で30分間染色します。(2)2 μLのPIと2 μLの水を30分間。(3)2 μL SYTO 9および2 μL PIを30分間。前のセクションの染色プロトコルに従ってください。
   1. インキュベーション後、200 μLの滅菌0.85%生理食塩水バッファーを各チューブに加えます。これでフローサイトメトリーの準備が整いました。
6. チューブ(1)を動かして、緑色蛍光(BL1)チャネルの電圧を調整します。次に、チューブ(2)を動かして、赤色蛍光(BL3)の電圧を調整します。目標は、各チャンネルの強度分布のモードを~10^{4-10 5} にして、機器のダイナミックレンジをフルに活用することです。
   注意: 電圧を調整するときは、特定のフローサイトメーターの指示に従ってください。一部のフローサイトメーターは電圧が固定されており、このステップは省略されています。
7. チューブ(3)を実行して、生細胞集団と死細胞集団が十分に分離されているかどうかを確認します。必要に応じて、BL1またはBL3チャネル電圧を調整します。
   メモ:Attune NxTのBL1チャンネルとBL3チャンネルの両方に200mVの電圧が使用されました。
8. 確立された電圧設定下で模擬処理された未染色サンプルを実行して、サンプルの目的のチャネルで自家蛍光が最小限に抑えられるようにします(<10²)。

4. フローサイトメーターでのサンプルの実行

1. 上記で確立したフローサイトメーター設定を適用し、最初に未染色サンプルを実行して、BL1チャネルとBL3チャネルの両方で自家蛍光シグナルが10² 未満であることを確認します。
2. 染色した各サンプルに200 μLの0.85%生理食塩水バッファーを加え、フローサイトメーターで実行します。
   注:複数のサンプルをアッセイする場合は、フローサイトメーターで実行する前に、各サンプルが30分間染色されるように染色ステップをずらします。
3. フローサイトメトリー出力を.fcsファイル(FCS 3.0または3.1標準)としてエクスポートします。

5. Rでのデータ分析

注:サンプル分析スクリプトは、 補足ファイル1として提供されています。ゲーティング戦略の例は、代表的な結果セクションに記載されています。

1. 必要なパッケージをインストールしてロードします: (1) flowCore (2) ggplot2 (3) ggcyto。
2. .fcs ファイルを現在の R 環境にインポートします。
3. ファイル名を調整し、処理条件を指定します。
4. FSC上のすべての事象の2D密度プロットを作成します。H 対 SSC.H. ポリゴンゲートを使用して、非セルイベントを除外します。このゲートに「セル」という名前を付けます。
   注:特定のフローサイトメーターでは、高さよりも面積パラメータが推奨されます。機器固有の推奨事項を確認します。
5. 「細胞」ゲート集団の場合、FSCで2D密度プロットを作成します。FSC.Wに対するH通常、2つのクラスターが同様の範囲のFSCで見えます。Hですが、FSC.Wは異なります。平均FSCが低いクラスター。W レベルには、単一セル ("singlets") が含まれます。ポリゴン ゲートを描画して選択し、ゲートに「シングレット」という名前を付けます。
6. 「一重項」ゲート母集団の場合、BL1に2D密度プロットを作成します。BL3 に対する H。H. 生細胞と死細胞のコントロールに基づいて、生細胞、損傷細胞、および死細胞の多角形ゲートを描画します。例は、「代表的な結果」セクションに記載されています。
7. 各母集団の割合を使用して生存率を決定し、統計をエクスポートします。

結果

SYTO 9/PI染色は、緑色(500 nm-560 nm)および赤色(>600 nm)チャネルの蛍光シグナルに基づいて、生きた酵母細胞と死細胞を区別します。SYTO 9のみを蓄積する生細胞は、緑色のチャネルで強く蛍光を発し、赤色のシグナルは最小限に抑えられます。死細胞はSYTO 9とPIの両方を蓄積し、PIとFRETによるSYTO 9の競合的排除により、生細胞と比較して緑色の蛍光シグナルが低く、赤色チャネルで強い蛍光を発することが期待されます。

上記のSYTO 9 / PI染色プロトコルを、酸化ストレスを受けた C.glabrata 細胞に適用しました。対数中期C .グラブラタ 細胞を0 mM、100 mM、および1,000 mM H₂O₂ で2時間処理し、SYTO 9およびPIで染色しました。染色パター...

ディスカッション

このプロトコルでは、SYTO 9とPIの2つの蛍光色素を使用し、フローサイトメトリーを使用して酵母のストレス後生存を定量化するLIVE/DEADアッセイについて説明します。これら2つの染色は、文献でさまざまな酵母種の生存を評価するために適用されており、市販のキットとして入手可能ですが、製造元のマニュアルも文献も、染色プロトコルまたはフローサイトメ^{トリー設定に関する}十分な詳細を提供していません7。ここでは、最適な染色バッファー、色素濃度、染色時間、フローサイトメトリー設定など、アッセイの体系的な特性評価から得られる標準化されたプロトコルを提示します。別の研究で説明されている追加の実験では、このアッセイを多様な酵母種および抗真菌処理などの他のタイプのストレスに適用します¹⁶。したがって、ここで説明するプロトコルは、さらなる検証において、より一般的に有用である可能性があります。

提示されたプロトコルにはいくつかの重要なステップ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96井戸深部井戸板	サーモ・フィッシャー	278606	NUNC 96
プレートリーダー付きAttune NxTフローサイトメーター	サーモフィッシャー A24858	A24858	オートサンプラー(A42901)
Candida glabrata			CG99、臨床分離株由来の実験株(Cormack &Falkow, 1999)
FungaLight 酵母 LIVE/DEAD キット	サーモフィッシャー A24858	L34952	SYTO 9(3.34 mM)およびプロピジウム・ヨウ化物(20 mM)を含みます。これら2つの部品は、さまざまなベンダーから別途購入することも可能です。
過酸化水素	シグマ・オルドリッチ	H1009
ライカ コンフォーカルSP8顕微鏡	ライカ	TCS SP8 X
塩化ナトリウム	シグマ・オルドリッチ	S9888	滅菌済み0.85%NaCl溶液の製造に使用されました
アミノ酸を含まない酵母窒素塩基	シグマ・オルドリッチ	Y0626	2%のグルコースとアミノ酸の混合物を用いた合成コンプリートメディアの製造に使用されました