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研究記事

非小細胞肺癌細胞におけるROS媒介古典的アポトーシス を介したPileostegia tomentella の主要成分の抗癌効果

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DOI:

10.3791/69008

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2025年9月19日

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1International Zhuang Medicine Hospital affiliated to Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Zhuang Medicine, Guangxi University of Chinese Medicine, 3Guangxi Zhuang Autonomous Region Institute of Ethnic Medicine, 4Graduate School of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、非小細胞肺がん(NSCLC)細胞における天然化合物によって誘導される活性酸素種(ROS)を介したアポトーシスを評価する方法を提示する。

要約

この研究では、活性酸素種 (ROS) を介した経路を介して H1299 非小細胞肺がん (NSCLC) 細胞に古典的なアポトーシスを誘導する能力に特に焦点を当て、ピ レオステジア トメンテラの抗がんの可能性を調査します。生物活性誘導単離アプローチを使用して、2 つの活性化合物、ウンベリフェロン (UMB) とエピボゲロシドが主要な細胞毒性成分として同定されました。どちらの化合物も細胞生存率に有意な阻害効果を示し、H1299細胞のアポトーシス細胞死を効果的に引き起こしました。機構調査により、UMB とエピボゲロシドによる治療が細胞内 ROS レベルの著しい増加をもたらし、酸化ストレスが重要なメディエーターであることが示されました。ウェスタンブロット分析により、切断されたカスパーゼ-3のレベルの増加と抗アポトーシスタンパク質Bcl-2の発現の低下が明らかになり、内因性ミトコンドリアアポトーシス経路の活性化が示されました。さらに、トランスクリプトームプロファイリングは遺伝子発現の広範な変化を示し、細胞恒常性の破壊をさらに裏付けました。これらの結果は、 Pileostegia tomentella とその有効成分が肺がんの潜在的な治療薬として期待できることを示唆しています。

概要

がんは、年間死亡率の高さを特徴とする、世界的な公衆衛生上の手ごわい課題となっています。非小細胞肺がん (NSCLC) は、がん関連死亡の主な世界的な要因であり、肺がん発生率の約 85% を占めています1。発がんは、分子プロセスと細胞プロセスの本質的に複雑な相互作用であり、活性酸素種 (ROS) 恒常性の破壊によって重大な影響を受けます。ROSは、スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシルラジカル、過酸化水素などの不安定な酸化剤を含み、正常な細胞代謝の副産物であり、シグナル伝達、増殖、分化、アポトーシスに不可欠な機能を果たします2。ROS濃度の不均衡は酸化ストレスを引き起こし、プログラムされた細胞死経路、特にオートファジーとアポトーシスを活性化する可能性があり、それによってがん細胞の増殖と生存を妨げる可能性があります3。その結果、ROS は腫瘍学において二重の役割を果たし、腫瘍進行のプロモーターとサプレッサーの両方として機能します。過去 10 年間で、NSCLC の治療戦略は大幅に進歩し、ROS のこの二分法的な性質を利用するように設計された新しい抗がん剤の開発は、特に活発な研究分野を表しています4。

アドリアマイシン(ドキソ....

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プロトコル

この研究で使用された試薬と機器は、材料表に記載されています。

1. Pileostegia tomentella の化学組成とNSCLC標的予測

Pileostegia tomentellaの化学成分は、高速液体クロマトグラフィーと線形イオントラップ-Orbitrap質量分析(HPLC-LTQ/MS)を組み合わせて分析しました。抽出物を適切な溶媒に溶解し、注入前にろ過しました。クロマトグラフィー分離は、化合物クラスに合わせたグラジエント溶出プログラムの下で逆相カラムを使用して達成されました。質量分析データは、100〜1500 m/zの質量範囲にわたって正エレクトロスプレーイオン化モードで収集されました。同定された化合物の分子構造は、一般的な化学描画ソフトウェアを使用して描画され、SDF形式で保存されました。これらの構造ファイルは、潜在的な生物学的標的を特定するためにオンライン標的予測ツールに送信され、上位 20 の標的がさらなる検証のために選択されました。NSCLC関連標的は、公的にアクセス可能な遺伝子データベースから取得されました。両方のデータセットからの重複する標的は、Pileostegia tomentellaの潜在的な治療標的とし....

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結果

肺がんに対するPileostegia tomentellaの主要成分のスクリーニング
実験計画の概要を 図1に示します。HPLC-LTQ/Orbitrap MSを使用して、 Pileostegia tomentella に存在する7つの主要な生理活性成分を特徴付けました(表3)。続いて、SwissTargetPredictionデータベース11を用いてこれらの化合物についてインシリコ目標予測を実施し、相互作用確率が0.1を超えるもののみを含むように結果をフィルタリングした。この分析により、260の有望な遺伝子標的が得られました。同時に、NSCLC関連の標的はGeneCardsデータベースから調達されました。比較評価により、予測された化合物標的とNSCLC関連遺伝子との間に59の重複する遺伝子が同定されました(図.......

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ディスカッション

非小細胞肺がん (NSCLC) は、その攻撃的な生物学、急速な臨床進行、および高い転移の可能性を特徴とし、多くの場合、患者の転帰が悪いことを特徴とし、差し迫った世界的な健康上の懸念事項です12。外科的切除、放射線療法、化学療法などの標準的な介入は、初期段階の疾患に治療上の利点をもたらしますが、薬剤耐性の出現と全身毒性の負担により、その有効性は進行した段階で低下します。肺がんの根底にある病因は複雑であり、まだ完全には説明されていません13,14。伝統的な中国医学 (TCM) では、NSCLC は歴史的に、気欠乏、痰の蓄積、毒素形成などの内部の不均衡と関連してきました15,16。これらの概念的枠組みは文化的な洞察を提供しますが、直接的な分子相関関係がないため、この研究のメカニズム的解釈では強調さ.......

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開示事項

著者には宣言すべき利益相反はありません。

謝辞

この作業は、国家漢方薬管理局の漢方薬高レベル重点分野建設プロジェクト - 少数民族薬局 (荘薬局) (No. zyyzdxk-2023165) の支援を受けました。広西チワン族自治区国際荘医療病院の人材育成プログラム「青少年プロジェクト」(第2022001号)。広西チワン族自治区の漢方薬における学際的なクロスイノベーションチームプロジェクト(No.GZKJ2309);広西中医薬大学の高レベル人材育成イノベーションチームプログラム(No.2022A008)。広西チワン族自治区科学技術局の主要研究開発プロジェクト(No.グイ・ケAB21196057);広西国際荘医療病院のハイレベルな人材チーム構築のための2023年3カ年行動計画(第GZCX20231203号、GZCX20231202号)。広西中医薬大学の「岐黄プロジェクト」ハイレベル人材チーム育成プログラムの第3期(第202414号)。

著者の貢献:

Wen Zhong、Leimin Jiang、Bing Qing はこの作品に等しく貢献し、筆頭著者を共有しています。彼らは主に実験計画、データ収集、および結果の解釈を担当しました。Xiumei Maはデータ分析を行い、原稿作成に貢献しました。Shi Xianyi、Deng Qingmei、Zhou Guangyun は、研究....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アネキシンV–PE / 7-AADアポトーシス検出キットBDバイオサイエンス556547フローサイトメトリーによるアポトーシス検出
抗体:BAXアブカムAB32503プロアポトーシスタンパク質のウェスタンブロット
抗体:Bcl-2アブカムアブ182858ウェスタンブロット/免疫蛍光法
抗体:切断カスパーゼ-3アブカムAB32042ウェスタンブロット/ IF
抗体:GAPDHアブカムAB8245ウェスタンブロットの内部制御
抗体:PARP1アブカムAB32064アポトーシスマーカーのウェスタンブロット
抗体:チューブリンアブカムAB78078ウェスタンブロットの内部制御
ケムドローパーキンエルマーインフォマティクスCCG821391低分子の構造図
化学発光イメージングシステムタノンサイエンス&タノンテクノロジータノン 5200タンパク質バンドの可視化用
サイトスケープCytoscape.orghttps://cytoscape.orgネットワーク構築と解析
DAPI核染色シグマ D9542IF用青色核対比染色剤
デビッドNIHのhttps://david.ncifcrf.gov機能アノテーションとKEGG経路濃縮
DMSOのシグマ 
MFCD00002089		ホルマザン結晶の溶解に使用
エタノール(抽出用)シグマMFCD00003568超音波支援抽出溶媒
酢酸エチルシグマMFCD00009171生理活性分画に使用
FITC標識二次抗体アブカムAB6785免疫蛍光法で使用
フローサイトメーターサーモサイエンティフィックA29001アポトーシスとROS検出に使用
蛍光顕微鏡オリンパス株式会社BX53F免疫蛍光スライドのイメージング用
凍結乾燥機株式会社ラブコンコ7670520サンプル凍結乾燥・保存用
ジーンカードワイツマン研究所https://www.genecards.org疾患関連性のための遺伝子データベース
HPLC-LTQ-Orbitrap質量分析サーモサイエンティフィックIQLAAEGAAVFACZMAIKMSによる化合物同定
イルミナ NovaSeq シーケンシングプラットフォームイルミナ株式会社20012850RNA-seqに使用
LDH細胞毒性アッセイキットビヨタイムC0016細胞毒性指標としてのLDH放出測定用
マイクロプレートリーダーサーモサイエンティフィックVL0000D0MTTおよびLDHアッセイの吸光度測定用
MTT細胞生存率アッセイキットビヨタイム C0009S細胞生存率を評価するためのMTTアッセイに使用
qPCR装置サーモサイエンティフィック4485701遺伝子発現解析用
RソフトウェアR財団https://www.r-project.org統計計算と経路プロット
逆転写キット(RTキット)ヴァザイムMR201cDNA合成用
RNA-seqライブラリー調製キットイルミナ株式会社20020594シーケンシングのためのライブラリー調製
SwissTarget予測スイス研究所http://www.swisstargetprediction.ch複合ターゲット予測ツール
SYBR Green qPCRミックスヴァザイム質問311-02定量PCR用
TRIzol 試薬 (RNA 抽出)シグマ T3934型トータルRNA抽出用
超音波洗浄機ブランソンM1800-CPXH超音波支援抽出用
ウェスタンブロット装置サーモサイエンティフィックA56727ゲル電気泳動とタンパク質転写

参考文献

  1. Fan, D., Yu, S., Yang, Y., Qu, S. Pyoluteorin induces apoptosis and autophagy in NSCLC cells. Biol Pharm Bull. 44 (7), 976-983 (2021).
  2. Cui, Q., et al. Modulating ROS to overcome multidrug resistance in cancer. Drug Resist Updat. 41, 1-25 (2018).
  3. ....

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再版と許可

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ROS介在性アポトーシスアンベリフェロンエピボーゴロシド細胞生存率酸化ストレスミトコンドリアアポトーシス経路ウェスタンブロッティング
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