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研究記事

非小細胞肺癌細胞におけるROS媒介古典的アポトーシス を介したPileostegia tomentella の主要成分の抗癌効果

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DOI:

10.3791/69008

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2025年9月19日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1International Zhuang Medicine Hospital affiliated to Guangxi University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Zhuang Medicine, Guangxi University of Chinese Medicine, 3Guangxi Zhuang Autonomous Region Institute of Ethnic Medicine, 4Graduate School of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、非小細胞肺がん(NSCLC)細胞における天然化合物によって誘導される活性酸素種(ROS)を介したアポトーシスを評価する方法を提示する。

要約

この研究では、活性酸素種 (ROS) を介した経路を介して H1299 非小細胞肺がん (NSCLC) 細胞に古典的なアポトーシスを誘導する能力に特に焦点を当て、ピ レオステジア トメンテラの抗がんの可能性を調査します。生物活性誘導単離アプローチを使用して、2 つの活性化合物、ウンベリフェロン (UMB) とエピボゲロシドが主要な細胞毒性成分として同定されました。どちらの化合物も細胞生存率に有意な阻害効果を示し、H1299細胞のアポトーシス細胞死を効果的に引き起こしました。機構調査により、UMB とエピボゲロシドによる治療が細胞内 ROS レベルの著しい増加をもたらし、酸化ストレスが重要なメディエーターであることが示されました。ウェスタンブロット分析により、切断されたカスパーゼ-3のレベルの増加と抗アポトーシスタンパク質Bcl-2の発現の低下が明らかになり、内因性ミトコンドリアアポトーシス経路の活性化が示されました。さらに、トランスクリプトームプロファイリングは遺伝子発現の広範な変化を示し、細胞恒常性の破壊をさらに裏付けました。これらの結果は、 Pileostegia tomentella とその有効成分が肺がんの潜在的な治療薬として期待できることを示唆しています。

概要

がんは、年間死亡率の高さを特徴とする、世界的な公衆衛生上の手ごわい課題となっています。非小細胞肺がん (NSCLC) は、がん関連死亡の主な世界的な要因であり、肺がん発生率の約 85% を占めています1。発がんは、分子プロセスと細胞プロセスの本質的に複雑な相互作用であり、活性酸素種 (ROS) 恒常性の破壊によって重大な影響を受けます。ROSは、スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシルラジカル、過酸化水素などの不安定な酸化剤を含み、正常な細胞代謝の副産物であり、シグナル伝達、増殖、分化、アポトーシスに不可欠な機能を果たします2。ROS濃度の不均衡は酸化ストレスを引き起こし、プログラムされた細胞死経路、特にオートファジーとアポトーシスを活性化する可能性があり、それによってがん細胞の増殖と生存を妨げる可能性があります3。その結果、ROS は腫瘍学において二重の役割を果たし、腫瘍進行のプロモーターとサプレッサーの両方として機能します。過去 10 年間で、NSCLC の治療戦略は大幅に進歩し、ROS のこの二分法的な性質を利用するように設計された新しい抗がん剤の開発は、特に活発な研究分野を表しています4。

アドリアマイシン(ドキソルビシン)、シスプラチン、シクロホスファミドなどの化学合成抗がん剤は、ROS産生を促進することによりがん細胞のアポトーシスを誘導することが知られています5。標的療法や免疫療法用抗体の進歩にもかかわらず、プラチナベースの化学療法は引き続き NSCLC 患者の治療の基礎となっています。それにもかかわらず、化学療法による耐性と有害な副作用の出現により、新しい抗NSCLC薬の開発が必要になります。その結果、抗がん化合物の天然源を探索することは、その重要性と可能性についてますます認識されています。最近の研究では、特定の植物抽出物とその有効成分が、低毒性、高特異性、および複数の経路を標的とする能力を特徴とする強力な抗がん特性を示すことが強調されています6。特に、これらの天然化合物のいくつかは、ROSレベルとシグナル伝達7を調節し、それによって癌細胞のオートファジーまたはアポトーシスを誘導し、治療効果を発揮します8,9。

ピレオステジア・トメンテラ 手。キンポウシ科のクレマチス属の多年生草本であるズックは、主に日本、北朝鮮、中国などの地域で見られます。根、茎、葉、花などの植物のさまざまな成分は薬効があることで知られており、熱クリアランス、解毒、腫れの軽減、痛みの緩和、抗菌作用や抗炎症作用などの利点があります。最近の研究により、ホシ毛つる抽出物または有効成分の抗がん活性が明らかになり、神経膠腫、乳がん、結腸がん、子宮頸がんなどのさまざまながんに対する腫瘍抑制効果が実証されています10。しかし、 ピレオステジア・トメンテラの特定の抗がんメカニズム、特に ROS を調節してがん細胞のオートファジーまたはアポトーシスを誘導する潜在的な役割は、ほとんど解明されていないままです。

がん治療のための天然化合物への関心が高まっているにもかかわらず、肺がんにおける ピレオステジア・トメントラ の主要成分のアポトーシス促進メカニズムは未解明のままです。この研究は、NSCLC における選択的 ROS 依存性アポトーシス誘導物質としてのウンベリフェロンとエピボゲロシドの同定と機構解剖の先駆者です。

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プロトコル

この研究で使用された試薬と機器は、材料表に記載されています。

1. Pileostegia tomentella の化学組成とNSCLC標的予測

Pileostegia tomentellaの化学成分は、高速液体クロマトグラフィーと線形イオントラップ-Orbitrap質量分析(HPLC-LTQ/MS)を組み合わせて分析しました。抽出物を適切な溶媒に溶解し、注入前にろ過しました。クロマトグラフィー分離は、化合物クラスに合わせたグラジエント溶出プログラムの下で逆相カラムを使用して達成されました。質量分析データは、100〜1500 m/zの質量範囲にわたって正エレクトロスプレーイオン化モードで収集されました。同定された化合物の分子構造は、一般的な化学描画ソフトウェアを使用して描画され、SDF形式で保存されました。これらの構造ファイルは、潜在的な生物学的標的を特定するためにオンライン標的予測ツールに送信され、上位 20 の標的がさらなる検証のために選択されました。NSCLC関連標的は、公的にアクセス可能な遺伝子データベースから取得されました。両方のデータセットからの重複する標的は、Pileostegia tomentellaの潜在的な治療標的として特定されました。

2. コンポーネントターゲットネットワーク構築

予測された標的のタンパク質間相互作用データは、オープンアクセスのタンパク質相互作用データベースから取得されました。相互作用データを一般的なネットワーク可視化ソフトウェアにインポートし、複合ターゲット相互作用ネットワークを構築しました。度の中心性、中間性、近接性などのネットワークトポロジカル特性を、組み込みの分析ツールを使用して分析し、主要な規制ノードを特定しました。

3. KEGG経路濃縮解析

予測された標的タンパク質の機能的濃縮は、公開されている濃縮ツールと統計ソフトウェア を介して KEGG 経路分析を使用して実行されました。調整された p 値が 0.05 未満の経路は有意であると見なされました。重要な経路を化合物標的データと統合し、汎用ネットワーク可視化ソフトウェアを使用して「化合物-標的-経路」相互作用ネットワークを構築しました。ネットワークトポロジー分析により、主要な生物学的調節ハブが浮き彫りになり、 Pileostegia tomentellaの多成分および多標的メカニズムが示されました。

4. ピレオステジア・トメンテラ 成分の抽出

Corydalis spinosaの乾燥したつる茎を微粉末に粉砕しました。粉末材料を70%エタノールで抽出し、室温で一定期間超音波処理した。粗抽出物をろ過し、減圧下で濃縮しました。液液分配は、石油エーテル、酢酸エチル、n-ブタノールなどの極性が増加する溶媒を使用して実行されました。予備アッセイで最も高い生物活性を示した酢酸エチル画分を回収し、濃縮し、凍結乾燥し、さらに使用するまで-20°Cで保存しました。

5. 細胞株と治療条件

ヒト肺がん細胞株H1299を、10%ウシ胎児血清を添加したRPMI1640培地で、5%CO2を含む加湿雰囲気中で37°Cで培養した。細胞を適切な密度で播種し、処理前に一晩接着させました。細胞を、 表1にリストされているように、UMBとエピボゲロシドの2つの試験化合物のさまざまな濃度(500 μg/mL、750 μg/mL、および1,000 μg/mL)に曝露しました。標準培養条件下で24時間インキュベートした後、化合物の生物学的効果を評価するためのその後の分析のために細胞を回収しました。

6. 細胞生存率のMTTアッセイ

化合物の細胞毒性効果は、比色MTTアッセイを使用して評価されました。H1299細胞を定義された密度で96ウェルプレートに播種し、一晩接着させました。次に、細胞を標準培養条件下で試験化合物で72時間処理しました。処理後、MTTの溶液を各ウェルに添加し、インキュベートして、生細胞がMTTを不溶性の紫色ホルマザン結晶に変換できるようにします。インキュベーション後、培地を除去し、ホルマザン結晶をジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解しました。吸光度は、マイクロプレートリーダーを使用して570 nmで測定されました。吸光度値は細胞生存率に対応し、化合物の細胞毒性を定量的に評価します。

7. LDH放出 による 膜の完全性の評価

細胞膜の完全性は、細胞毒性の指標として乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH) 放出を測定することによって評価されました。H1299細胞を試験化合物で24時間、48時間、または72時間処理した。各時点で、培養上清を収集し、製造元のプロトコルに従ってLDH活性アッセイにかけました。LDHは膜が損傷した細胞からのみ放出されるため、測定された吸光度値は、化合物によって時間の経過に伴う膜損傷の程度を反映しています。

8. アポトーシスのフローサイトメトリー解析

アポトーシス誘導は、アネキシン V および 7-アミノアクチノマイシン D (7-AAD) 染色を使用したフローサイトメトリーによって評価されました。試験化合物による処理に続いて、H1299細胞を遠心分離によって収集し、冷たいリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、結合バッファーに再懸濁しました。次に、細胞を蛍光色素および7-AADに結合させたアネキシンVと染色プロトコルに従ってインキュベートした。サンプルは直ちにフローサイトメトリーで分析されました。この方法により、生細胞(未染色)、初期アポトーシス細胞(アネキシンV陽性、7-AAD陰性)、および後期アポトーシスまたは壊死細胞(両方の染色で陽性)の間の分化が可能になりました。

9. 細胞内ROS定量化

細胞内活性酸素種 (ROS) レベルは、蛍光ベースのアッセイを使用して測定されました。H1299細胞を1ウェルあたり1×105 細胞の密度で12ウェルプレートに播種し、約80%のコンフルエンスに達するまで培養しました。次に、細胞を指定された化合物で72時間処理しました。処理後、細胞を1μMのROS感受性蛍光プローブ2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジ酢酸(DCFH-DA)とともに37°Cで暗所で30分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を回収し、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて発光波長525nmで蛍光強度を測定した。蛍光強度は細胞内ROSレベルに対応します。

10. リアルタイム定量PCR(RT-qPCR)

H1299細胞をウェルあたり2〜105 細胞の密度で6ウェルプレートに播種し×約80%のコンフルエンスに達するまで培養しました。次に、細胞を指定された化合物で72時間処理しました。全RNAは、広く使用されているフェノールクロロホルム法を使用して抽出されました。相補的DNA(cDNA)合成は、メーカーの指示に従って逆転写キットを使用して実行されました。定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)は、特定のプライマー( 表2にリストされている)を含むリアルタイムPCRシステムを使用して実施されました。相対的な遺伝子発現レベルは、内部対照としてハウスキーピング遺伝子を使用し、比較Ct法を使用して計算されました。

11. タンパク質発現のためのイムノブロッティング

ウェスタンブロット分析は、培養および処理されたH1299細胞に対して実施されました。適切な溶解バッファーを用いて全タンパク質を抽出し、10,000 × g で4°Cで15分間遠心分離して溶解物を清澄化した。 タンパク質濃度は、分光光度法を使用して測定されました。各サンプルから同量のタンパク質をSDS-PAGEで分離し、ポリ二フッ化ビニリデン(PVDF)膜に移しました。メンブレンを5%脱脂粉乳で室温で2時間ブロックし、Bcl-2、カスパーゼ-3、PARP1、BAX、GAPDH、およびチューブリンに特異的な一次抗体を最適な希釈液で4°Cで一晩インキュベートしました。洗浄後、メンブレンを適切な二次抗体とともに室温で2時間インキュベートした。タンパク質バンドを視覚化し、化学発光基質を使用して画像化しました。画像解析ソフトウェアを使用して密度測定分析を実行し、負荷制御としてバンド強度を GAPDH とチューブリンに正規化しました。

12. カスパーゼ-3の免疫蛍光顕微鏡検査

重要なアポトーシスタンパク質であるカスパーゼ-3の発現と細胞内局在を免疫蛍光染色によって評価しました。処理後、H1299細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、中性洗剤溶液で透過処理し、カスパーゼ-3に対する一次抗体とインキュベートしました。次に、蛍光標識された二次抗体を適用して、一次抗体シグナルを検出しました。細胞核は、DNA結合蛍光色素を使用して対比染色されました。染色された細胞を蛍光顕微鏡で視覚化しました。蛍光シグナルの強度と細胞分布は、カスパーゼ-3 活性化に関する定性的および空間的情報を提供し、化合物誘発性アポトーシス応答への関与を裏付けました。

13. トランスクリプトームシーケンシング

試験化合物に対する細胞転写応答をプロファイリングするために、処理されたH1299細胞からトータルRNAを抽出し、標準的な品質管理法を使用して完全性を評価しました。シーケンシングライブラリーは、確立されたプロトコルに従って調製され、次世代シーケンシングプラットフォームを使用してハイスループットシーケンシングを受けました。生のシーケンシングデータは、品質管理フィルタリング、参照ゲノムへのアライメント、転写産物存在量の定量化を含む従来のバイオインフォマティクスパイプラインを通じて処理されました。治療後の発現に統計的に有意な変化を示す遺伝子を特定するために、異なる遺伝子発現解析を実施しました。差次的に発現する遺伝子の濃縮および経路解析を実施して、化合物の影響を受ける主要な生物学的プロセスを解明し、それによってそれらの分子効果の包括的なトランスクリプトームの概要を提供しました。

14. 統計分析

すべてのデータは、少なくとも 3 つの独立した実験からの平均±標準偏差 (SD) として表されます。グループ間の統計的有意性は、必要に応じてスチューデントの t 検定 または一元配置分散分析を含む標準的な方法を使用して決定されました。差は、0.05未満の P値で統計的に有意であると見なされました。

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結果

肺がんに対するPileostegia tomentellaの主要成分のスクリーニング
実験計画の概要を 図1に示します。HPLC-LTQ/Orbitrap MSを使用して、 Pileostegia tomentella に存在する7つの主要な生理活性成分を特徴付けました(表3)。続いて、SwissTargetPredictionデータベース11を用いてこれらの化合物についてインシリコ目標予測を実施し、相互作用確率が0.1を超えるもののみを含むように結果をフィルタリングした。この分析により、260の有望な遺伝子標的が得られました。同時に、NSCLC関連の標的はGeneCardsデータベースから調達されました。比較評価により、予測された化合物標的とNSCLC関連遺伝子との間に59の重複する遺伝子が同定されました(図...

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ディスカッション

非小細胞肺がん (NSCLC) は、その攻撃的な生物学、急速な臨床進行、および高い転移の可能性を特徴とし、多くの場合、患者の転帰が悪いことを特徴とし、差し迫った世界的な健康上の懸念事項です12。外科的切除、放射線療法、化学療法などの標準的な介入は、初期段階の疾患に治療上の利点をもたらしますが、薬剤耐性の出現と全身毒性の負担により、その有効性は進行した段階で低下します。肺がんの根底にある病因は複雑であり、まだ完全には説明されていません13,14。伝統的な中国医学 (TCM) では、NSCLC は歴史的に、気欠乏、痰の蓄積、毒素形成などの内部の不均衡と関連してきました15,16。これらの概念的枠組みは文化的な洞察を提供しますが、直接的な分子相関関係がないため、この研究のメカニズム的解釈では強調さ...

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開示事項

著者には宣言すべき利益相反はありません。

謝辞

この作業は、国家漢方薬管理局の漢方薬高レベル重点分野建設プロジェクト - 少数民族薬局 (荘薬局) (No. zyyzdxk-2023165) の支援を受けました。広西チワン族自治区国際荘医療病院の人材育成プログラム「青少年プロジェクト」(第2022001号)。広西チワン族自治区の漢方薬における学際的なクロスイノベーションチームプロジェクト(No.GZKJ2309);広西中医薬大学の高レベル人材育成イノベーションチームプログラム(No.2022A008)。広西チワン族自治区科学技術局の主要研究開発プロジェクト(No.グイ・ケAB21196057);広西国際荘医療病院のハイレベルな人材チーム構築のための2023年3カ年行動計画(第GZCX20231203号、GZCX20231202号)。広西中医薬大学の「岐黄プロジェクト」ハイレベル人材チーム育成プログラムの第3期(第202414号)。

著者の貢献:

Wen Zhong、Leimin Jiang、Bing Qing はこの作品に等しく貢献し、筆頭著者を共有しています。彼らは主に実験計画、データ収集、および結果の解釈を担当しました。Xiumei Maはデータ分析を行い、原稿作成に貢献しました。Shi Xianyi、Deng Qingmei、Zhou Guangyun は、研究デザイン、データ収集、および文献研究に参加しました。責任著者のJiangcun Weiは、データの分析と解釈を監督し、原稿の起草と修正において主導的な役割を果たしました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アネキシンV–PE / 7-AADアポトーシス検出キットBDバイオサイエンス556547フローサイトメトリーによるアポトーシス検出
抗体:BAXアブカムAB32503プロアポトーシスタンパク質のウェスタンブロット
抗体:Bcl-2アブカムアブ182858ウェスタンブロット/免疫蛍光法
抗体:切断カスパーゼ-3アブカムAB32042ウェスタンブロット/ IF
抗体:GAPDHアブカムAB8245ウェスタンブロットの内部制御
抗体:PARP1アブカムAB32064アポトーシスマーカーのウェスタンブロット
抗体:チューブリンアブカムAB78078ウェスタンブロットの内部制御
ケムドローパーキンエルマーインフォマティクスCCG821391低分子の構造図
化学発光イメージングシステムタノンサイエンス&タノンテクノロジータノン 5200タンパク質バンドの可視化用
サイトスケープCytoscape.orghttps://cytoscape.orgネットワーク構築と解析
DAPI核染色シグマ D9542IF用青色核対比染色剤
デビッドNIHのhttps://david.ncifcrf.gov機能アノテーションとKEGG経路濃縮
DMSOのシグマ 
MFCD00002089		ホルマザン結晶の溶解に使用
エタノール(抽出用)シグマMFCD00003568超音波支援抽出溶媒
酢酸エチルシグマMFCD00009171生理活性分画に使用
FITC標識二次抗体アブカムAB6785免疫蛍光法で使用
フローサイトメーターサーモサイエンティフィックA29001アポトーシスとROS検出に使用
蛍光顕微鏡オリンパス株式会社BX53F免疫蛍光スライドのイメージング用
凍結乾燥機株式会社ラブコンコ7670520サンプル凍結乾燥・保存用
ジーンカードワイツマン研究所https://www.genecards.org疾患関連性のための遺伝子データベース
HPLC-LTQ-Orbitrap質量分析サーモサイエンティフィックIQLAAEGAAVFACZMAIKMSによる化合物同定
イルミナ NovaSeq シーケンシングプラットフォームイルミナ株式会社20012850RNA-seqに使用
LDH細胞毒性アッセイキットビヨタイムC0016細胞毒性指標としてのLDH放出測定用
マイクロプレートリーダーサーモサイエンティフィックVL0000D0MTTおよびLDHアッセイの吸光度測定用
MTT細胞生存率アッセイキットビヨタイム C0009S細胞生存率を評価するためのMTTアッセイに使用
qPCR装置サーモサイエンティフィック4485701遺伝子発現解析用
RソフトウェアR財団https://www.r-project.org統計計算と経路プロット
逆転写キット(RTキット)ヴァザイムMR201cDNA合成用
RNA-seqライブラリー調製キットイルミナ株式会社20020594シーケンシングのためのライブラリー調製
SwissTarget予測スイス研究所http://www.swisstargetprediction.ch複合ターゲット予測ツール
SYBR Green qPCRミックスヴァザイム質問311-02定量PCR用
TRIzol 試薬 (RNA 抽出)シグマ T3934型トータルRNA抽出用
超音波洗浄機ブランソンM1800-CPXH超音波支援抽出用
ウェスタンブロット装置サーモサイエンティフィックA56727ゲル電気泳動とタンパク質転写

参考文献

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ROS介在性アポトーシスアンベリフェロンエピボーゴロシド細胞生存率酸化ストレスミトコンドリアアポトーシス経路ウェスタンブロッティング
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