この論文では、ムスクの主成分であるムスコンがシュワン細胞の増殖とアポトーシスに及ぼす影響を研究します。この結果は、ベル麻痺における酸化ストレス損傷を軽減するためにIL-1R1を阻害することにより、ムスクがNF-κB経路活性を低下させる潜在的なメカニズムを予備的に示しています。
方法論記事
この論文では、ムスクの主成分であるムスコンがシュワン細胞の増殖とアポトーシスに及ぼす影響を研究します。この結果は、ベル麻痺における酸化ストレス損傷を軽減するためにIL-1R1を阻害することにより、ムスクがNF-κB経路活性を低下させる潜在的なメカニズムを予備的に示しています。
天然ムスクがベル麻痺をどのように治療するかの根本的なメカニズムは明らかではありません。この研究は、 in vitro での末梢神経損傷の治療におけるムスクの潜在的なメカニズムを明らかにすることを目的としています。これを達成するために、塩化コバルト (CoCl2) を使用してシュワン細胞 (SC) で酸化ストレス損傷モデルが確立されました。この損傷に対するムスコーン (Mus) の保護効果を評価し、そのメカニズムを調査するために、細胞生存率アッセイ、siRNA トランスフェクション、酵素結合免疫吸着アッセイ (ELISA)、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT-PCR)、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光染色、および細胞の超微細構造分析が使用されました。その結果、Mus 介入は低酸素下で SC 増殖と S-100b mRNA を促進すると同時に、活性酸素種 (ROS) を減少させ、スーパーオキシド ジスムターゼ (SOD) レベルを上昇させることが示されました。Mus は、IL-1β と TNF-α を減少させることにより、低酸素性 SC の酸化ストレスと炎症を改善しました。さらに、Mus は、C-JUN や GDNF などの酸素代謝、細胞修復、神経代謝に関与する主要な指標を調節しました。SC 膜に局在する IL-1R1 は、低酸素症によってアップレギュレートされましたが、Mus 介入後に大幅にダウンレギュレートされました。Mus はまた、NF-κB 経路成分 (IRAK1、IKK、p65、p50) の発現を阻害し、IκB-α を増加させました。重要なことに、siRNAノックダウンによるIL-1R1発現の廃止は、Musで一貫した効果を示しました。IL-1R1を抑制することにより、MusはNF-κB経路の阻害を通じて低酸素性皮下皮下病の炎症を弱めたと結論付けられました。この研究は、低酸素症誘発性皮下機能障害における IL-1R1 の役割を示しました。さらに、ムスはベル麻痺の治療に潜在的に効果的な薬である可能性があります。
ムスコン(Mus)、3-メチルシクロペンタデカノンは、1906年にシカムスクの天然抽出物から単離されました1。貴重で効果的な伝統的な漢方薬 (TCM) であるムスクには、膨腫、抗炎症、蘇生、血液循環促進などの広範な治療効果があります2。ムコウを含む中医学は、中枢神経系疾患3、解毒4、消化管腫瘍5、ウイルス性肝炎6、冠状動脈性心疾患7 など、さまざまな一般的な疾患に利用されています。ムスクの医薬品有効成分として、ムスは抗炎症作用8、抗酸化作用8,9、神経損傷修復作用、心筋梗塞緩和作用10などの優れた生物学的効果を示しています。メカニズム的には、Mus がインターロイキン (IL)-1β、IL-6、腫瘍壊死因子 (TNF)-α、活性酸素種 (ROS)1,8 などの炎症サイトカインの放出を減少させ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ (MAPK)、活性化 B 細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー (NF-κB)、AKT/ラパマイシンの機構標的 (mTOR)、および CaN/Erk1/2 経路1 を調節できることが研究で示されています。8、11など
中国では、以前の文献記録と臨床経験によると、一部の医師が天然ムスクでベル麻痺の治療に成功したことが報告されています 12,13,14,15。Musは診断および治療ガイドラインで推奨される薬ではありませんが、未発達の医療分野では、またはステロイドや抗ウイルス薬を使用できない一部の人々にとって、Musは別の好ましい選択肢になる可能性があります。近年の文献分析では、末梢性顔面神経麻痺の治療のために公開されている漢方薬パッチ処方箋および経穴研究において、ムスクが最も頻繁に使用される漢方薬であることも示されています16。ムスに関する多くの薬理学的および医学的研究がありますが、ムスクがベル麻痺をどのように正確に治したのか、そして根底にある神経化学的および細胞生物学的メカニズムが何であるかはまだ不明です。
ベル麻痺は、急性特発性顔面神経麻痺であり、すべての顔面筋を神経支配する末梢顔面神経の機能不全に起因します。ベル麻痺の症状の最も顕著な兆候は、片側の顔の筋肉の脱力感と垂れ下がりです。ベルの顔面神経麻痺は生命を脅かすものではありませんが、患者の生活の質に影響を与え、不安やうつ病を引き起こすことさえあります。特に心配なのは、適切な治療を行っても、患者の最大30%がシンキネシス、拘縮、永久的な顔面麻痺、顔面非対称性などの長期的な後遺症に苦しんでいることです。したがって、ベル麻痺の解決策を見つけ、麻痺のリスクを減らすことが私たちの主な目標です。ベル麻痺の病原性メカニズムに関する現在の知識は不明のままです。最近の研究では、ウイルスの再活性化がベル麻痺の主な原因である可能性があり、これらのウイルスは神経浮腫と炎症を引き起こしてベル麻痺の発作を引き起こす可能性があることが実証されています。
最近の証拠に基づいて、Mus は顔面神経への酸化ストレス損傷を改善することにより、ベル麻痺の症状を緩和するという仮説を立てました。本研究では、Musの治療効果が実験的に示され、SCsのIL-1R1がアップレギュレーションされるとNF-κB経路が活性化され、細胞損傷を引き起こすことが明らかになりました。重要なことに、MusがIL-1R1をダウンレギュレートすることによりNF-κBシグナル伝達を阻害することを実証しました。私たちの発見は、 in vitro で 酸化ストレスにさらされた SC における IL-1R1 アップレギュレーションの役割を特定し、Mus 投与を新しい治療戦略として位置づけました。
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本実験的研究は、施設動物管理利用委員会(承認番号:LL-240077)の承認を得て実施しました。
細胞培養と薬物介入
ラットシュワン細胞(SC)を、基礎培地、5%ウシ胎児血清、1%シュワン細胞増殖サプリメント、1%ペニシリン、および1%ストレプトマイシンからなるシュワン細胞培地で培養しました。すべての細胞を37°Cの5%CO2 雰囲気に保持しました。 70〜80%の密度まで成長させた場合、SCは4つのグループに分けられました(グループあたりn = 5):(1)NCグループ;(2) NC+CoCl2 グループ。(3) NC+CoCl2+Mus グループ。(4) NC+CoCl2+siIL-1R1+Mus 基。
低酸素症を模倣するために頻繁に使用される薬剤である塩化コバルト (CoCl2) は、低酸素症誘導因子の分解と安定化の妨げ、HIF-1α タンパク質の蓄積など、低酸素症と同様の反応を引き起こすことが知られています15。Osuruら17に基づく修正法によると、NC+CoCl2群およびNC+CoCl2+Mus群において、SCを240μMCoCl2を添加したシュワン細胞培地中で、加湿インキュベーター(21%O2)で37°Cで95%空気、5%CO2の大気条件で8時間培養した。次に、Mus グループでは、さらに 24 時間、1.25 μg/mL Mus の介入が適用されました。一方、NC+CoCl2+siIL-1R1+Mus群では、SCを最初に24時間のsiRNA感染で処理し、次に240μM CoCl2で8時間連続培養し、続いて前者と同様にさらに24時間1.25μg/mL Musを介入した。実験プロセスのフローチャートを図1に示します。
細胞生存率アッセイ
SCの生存率は、製造元の指示に従って、細胞計数キット-8(CCK-8)アッセイ試薬を使用して決定されました。5 × 105 細胞/ウェルの密度で培養した SC を、5% CO2 加湿雰囲気中で 37 °C で 100 μL の完全増殖培地を含む 96 ウェル細胞培養プレートに播種しました。コンフルエントが70〜80%に達したら、10 μLのCCK-8溶液を各ウェルに添加し、プレートを37°Cで1時間インキュベートしました。 マイクロプレートリーダーを使用して96ウェルプレートの光学密度(OD)を450 nmで測定し、細胞生存率を計算しました。細胞は、NC群、NC+CoCl2 群、NC+CoCl2+Mus群、NC+CoCl2+siIL-1R1+Mus群の4つのグループに分けられました。実験結果は、ブランクウェル(培地+CCK8溶液)を使用して補正されました。細胞生存率 = [(実験群 - ブランクウェル)/(NC 群 - ブランクウェル)] × 100%。
siRNAトランスフェクション
トランスフェクションは、濃度 100 ng/μL の siIL-1R1 (AUAGUCUUGGAUUUUCUCCAA、GGAGAAAAUCCAAGACUAUGA) の合成 siRNA 二本鎖を 24 時間使用した市販の in vitro siRNA/miRNA トランスフェクション試薬の製造元の指示に従って実施されました。siIL-1R1トランスフェクション後、トランスフェクション18の24時間後にRT-qPCR分析を行うことによりsiIL-1R1発現を評価し、効率が80%以上であることを保証する必要があります
酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)
培養後上清を収集し、グループ固有の条件(2950 g、20分、25°C)で遠心分離しました。IL-1β、TNF-α、ROS、およびSODの細胞外レベルは、キットの指示に従ってELISAを介してアッセイされました。450 nmでの最終的な吸光度測定値は、マイクロプレートリーダーを使用して得られました。
RNA単離と定量的リアルタイムPCR(RT-qPCR)
メーカーの指示に従って、TRizol試薬を使用して培養細胞からトータルRNAを抽出しました。標的遺伝子(IL-1β、TNF-α、S-100b、IL-1R1)を20 μLのSYBR qPCRミックス反応でPCR装置で40サイクル増幅しました。データ正規化はβアクチンを使用し、融解曲線分析によってPCR特異性を検証しました。2-ΔΔCt 法は、3回にアッセイされた5つの独立したサンプルからの相対発現を定量化しました。プライマーを 表1に示します。
ウェスタンブロット
処理後、すべての実験群のSCを24時間インキュベートし、採取した。全タンパク質抽出キットを使用して全タンパク質を抽出しました。タンパク質ライセートを、98°Cで5分間変性させたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)ローディングバッファーと組み合わせ、10〜12%SDS-ポリアクリルアミドゲル上で分離(レーンあたり20μg)しました。分離されたタンパク質を電気泳動してポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜に転写しました。メンブレンを5%脱脂粉乳で室温で60分間ブロックし、次いで4°Cで6mLの容量で一晩インキュベートした:抗HIF-1α抗体(1:1000)、抗GAPDH抗体(1:1000)、抗IL-1R1抗体(1:1000)、抗C-JUN抗体(1:1000)、抗GDNF抗体(1:1000)、抗IRAK1抗体(1:1000)、抗IKK抗体(1:1000)、抗p65抗体(1:800)、抗p50抗体(1:900)、 抗IκB-α抗体(1:900)および抗βアクチン抗体(1:1000)。洗浄後、西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体でメンブレンを25°Cで60分間プローブしました。 タンパク質シグナルは、Image Studio Digits Ver 4.0を使用して検出されました。バンド強度はImageJソフトウェアで定量化され、βアクチンおよびGAPDH発現に正規化されました。3つの独立した実験が行われました。
免疫蛍光
SCにおけるIL-1R1の局在は、Zhaoら19に従って評価されました。トリプシン処理により対数成長期に細胞を回収し、新鮮な完全培地に再懸濁し、完全に粉砕して均一な単一細胞懸濁液を得る。滅菌カバースリップを含む培養プレートに細胞を播種します。細胞が完全に合流したら、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1〜2回すすぎ、カバースリップを慎重に取り除き、接着細胞をPBS中の4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、0.05%Triton X-100で透過処理し(10分)、5%ヤギ血清でブロックします(1時間)。一次インキュベーションでは、ウサギ抗ラットIL-1R1 mAbを使用しました。PBS洗浄後、サンプルをFITC結合ヤギ抗ウサギIgGと室温で2時間インキュベートした。カバースリップに水溶性の埋入剤を添加して取り付けます。免疫標識細胞は、励起波長492 nm、発光波長520 nmの蛍光顕微鏡を使用して視覚化および定量化されました。
超微細構造解析
Zhaoらのプロトコル19に従って、SCを2.5%グルタルアルデヒドに固定し、1%四酸化オスミウムで4°Cで一晩ポスト固定しました。サンプルは、エタノール/アセトン脱水シリーズを受けました。超薄切片(80 nm)を酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色した後、透過型電子顕微鏡を使用して超微細構造検査を行いました。
危険化学試薬の廃棄
CoCl2 を含む培地と溶液は、指定された重金属廃棄物容器に収集されます。ピペットチップ、遠心分離管、手袋など、前述の液体と接触したすべての使い捨て材料は重金属有害廃棄物として分類され、適切な処分のために関係当局によって承認された認可された有害廃棄物管理会社に移送されます。廃パラホルムアルデヒド溶液は、専用のアルデヒド廃棄物容器に廃棄してください。使用済みの消耗品はアルデヒド廃棄物として収集し、同じ認可された有害廃棄物管理会社によって処理する必要があります。
統計分析
複数グループの比較は、GraphPad Prism 8.0 の Tukey の事後検定を使用した一元配置分散分析によって分析されました。統計的有意性は、 P < 0.05 と定義されました。データは平均±±標準偏差 (SD) として表示されます。
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in vitroでのSchwann細胞の酸化ストレス損傷に対するMusの保護効果
HIF-1αの発現は、低酸素環境の変化に応答して変化を示しました20。低酸素症をモデル化するために、SCはCoCl2に曝露され、ウェスタンブロッティングを介して標準的な低酸素マーカーであるHIF-1αタンパク質レベルの上昇によって確認されるように、低酸素症を誘発することに成功しました(図2A)。その後の低酸素 SC の Mus 介入では、増殖とストレス反応に対するその効果が評価されました。CCK-8アッセイにより、Musが低酸素性SCの増殖を有意に増加させることが明らかになりました(図2B)。再生能力を評価するために、再生マーカーであるS-100b mRNA発現をRT-qPCRによって定量しました。低酸素症はS-100b転写を実質的に抑制しましたが、Musの投与はS-100b発...
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ベル麻痺は、片側性顔面筋力低下を特徴とする特発性末梢顔面神経麻痺です。ミエリン鞘は、ニューロンの効果的な機能においてさまざまな重要な機能を果たします23。神経インパルスのスムーズな伝導を保証し、栄養因子を供給することによってニューロンをサポートし、再生のプロセスを助けます24 。したがって、末梢神経系におけるミエリンの喪失は脱髄神経障害を引き起こす可能性があり、筋萎縮、感覚異常、しびれ、麻痺を引き起こす可能性があります25。末梢神経系の主要なグリア細胞であるシュワン細胞 (SC) は、神経再生のプロセスにおいて重要な役割を果たします26。神経が損傷すると、SC は再プログラミングされ、特殊な「修復 SC」に変化します。これらの修復 SC は、変性軸索とミエリン破片を取り除き、軸索の再成長を促進し、最終的に再生軸索を再髄鞘化する役割を果たします27...
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著者らは、競合する利益を保有していないことを宣言する。
著者全員が、宝山区衛生健康委員会人材(優秀学術リーダー)プログラム(BSWSYX-2024-02)、上海中医薬大学支出予算プログラム(2021LK003)、宝山区衛生健康委員会優秀青少年(育財)プログラム(BSWSYC-2024-02)、基調講演医学分野と特色ブランドの育成プロジェクトクラスB、 上海市宝山区衛生委員会 (BSZK-2023-BP07)。これらの資金提供機関は、研究デザインや出版のために原稿を提出する決定において何の役割も果たさなかった。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.25%トリプシン消化液(EDTAなし) | サービスバイオ | G4002 | |
| 10倍 TBS | ユーバイオテック | BF0153 | |
| 10-180 KDプリステントカラープロテインマーカー | ユーバイオテック | P0069 | |
| 5%脱脂粉乳 | Beyotime Biotechnology、中国 | P0216-300g | |
| 抗C-JUN抗体 | 細胞シグナル伝達、米国 | #9165T | |
| 抗GAPDH抗体 | abcam, イギリス | AB245355 | |
| 抗GDNF抗体 | 細胞シグナル伝達、米国 | #47808 | |
| 抗HIF-1&α;抗体 | 細胞シグナル伝達、米国 | #14179 | |
| 抗IKK抗体 | 細胞シグナル伝達、米国 | #2682 | |
| 抗IL-1R1抗体 | 細胞シグナル伝達、米国 | #6775 | WB用 |
| 抗IL-1R1抗体 | プロテインテック | 84094-6-RR | 免疫蛍光 |
| 抗IRAK1抗体 | 細胞シグナル伝達、米国 | #4395 | |
| アンチI&カッパ;B-&アルファ;抗体 | 細胞シグナル伝達、米国 | #8943 | |
| 抗P50抗体 | abcam, イギリス | AB305263 | |
| 抗P65抗体&NBSP; | abcam, イギリス | AB16502 | |
| 抗ラットIL-1R1 mAb | Beyotime Biotechnology、中国 | AF7212 | |
| 抗-&-アクチン抗体 | アブカム | アブ179467 | |
| BCAタンパク質定量キット | ユーバイオテック | WB2123 | |
| 細胞計数キット-8(CCK-8)アッセイ試薬 | Beyotime Biotechnology、中国 | C0048M | |
| 塩化コバルト(CoCl2) | Macklin, 中国 | C804815 | |
| EuECLスター | ユーバイオテック | WB2131 | |
| ウシ胎児血清(FBS) | ベルゴリン、中国 | PWL001型 | |
| Fitc標識ヤギ抗ウサギIgG | サービスバイオ | GB22303 | |
| 蛍光顕微鏡 | ニコン | ||
| Hieff Trans in vitro siRNA/miRNAトランスフェクション試薬 | YEASEN, 中国 | 40806ES01 | |
| 西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体 Hrp標識ヤギ抗マウスIgG | Servicebio, 中国 | GB23301 | |
| IL-1&β;、TNF-&α;、ROS、SOD ELISAキット | BOSTER, 中国 | BES1762K、BES0481K、BES5018K、BES2920K | |
| ムスコーン(ムス) | Aladdin, 中国 | M141496 | |
| PBSバッファー | サービスバイオ | G4202 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、100x | プロセル | PB180120 | |
| ポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレン | Millipore, アメリカ | IPFL00010 | |
| ラットシュワン細胞(SC) | プロセルライフサイエンス&プロセルテクノロジー中国 | CM-M111 | |
| RIPA溶解バッファー | ユーバイオテック | WB2116 | |
| シュワン細胞培地 | ScienCell、米国 | 1701 | |
| SDS-PAGE ロードバッファー | Beyotime Biotechnology、中国 | P0015 | |
| SDS-PAGE プロテイン l ローディングバッファー、5x | ユーバイオテック | WB2122 | |
| si-IL-1R1 | ジーンユニバーサル | RX0114371 | |
| ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)調製キット | ユーバイオテック | WB2118 | |
| SYBR qPCRミックス | Beyotime Biotechnology、中国 | D7260 | |
| トータルプロテイン抽出キット | Beyotime Biotechnology、中国 | PP123-01 | |
| 透過型電子顕微鏡 | 日立 | HT7800 | |
| トリゾール | Beyotime Biotechnology、中国 | R0011 | |
| トゥイーン-20 | ユーバイオテック | WB2114 | |
| 水溶性封入剤 | Absin, 中国 | ABS9240 | |
| ウェスタントランスファーバッファー | ユーバイオテック | WB2129 |
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