方法論記事

ゲートキーパーの視覚化:成体ゼブラフィッシュにおける血液脳関門透過性のEvanの青色色素ベースの評価

DOI：

10.3791/69010

⸱

2025年9月30日

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1Department of Basic Medical Sciences, Kulliyyah of Medicine, International Islamic University Malaysia (IIUM), 2Department of Biotechnology, Kulliyyah of Science, International Islamic University Malaysia (IIUM), 3Department of Physiology, Faculty of Medicine, Universiti Kebangsaan Malaysia, 4Clinical Pharmacology Department, Menoufia Medical School, Menoufia University

この記事について

サマリー

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このプロトコルは、エヴァンの青色色素ベースの評価を使用して、成体ゼブラフィッシュ(ダニオレリオ)モデルの血液脳関門(BBB)の完全性を評価する信頼性の高い方法を提示し、神経血管破壊の定性的分析と定量的分析の両方を可能にします。

要約

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血液脳関門 (BBB) は、脳に出入りする物質の動きを調節することで中枢神経系 (CNS) の恒常性を維持し、それによって潜在的に有害な物質から神経組織を保護する半透性界面です。BBB の破壊は、パーキンソン病 (PD) やアルツハイマー病 (AD) を含む多くの神経変性疾患において十分に確立された特徴であり、透過性の増加が疾患の進行に寄与し、悪化します。ゼブラフィッシュの成体 (Danio rerio) は、神経変性疾患を研究するための貴重なモデルとしてますます認識されていますが、この種の BBB の完全性を評価するための標準化された方法は依然として限られています。このプロトコルは、神経血管系から脳組織へのエバンのブルー(EB)色素の血管外漏出を分析することにより、成虫ゼブラフィッシュのBBB透過性を評価するためのシンプルで再現性があり、費用対効果の高いアプローチを説明しています。この方法は、定性的視覚化とEB分布の定量的画像分析を組み合わせて、BBBの破壊を検出します。主な手順には、EB 色素の適切な腹腔内注射、全身色素循環の確認、慎重な脳解剖、一貫したイメージングとグレースケール強度測定が含まれます。色素の浸透を検証し、正確な解釈をサポートするために、ポジティブコントロールとネガティブコントロールが組み込まれています。代表的な結果は、生理食塩水を注入した対照と比較して、パーキンソン病ゼブラフィッシュの脳でより大きなEB血管外漏出を示しており、BBB透過性の増加を示しています。この技術は最小限の特殊な機器しか必要とせず、リソースが限られている研究室に適しています。全体として、このプロトコルは、ゼブラフィッシュの成体モデルにおけるBBBの完全性を調査するための実用的なツールを提供し、疾患メカニズムの研究や神経血管機能を標的とする治療介入の評価など、さまざまな用途に適応できます。

概要

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血液脳関門 (BBB) は、主に周皮細胞と星状細胞に支えられた特殊な脳内皮細胞によって形成される選択的で半透性の生理学的界面であり、血流と脳の間質空間の間の分子交換を調節して中枢神経系 (CNS) 微小環境を維持します。その完全性は、CNSの恒常性を維持し、有害または有毒な物質から神経組織を保護するために不可欠です1。BBB の破壊は、パーキンソン病 (PD)、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症など、さまざまな神経変性疾患においてよく知られている病理学的特徴です 2,3。BBB機能の低下は透過性の増加につながり、神経毒性化合物や炎症性メディエーターが脳組織に浸潤し、それによって疾患の進行を悪化させます4。そのため、BBB の完全性を評価することは、これらの障害の根底にある神経血管および炎症メカニズムについてより深い洞察を得るために重要です。

in vivo げっ歯類および in vitro モデルは依然として BBB 研究のゴールド スタンダードです5、ゼブラフィッシュ (Danio rerio) は、遺伝的扱いやすさ、費用対効果、取り扱いの容易さ、および哺乳類との神経解剖学的および BBB 特性が保存されているため、神経科学において貴重な脊椎動物モデルとして浮上しています6。神経変性研究での使用が増加しているにもかかわらず、成体のゼブラフィッシュのBBBの完全性を評価する方法はまだ限られています7,8。蛍光トレーサー注射やトランスジェニックレポーターなどの技術は、幼虫9,10で広く使用されていますが、色素沈着と透明度の低下により、成虫では重大な課題を引き起こしています。したがって、本研究の目的は、エバンのブルー (EB) 色素血管外漏出を使用して成体ゼブラフィッシュの BBB 透過性を評価するための、シンプルで再現性があり、視覚的に実証可能なプロトコルを確立することです。この方法には、脳組織への色素漏出の定性的観察と定量的測定の両方が組み込まれており、病理学的条件下での神経血管の完全性を評価するための実用的なツールを提供します。

EvanのBlue色素は、血清アルブミンに結合し、通常は無傷のBBBを通過することができず11、バリア破壊を評価するための実行可能な代替手段を提供します12。EB 血管外漏出は、外傷性脳損傷、脳卒中、神経炎症などの状態で BBB 漏出を検出するためにげっ歯類モデルに広く適用されています13。しかし、ゼブラフィッシュの成体への応用はほとんど未踏のままです。この研究は、成体のゼブラフィッシュに最適化されたEB色素技術の新しい適応を示し、BBB透過性の信頼性の高い定性的および定量的評価を可能にします。この方法は費用対効果が高く、必要な特殊機器は最小限で済み、複数の動物に合わせて簡単に拡張できるため、幼虫に通常使用されるより複雑なイメージングベースのアプローチよりも実用的な利点があります。

このプロトコルを使用して、健康なゼブラフィッシュとパーキンソン病の成虫ゼブラフィッシュの両方でBBBの完全性を評価しました。ゼブラフィッシュにパーキンソニズムを誘発するために、神経毒1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(MPTP)を、前述の方法14に従って腹腔内投与しました。その結果、パーキンソンゼブラフィッシュの脳におけるEB血管外漏出が有意に大きくなったことが明らかになり、PDで観察された十分に文書化されたBBB破壊と一致しました。これらの発見は、この方法の感度と信頼性を検証し、血管病理を分子および行動の結果に結び付ける上での有用性を裏付けています。したがって、この技術は、神経変性疾患に対する神経血管の寄与を調査する研究者にとって貴重なツールであり、遺伝的ゼブラフィッシュモデルと毒素誘発性ゼブラフィッシュモデルの両方に適用できる可能性があります。

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プロトコル

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このプロトコルは、動物倫理の承認 (参照番号: IIUM/504/14/2/IACUC) を参照して、マレーシア国際イスラム大学 (IIUM) 傘下の施設動物管理および使用委員会 (IACUC) によって遵守され、許可されました。

1. エバンスブルー染料原液を準備する

  1. 0.1 gのEB色素を10 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解して、1%(w / v)ストック溶液を調製します。染料が完全に溶けるまでよく混ぜます。
    注意: EB は発がん性物質カテゴリー 1B に分類されます。皮膚や目に直接触れないようにしてください。防護服、手袋、安全メガネ、防塵マスクを使用してください。ほこりの吸入を避け、製造元の取り扱い指示に従ってください。エバンスブルー染料(固体または溶液)をシンクに廃棄しないでください。廃棄物はラベルの付いた元の容器に保管してください。国および地方の有害廃棄物規制に従って処分してください。
  2. 0.45 μmシリンジフィルターを使用して溶液をろ過します。濾液を滅菌15mL遠心分離管に集めます。チューブをアルミホイルで包み、4°Cで保存します。
    注:より小さな孔径のフィルター(0.2 μmなど)を使用することもできます。原液は、4°Cで最大2週間、または-20°Cで最大1か月間保存でき、凍結保存時に繰り返される凍結融解サイクルを最小限に抑えるために分注することをお勧めします。

2. エバンスブルー染料をゼブラフィッシュの大人に投与する

  1. 魚が触覚刺激に反応しなくなるまで、水温を12°Cから7°Cに徐々に下げることにより、低体温 ショックを介して ゼブラフィッシュを麻酔します。
    注: 微量の砕いた氷を数分かけてゆっくりと水に加え、温度を徐々に下げることで、徐々に温度を下げることができます。トリカイン浸漬も適切な代替麻酔方法です。






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結果

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このプロトコルは、パーキンソン病ゼブラフィッシュモデルでテストされました。BBBの妥協は、PD患者16、17、18 およびさまざまなパーキンソン病動物モデル19、20、21で十分に文書化された現象です。ゼブラフィッシュの成体パーキンソン病モデルにおけるBBBの完全性を調査するために、生理食塩水を注入した(対照)とパーキンソン病のゼブラフィッシュの間で、脳組織へのEB色素の血管外漏出を比較しました。ゼブラフィッシュの成虫PDモデルは、以前に発表されたように、BBB評価の24時間前に投与されたMPTP(200μg / g)の単回腹腔内注射 によって 確立されました14。一方、生理食塩水を注射したものには生理...

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ディスカッション

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BBB の損傷は疾患の進行を引き起こし、悪化させる可能性があるため、脳関連疾患の病態生理学を理解するには、BBB の完全性を評価することが不可欠です4。ゼブラフィッシュの成虫は神経変性疾患を研究するための効果的なモデルとして浮上していますが、この種のBBBの完全性を評価する方法は未開発のままです8。ここで提示するプロトコルは、神経血管系から脳組織へのEB色素の血管外漏出を分析することにより、成体のゼブラフィッシュのBBB透過性を評価するための簡単で費用対効果の高いアプローチを提供します。この方法は、高価な蛍光トレーサーを利用する他のアプローチとは対照的に、最小限の技術的専門知識を必要とし、すぐに入手できる安価な材料に依存しています。さらに、定性的測定と定量的測定の両方を提供し、研究者がゼブラフィッシュ病モデルにおけるBBB破壊を確実に検出し、特徴付けることを可能にします。したがって、この方法は、意味のある BBB データを生成しようとしているリソースが限られている研究室にとっ...

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開示事項

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著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

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この研究は、マレーシア高等教育省 (MoHE) の基礎研究助成金制度 (FRGS) (助成金番号 FRGS19-125-0734) に基づいて資金提供を受けました。この研究の出版援助は、マレーシア ケバンサーン大学 (UKM) 医学部によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アガロースパウダービバンティスPC0701
エヴァンの青い染料シグマ・アルドリッチE2129
フィジー イメージJ米国国立衛生研究所ダウンロードリンク: https://imagej.net/software/fiji/downloads
顕微鏡カメラ深センハイヤーエレクトロニクス株式会社ハイ-500M
パラホルムアルデヒド(PFA)粉末シグマ・アルドリッチ158127
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)シグマ・アルドリッチP4417
塩化ナトリウム(NaCl)HmbGケミカルズ7647-14-5
実体顕微鏡オリンパス株式会社SZ40
シリンジフィルターユニット、0.45&マイクロ;mメルクミリポア SLHV004SL

参考文献

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