方法論記事

NgTET支援CRISPR-Casシステムによる正確なファージ変異誘発

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DOI：

10.3791/69022

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2025年10月14日

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1Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, 2Kavli Institute of Nanoscience, Delft University of Technology, 3Department of Bionanoscience, Delft University of Technology, 4Philipps-Universität Marburg, Department of Chemistry, Center for Synthetic Microbiology (SYNMIKRO), 5Institute of Pharmaceutical Biology and Biotechnology, Department of Pharmacy, Marburg University

この記事について

サマリー

ここでは、NgTET酵素を使用してバクテリオファージのDNA修飾を低減し、効率的で瘢痕のないCRISPR-Cas変異誘発を可能にするプロトコルを提示します。この方法は、バイオテクノロジーやファージ治療への応用のためのファージの遺伝子工学を容易にします。

要約

細菌宿主を特異的に標的とするウイルスであるバクテリオファージは、特に多剤耐性感染症との闘いにおいて、バイオテクノロジーや医療に大きな可能性を秘めています。しかし、ファージ感染の根底にある分子メカニズムは、ほとんど解明されていないままです。ファージの正確な部位特異的変異誘発は、遺伝子機能やファージと宿主の相互作用を解明するための強力なツールです。

しかし、ファージゲノム変異誘発における大きな課題は、CRISPR-Casのような従来のゲノム編集ツールを妨げるファージDNA修飾の存在です。

CRISPR-Casシステムは、さまざまな生物の標的変異誘発に成功裏に使用されていますが、ファージ変異誘発におけるその有効性は、シトシングリコシル化などのDNA修飾によって制限されることがよくあります。この障壁を克服するために、ファージDNA修飾の存在量を一時的に減少させ、効率的なCRISPR-Casターゲティングとファージゲノムへの正確な変異導入を可能にする効率的な方法を開発しました。具体的には、DNA中のメチル化およびヒドロキシメチル化シトシンを繰り返し復原化するネ グレリア・グルベリ (NgTET)由来のテンイレブン転座(TET)メチルシトシンジオキシゲナーゼを使用します。NgTETは、ファージDNA内のヒドロキシメチル化シトシンを酸化することにより、グリコシル化などのその後のシトシン修飾を防ぎ、Casを介したDNA切断の効率を大幅に向上させます。

結論として、ここで紹介する瘢痕のない正確なゲノム編集アプローチは、ファージゲノムのネイティブ遺伝子構造を維持しながら、点突然変異の効率的な導入を可能にします。この方法は、転写および翻訳フレームワークを無傷で保存することにより、複雑な調節ネットワークへの意図しない混乱を最小限に抑えます。これは、必須または多機能ファージタンパク質を調査するために特に重要です。無関係な配列を導入せずに標的遺伝子組み換えを生成できるため、ファージ生物学の実験ツールキットが大幅に拡張されます。この戦略は、詳細な機能研究を促進するだけでなく、治療およびバイオテクノロジー用途のためのファージの合理的なエンジニアリングの可能性も高めます。

概要

バクテリオファージは、細菌を特異的に標的とするウイルスです。これらは、バイオテクノロジーと医学、特に多剤耐性菌との闘いにおいて計り知れない可能性を秘めているため、大きな研究関心を集めています 1,2,3。それにもかかわらず、ファージ生物学は比較的研究が不十分です。細菌宿主を乗っ取る分子メカニズムをより深く理解することは、その治療およびバイオテクノロジーの可能性を最大限に活用するために不可欠です4。効率的なファージ感染の根底にある分子メカニズムを調査し、さらに特定の用途のためにファージを操作するには、ファージゲノムを遺伝子組み換えする能力が不可欠です。しかし、それはファージ生物学の分野で最も重要な課題の1つであり続けています3,5,6。

ファージDNAは、プリンおよびピリミジン塩基の特定の化学的変化、例えば、シトシングリコシル化およびメチル化によって修飾されることがよくあります。これらの修飾は、ファージ遺伝物質を宿主ヌクレアーゼによる認識および分解から保護します6。これらの修飾はファージの適応度にとって重要ですが、DNA標的システムに依存するファージゲノム工学アプローチにとって重大な障害となります2,3,7。

制限修飾システムやクラスター化規則的に間隔を空けた短い回文反復(CRISPR)-CRISPR関連(Cas)タンパク質ベースの技術を含む既存の突然変異誘発戦略は、シトシングリコシル化などの保護エピジェネティック修飾によりファージDNAを修飾する際に重大な課題に直面しています8。細菌細胞および真核細胞で非常に効果的なCRISPR-Cas媒介ゲノム編集は、Casヌクレアーゼによる標的ゲノム遺伝子座でのDNAの正確な切断と、その後の目的の変異を保有するドナーDNAとの相同組換えによるDNA修復の2つの重要なステップに依存しています1。しかし、ファージでは、DNA修飾により、Casヌクレアーゼがゲノムに効率的に結合または切断することが妨げられることがよくあります。さらに、ファージ複製の迅速かつ一過性の性質により、相同組換えの効率がさらに制限される可能性があります。これらの障壁により、ファージ変異誘発にDNAを標的とするCRISPR-Cas技術を適用することは特に困難です。ファージDNA修飾は、in vitroおよびin vivoの両方でCRISPR-CasによるファージDNAの標的化を損なうことが示されています6,7。

ファージにおける保護DNA修飾によってもたらされる課題に対処するために、10-11転座(TET)メチルシトシンジオキシゲナーゼ、特にNgTETの活性を利用するゲノム変異誘発戦略を導入します。真核生物では、TET酵素はメチル化シトシンの段階的な酸化を反復プロセスを通じて触媒します:メチルシトシン(5mdC)は最初にヒドロキシメチルシトシン(5hmdC)、次にホルミルシトシン(5fdC)、最後にカルボキシシトシン(5cadC)に変換されます(図1)。

ファージ変異誘発アプローチでは、NgTETを使用して保護DNA修飾の存在量を一時的に減少させ、それによってCas酵素9などのゲノム編集ツールへのファージDNAのアクセシビリティを高めます。NgTETは、異種細菌宿主、特に 大腸菌における活性可溶性形態での発現に成功したという以前の報告により、バクテリオファージゲノムの調節に選択されました。NgTETはファージ感染中も活性を維持しなければならないため、この特性は不可欠です10。

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図1:TETジオキシゲナーゼ1による5-メチルシトシンの段階的酸化。 TETジオキシゲナーゼは、5-メチル-2'-デオキシシチジン(5mdC)から5hmdC、5-ホルミル-2'-デオキシシチジン(5fdC)、そして最終的には5-カルボキシル-2'-デオキシシチジン(5cadC)への連続酸化を触媒します。最終生成物である5cadCは、自発的または酵素的に未修飾のシトシン(dC)に戻り、それによって動的なエピジェネティックな調節に寄与します。この多段階プロセスは、真核生物における活性DNAメチル化の中心です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

メチルシトシンとヒドロキシメチルシトシンは、グリコシル化のようなかさばる保護構造を含むファージDNA過剰修飾の一般的な前駆体であるため、TETジオキシゲナーゼの酸化活性を利用して、これらのDNA過剰修飾の形成を防ぐことができます9。このTETベースのゲノム変異誘発アプローチでは、大腸菌でNgTETを組換えに異種的に発現させ、感染時にファージゲノム内のヒドロキシメチル化シトシンを酸化させることで、かさばるグリコシル化の形成を防ぎます。これらのかさばるDNA修飾の存在量を減らすことにより、私たちのアプローチは、CRISPR-CasヌクレアーゼへのファージDNAのアクセス可能性を高めることができます。このアクセシビリティの向上により、効率的な標的認識、正確なDNA切断、およびファージゲノムへの瘢痕のない点変異の導入が容易になり、遺伝子欠失、レポーター遺伝子挿入、またはPCRベースの変異体選択のための人工接合部の統合に依存する従来のファージ変異誘発法とは区別されます1,11.これらの従来の戦略は、これまでのところ、ファージゲノムにおける標的変異誘発に利用可能な唯一のツールであり、したがって、ここで紹介する方法の重要な基盤を表しています。ただし、単一のファージタンパク質は複数の機能を持つことができます。目的のタンパク質をコードする遺伝子全体が欠失すると、関連するすべての機能が破壊されます。対照的に、点突然変異を標的に導入することで、特定の機能を選択的に不活性化することができ、その役割の詳細な分析が可能になります。今日まで、多くのファージタンパク質の機能はほとんど特徴付けられていません。したがって、特定の遺伝子に関連する追加の活性を見落とす可能性があります。したがって、タンパク質全体に最小限の変化を引き起こしながら、単一の機能のみを除去することを目的とした最小限のアプローチが好ましい12,13。ここで説明する方法は、全体的なゲノム組織や機能を破壊することなく、正確な遺伝子改変を可能にします。以前のファージ変異誘発法のもう一つの大きな課題は、通常約0.1%の変異率をもたらす効率の低さでした1,11。この技術により、単一コドン変化を導入できる最初の突然変異誘発戦略を提示し、ターゲティング効率の顕著な7倍の向上を達成しました。ONTベースのハイスループットスクリーニング法と組み合わせることで、点変異の検出が簡素化され、1つの変異体を分離するために大規模なファージ集団をスクリーニングする必要がなくなります。ここで説明するTETベースの変異誘発戦略は、この分野での長年の制限に対処し、より信頼性の高いゲノム編集を可能にします14。

全体として、この方法はバクテリオファージ感染メカニズムの理解を深めるために適用されるだけでなく、合成生物学にも大きな期待を寄せています。正確かつ効率的なファージゲノムエンジニアリングを可能にすることで、ファージを特定の用途に合わせて調整する道が開かれ、それによってバイオテクノロジーおよび医療用途の可能性が高まります。

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プロトコル

NgTET処理されたT4ファージの生成を示す概略図を 図2に示します。

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図2:T4ファージ変異誘発および変異体スクリーニングの確立されたワークフローの概略図。 ワークフローには、NgTETを使用した低修飾T4ファージの生成が含まれており、LC-MS分析またはCRISPR-Cas切断アッセイのいずれかによって検証できます。その後、目的の変異は、CRISPR-Casを介した部位特異的変異誘発によってファージゲノムに導入され、逆選択によって同定されます。次に、ナノポアシーケンシングを使用して、目的の変異の存在を確認できます。検証後、変異ファージを増殖させてDNAの過剰修飾を回復させることができます。これにより、溶解アッセイやバーストサイズ測定による感染表現型の分析など、下流のアプリケーションで操作されたファージの使用が可能になります。図の各ステップには、プロトコルステップを図のそれぞれの部分にリンクしやすくするために、括弧内の対応するプロトコル番号が注釈が付けられています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1. NgTET前処理によるファージDNA修飾の低減(~2日)

注:このステップは、ファージDNA修飾の存在量を減らすことにより、突然変異誘発中に効率的なCasヌクレアーゼ標的化を可能にするために重要です。

  1. グリセロールストックから30 μg/mLカナマイシンを添加した10 mLのLB培地に材料を移すことにより、pET28a_NgTETで形質転換した大 腸菌 BL21(DE3)株を接種します。37°Cで160rpmで振とうしながら一晩インキュベートします。
  2. 翌日、一晩培養を使用して、30 μg/mLのカナマイシンを含む50 mLのLB培地に0.1の初期OD600 にメイン培養物を接種します。OD600 0.4 に達したら、50 μM IPTG で培養を誘導します。
  3. 培養物を37°Cで増殖させ、OD600 0.8に達するまで160 rpmで振とうします。
  4. 0.1の感染多重度(MOI)で目的のファージを培養物に感染させ、120 rpmで振とうしながら室温で4時間インキュベートします。
  5. 4000 × g で 4 °C で 20 分間遠心分離して細胞を回収します。
  6. 上清を0.45μmフィルターに通し、低修飾DNAを有するNgTET処理ファージを得る。ろ過したファージは、将来の使用のために4°Cで保存します。
    注:(一時停止点)ろ過されたファージは、ガラス瓶内のLB培地に保存され、4°Cで数か月間安定です。

2. 検証

注:このステップの目的は、ファージDNA修飾の存在量の減少を実験的に検証することです。

  1. LC-MSによる治療バリデーション(~2日)
    1. スクロース勾配によるファージ精製
      1. ライセートから残留核酸を除去するには、500 μLのファージ懸濁液(>10 10 PFU/mL)を20 UのDNase Iおよび2 μLのRNase A / T1ミックス(4 μgのRNase A、10 UのRNase T1)で処理します。
      2. 混合物を37°Cで30分間インキュベートします。
      3. TMバッファー(50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、pH 7.5)で0〜45%スクロース勾配を調製します。グラデーションミキサーを使用するか、手動でグラデーションを準備します。
        注:手動調製の場合は、まず5 mLのTMバッファーをグラジエントチューブにピペッティングします。次に、鈍い端のカニューレを使用して、チューブの底から 45% スクロース溶液 5 mL をゆっくりとピペットで入れ、0% 溶液を徐々に上昇させます。
      4. グラジエントの上に500 μLの処理されたファージ溶液をロードします。
      5. 70,000 × g で 4 °C で 20 分間遠心分離します。
      6. 遠心分離チューブを下から点火します。これにより、グラデーションに濁ったバンドとして現れるファージを視覚化できます。鈍いカニューレを使用して、ファージ含有画分を慎重に取り除きます。
      7. 抽出したファージ画分を新しい超遠心分離チューブに移します。
      8. 30 mLの氷冷TMバッファーを加え、100,000 × g で4°Cで1時間遠心分離します。
      9. 上清を廃棄し、ペレットを500 μLのTMバッファーに再懸濁します。
      10. 再懸濁したファージをガラスバイアルに入れて4°Cで一晩保存します。
    2. ファージDNA単離
      1. 再懸濁したファージに1μgのプロテイナーゼKを加えます。
      2. 37°Cで30分間インキュベートします。
      3. フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(P/C/I)混合物を1体積加えます。反転で混ぜます。4°Cで15,000 x g で1分間遠心分離して相を分離します。 水相を新しい反応管に移します。抽出を3回繰り返します。
        注意:フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(P/C/I)は、毒性が高く、腐食性があり、揮発性です。白衣、安全ゴーグル、二重ニトリル手袋などの適切な保護具を着用しながら、常にドラフトフード内で取り扱ってください。皮膚や目の接触を避け、密閉容器に入れて指定された薬品キャビネットに保管してください。承認された有害廃棄物チャネルを通じて廃棄物を処分します。接触した場合は、すぐに水ですすぎ、医師の診察を受けてください。
      4. 残留フェノールを除去するには、1容量のクロロホルムでクロロホルム逆抽出を3回行います。
      5. -20°Cで0.1体積の3 M NaOAc(pH 5.5)と2.5体積のエタノールでDNAを一晩沈殿させます。
      6. 翌日、15,000 × g で4°Cで1時間遠心分離してDNAをペレット化します。
      7. DNAペレットを200 μLの70%エタノールで2回洗浄し、穏やかに振とうし、15,000 × g で4°Cで15分間遠心分離し、上清を慎重に除去します。
      8. 精製したDNAを超純水に再懸濁します。
      9. さらに使用するまで、DNAを-20°Cで保存します。
        注:(一時停止ポイント)沈殿したDNAは、-20°Cで数ヶ月間保存できます。
    3. LC-MS分析用ファージDNAの調製
      1. ヌクレオシド消化ミックスを使用して、精製したDNAを単一ヌクレオシドに消化します。
      2. LC-MSによるDNA組成の分析
        注:このステップにより、NgTET治療の有効性を検証できます。このプロトコルは、ラボで利用可能な特定の機器とカラムに適応していますが、利用可能なリソースと条件に基づいて調整できます。
      3. 精製ファージから単離した消化DNAを使用します(ステップ2.1.10)。
      4. 測定には、dA、dT、dG、dC、5hmdC、5fdC、5cadCの市販の標準を含めます。可能な場合は、ファージDNAに存在するシトシン過剰修飾の標準を含めます。
      5. C18カラム(150×2.1 mm、100 Å、3 μm)と20×2.1 mmガードカラムを備えたHPLCシステムを使用してください。
      6. カラム温度を 40 °C、溶離液流量を 0.2 mL/分に設定します。
      7. 次のように溶離液を調製します。
        溶離液A:10 mM酢酸アンモニウムの水溶液(pH 4.5)。
        溶離液B:メタノール中の0.1%ギ酸。
        注意: メタノール中の0.1%ギ酸は可燃性であり、皮膚、目、気道を刺激する可能性があります。常に換気の良い場所またはドラフトで使用してください。白衣、安全ゴーグル、ニトリル手袋などの適切な保護具を着用してください。熱、火花、裸火から遠ざけてください。可燃性の収納キャビネットに保管してください。承認された有害廃棄物プロトコルに従って廃棄してください。
      8. 次の移動相プロファイルを適用します。0-1 分:5% B で一定。1〜5分:5%から90%Bへの勾配。5〜7分:90%Bで一定。7-7.1分:90%から5%Bへの勾配。7.1-12分:5%Bで一定。
      9. 質量分析計を負イオン化モードと正イオン化モード(別々の注入)で、高温エレクトロスプレーイオン化(H-ESI)源で次の条件下で使用します。
        H-ESIスプレー電圧:3400 V(+)、2400 V(-)、シースガス:35任意単位、補助ガス:7任意単位、スイープガス:0任意単位、イオントランスファーチューブ温度:300 °C、気化器温度:275 °C、検出モード:Orbitrap質量分析計を使用したフルスキャン、質量分解能:120,000、質量範囲:200-450(m/z)。
      10. Tracefinderソフトウェアを使用して、[M-H]- (dA、dT、dC、5hmdC、5fdC、5cadC)および[M+H]+ (5ghmdC)型のイオンクロマトグラムを抽出します。
      11. サンプル固有の内部標準としてdGを使用して、各シグナルのピーク面積をサンプル内のdGピーク面積に正規化することにより、各修飾の相対存在量を計算します。
  2. CRISPR-Cas切断アッセイによるバリデーション(~2.5日)
    注:このステップにより、NgTET治療の成功とCRISPR-Cas切断への影響の表現型評価が可能になります。NgTETが活性である場合、保護DNA修飾の除去によりゲノムがCRISPR-Cas12または9切断の影響を受けやすくなるため、処理されたファージDNAからプラークが形成されないか、ファージ力価が低下する必要があります。対照的に、ファージDNAが未処理の場合、形成されたプラークの数はファージの力価に対応し、過剰修飾されたT4ファージゲノムがCRISPR-Cas12または9切断に耐性があることを示します。
    1. pET28a_NgTETプラスミドとCas12またはCas9発現プラスミド(スペーサーなしのDS-spCasまたはpCpf1など)の両方で形質転換した一晩培養から大 腸菌 BL21(DE3)を接種します。追加情報を含むすべてのプラスミドを 表1に示します。
      1. 適切な抗生物質を添加したLB培地で、3°Cで0.1のOD600 から始めて、振とうしながら細胞を増殖させます。培養物が約0.4のOD600 に達したら、0.05 mM IPTGを添加してNgTET発現を誘導し、3°Cでさらに2時間インキュベートします。
      2. 対照として、NgTET過剰発現の有無にかかわらず 大腸菌 BL21(DE3)株を比較します。NgTET活性がない場合、より多くのプラーク形成ユニットが予想され、ファージDNAにグリコシル化5ghmdCが存在するため、CRISPR-Cas効率が低下することを示しています。
    2. 300 μLの 大腸菌 培養物を滅菌チューブに移します。
    3. 培養物を MOI 0.01 の T4 WT または NgTET 処理ファージで感染させます。この実験では、細菌が一度に1つのファージにのみ感染するように、低いMOIを適用します。これにより、CRISPR-Cas切断スクリーニングの効率が最大化され、結果の解釈が簡素化されます。ファージが均一に分布するように穏やかに混合します。
    4. バクテリアファージ懸濁液を37°Cで7分間インキュベートします。
    5. 抗生物質を添加した4 mLのLB軟寒天培地(0.75%)に細菌-ファージ混合物を加えます。気泡が入らないように、十分に、しかし穏やかに混ぜてください。
    6. 柔らかい寒天混合物を予熱したLB寒天プレートに注ぎます。
    7. プレートを室温で短時間固化させます。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
    8. 翌日、得られたプラークを数えて、プラーク形成単位(PFU)を決定します。

3. CRISPR-Cas変異誘発(~1週間)

注:CRISPR-Cas変異誘発は、ファージゲノム内の特定の部位がファージ感染中にCasヌクレアーゼによって標的となり、二本鎖切断を引き起こすという原理に基づいています。この切断は、変異誘発中に感染した宿主株に存在する2番目のプラスミドに提供されるドナーDNAを使用した相同組換えによって修復されます。ドナーDNAを含むプラスミドは、前述のように、修飾シトシンの存在量を減らすことにより、CasヌクレアーゼのファージDNAへのアクセス性を維持するために不可欠なNgTETもコードしています。このステップでは、大 腸菌15の感染時に、NgTET処理されたT4ファージのゲノムに標的変異が導入されます。T4ゲノムにおけるDNA修飾のレベルを一貫して低くするために、NgTETジオキシゲナーゼは、突然変異誘発プロセス全体を通じて50 μM IPTG(ステップ1.2と類似)の添加によって発現されます。

  1. ゴールデンゲートクローニングによるpET28a_NgTET_donor DNAプラスミドの生成15
    1. ドナーDNAの生成には、目的の配列を遺伝子全体として順序付けするか、ゲノムから増幅するか、たとえばファージゲノムから増幅し、目的の変異を導入します。
      注:ドナーDNAデザインでは、標的部位に隣接する相同領域を含めます(点突然変異の場合は両側に≈200 bp、より大きなインサートの場合はより長い領域)。線状ドナーフラグメントは、切断時にプラスミドと互換性のあるオーバーハングを生成するBsaI認識部位を運ぶ必要があります。コンストラクト設計を検証するには、 インシリコ クローニングをお勧めします。代表的な結果では、ドナーDNAのすべての重要な成分を例に示しています。
    2. Golden Gateアセンブリを使用して、NgTETコード配列とターミネーターの下流にドナーDNAフラグメントをpET28a_NgTETバックボーンに導入します。
      1. 70 fmolのpET28a_NgTETプラスミド、140 fmolのドナーDNAインサート、1 μLのBsaI(20 U / μL)、5 UのT4 DNAリガーゼ、および2 μLの10×リガーゼバッファーを混合して、ヌクレアーゼフリーの水を20 μLの最終容量まで添加して、アセンブリ反応を調製します。
      2. PCRサイクラーで25サイクルで反応を次の設定で実行します:1)制限、37°Cで1.5分間、2)ライゲーション、16°Cで3分間、3)最終制限、37°Cで5分間、および4)変性、60°Cで10分間。
    3. 6 μLの反応混合物(ステップ3.1.2から)を100 μLの化学的にコンピテントな 大腸菌 DH5αに加え、氷上で10分間インキュベートし、42°Cで45秒間ヒートショックします。すぐに細胞を氷上に1分間置き、750 μLのLB培地を加えます。37°Cで振とう(500 rpm)1時間回復します。カナマイシン(30 μg/mL)を含むLB寒天培地にプレートし、37°Cで一晩インキュベートします。
    4. 単一のコロニーを選択し、カナマイシン(30 μg/mL)を添加した20 mLのLB培地を接種します。37°Cで160rpmで振とうしながら一晩インキュベートします。
    5. 5 mLの一晩培養から、細胞をペレット化し、標準的なプラスミド抽出法を使用してプラスミドDNAを単離します。プラスミドを40 μLのヌクレアーゼフリー水で溶出します。
    6. サンガーシーケンシングを使用してプラスミドの挿入部位をシーケンシングすることにより、正しいクローニングを確認します。
  2. スペーサー含有CRISPR-Casプラスミドの構築(モデルとしてのpCpf1-sp)15
    注:この章で説明するプラスミドは、ファージゲノムに部位特異的二本鎖切断を導入することにより、突然変異誘発の最初のステップを可能にします。ここでは、CRISPR-Cas12システム(pCpfl-spプラスミド)を使用して手順を示しますが、CRISPR-Cas9(DS-spCasプラスミド)などの代替ヌクレアーゼも使用できます15 。
    1. 変異誘発部位を標的とする20-ntスペーサー(PAM:TTTV)を設計します。バイオインフォマティクスツールを使用して、適切なプロトスペーサーと対応するスペーサーを特定して設計します。
    2. 2つの5'-リン酸化オリゴヌクレオチドを合成します。それぞれが所望のスペーサー配列の10 nt(一緒になって完全な20 ntスペーサーを形成)と、pCpf1-spプラスミド内の挿入部位に相補的な追加の10 nt領域を運ぶことを確認します。
    3. 設計したCRISPR-Casスペーサーを、ステップ2のプライマーを用いたPCR増幅により、pCpf1-spプラスミドに挿入します。反応を次のように設定します(最終容量50 μL):5 μL 10× GCバッファー、1 μL 10 mM dNTP、1 μLフォワードプライマー(10 μM)、1 μLリバースプライマー(10 μM)、2.5 μL DMSO、2 fmolに対応するプラスミドテンプレート、1 μL Phusion DNAポリメラーゼ(2 U / μL)、およびヌクレアーゼフリー水を50 μLまで。
    4. 反応チューブをサーモサイクラーに入れ、次のプログラムを実行します:98°Cで30秒間初期変性。98°Cで10秒間25サイクル、適切な温度(X°C)で30秒間アニーリング、72°Cで6分間伸長します。続いて、72°Cで10分間最終延長します。さらに処理するまでサンプルを4°Cに保持します。
    5. 5 μLのPCR反応をDNAローディングバッファー(10×)と混合し、1%アガロースゲルにロードします。ゲルを130 Vで20分間実行し、UVトランスイルミネーションを使用してDNAバンドを視覚化します。増幅が成功した場合は、適切なクリーンアップキットを使用してPCR産物を精製し、20 μLのヌクレアーゼフリー水で溶出します。
    6. 1× T4 DNAリガーゼバッファーおよび60 U T4 DNAリガーゼと混合した増幅生成物100 ngを、総反応量15 μLでライゲーションしてプラスミドを循環化します。室温で1時間インキュベートします。100 μLの化学的にコンピテントな 大腸菌 を、ステップ3.1.3で説明するようにライゲーション産物で形質転換します。50 μg/mLのストレプトマイシンを含むLB寒天培地に細胞をプレートし、37°Cで一晩インキュベートします。
    7. プレートから単一のコロニーを選択し、50 μg/mLのストレプトマイシンを添加した20 mLのLB培地に接種します。37°Cで160rpmで振とうしながら一晩インキュベートします。5 mLの一晩培養から、遠心分離によって細胞を回収し、選択したプラスミド抽出法を使用してプラスミドDNAを単離します。プラスミドを40 μLのヌクレアーゼフリー水で溶出します。
    8. サンガーシーケンシングを使用して挿入部位でプラスミドをシーケンシングすることにより、クローニングの成功を確認します。
  3. ファージ変異誘発
    1. 大 腸菌 BL21(DE3)細胞を2つのプラスミドで形質転換します:pET28a_NgTET_donor-DNAおよびpCpf1-sp(Cas12)/DS-SPcas(Cas9)スペーサー(ステップ3.1および3.2で生成)。各プラスミド1 μLを100 μLの化学的にコンピテントな 大腸菌 BL21(DE3)と混合します。手順 3.1.3 で説明されているプロトコルに従います。形質転換した細胞を50 μg/mLのストレプトマイシンと30 μg/mLのカナマイシンを含む寒天にプレーティングし、37°Cで一晩インキュベートします。
    2. 形質転換した 大腸菌 株(大腸菌 BL21(DE3)pET28a_NgTET_donor-DNAおよびpCpf1-sp(Cas12)/DS-SPcas(Cas9)_spacer)を、30 μg/mLのカナマイシンと50 μg/mLのストレプトマイシンを添加した10 mLのLB培地に接種します。37°Cで160rpmで振とうしながら一晩インキュベートします。
    3. 翌日、30 μg/mLのカナマイシンと50 μg/mLのストレプトマイシンを含む50 mLのLB培地で、一晩培養を0.1の初期OD600 に希釈します。
    4. OD600 が 0.8 に達するまで、160 rpm で振とうしながら 37 °C で培養物を増殖させます。温度を室温(RT)まで下げ、撹拌速度を130rpmに下げます。
      1. ファージの吸着とDNA注入を強化するには、MgCl2 とCaCl2 をそれぞれ1 mMの最終濃度まで添加します。
      2. 培養物をNgTETで前処理したT4ファージで感染させ、ネガティブコントロールとして、NgTETで未処理のT4ファージをMOI0.1で感染させます。RTで4時間インキュベーションを続けます。
    5. インキュベーション後、培養物を50 mLのコニカルチューブに移し、4000 × g 、4°Cで20分間遠心分離して細胞をペレット化します。上清を0.45μmフィルターでろ過し、残留細菌細胞を除去します。ろ過した上清をプラークアッセイ(ステップ2.2で説明)に使用して、ファージ濃度を決定するか、逆選択を実行します。

4. 変異体の同定

注:逆選択の目的は、突然変異誘発後に集団に残る野生型ファージの割合を減らすことです。このために、変異誘発ステップ(ステップ3.3)から得られたファージを使用して、同じCRISPR-Cas13系を保有する大 腸菌 に感染し、これは別のプラスミドpBA560( 表1の追加情報)および変異誘発中に適用された同じスペーサー配列によってコードされる。このセットアップでは、Casヌクレアーゼは野生型ファージDNAを選択的に認識して切断しますが、目的の変異を持つファージは影響を受けません。この選択圧は野生型複製を抑制し、変異ファージの集団を濃縮します14。

  1. Cas13 による逆選択
    1. 大 腸菌 Cas13a_spacer(プラスミドpBA560)を逆選択のためのファージで感染させます。このステップは、意図した変異を受けていないファージRNAを分解することにより、逆選択を容易にします。
    2. 変異誘発時に使用したのと同じ条件下でカウンター選択を行います(手順3.3.1-3.3.5を参照)。非標的Cas13aスペーサーを発現する 大腸 菌をネガティブコントロールとして使用して、プラークの減少がスペーサー特異的であることを確認します。
    3. インキュベーション後、逆選択ファージを含む上清を0.45μmフィルターでろ過し、細菌の破片を除去します。
      注:(一時停止点)ろ過されたファージは、ガラス瓶内のLB培地に保存され、4°Cで数か月間安定です。
    4. 大 腸菌 B株のプラークアッセイに逆選択およびろ過されたファージを使用して、下流の検証のために個々のプラークを単離します。
  2. 次世代シーケンシング(~1週間)
    注:高度に多重化されたシーケンシングアプローチの方法は、ロングリード次世代シーケンシング16に適したマルチプレックスアンプリコンDNAを生成するための2段階のPCRプロセスを含む。
    1. ステップ2.2で説明したように、ファージをプレーティングすることにより、突然変異誘発からファージを分離します。NgTET発現の存在下と非在時の両方で行われた変異誘発から得られたファージを使用して、適切なコントロールを含めます。対照として、NgTETを使用しないCRISPR-Cas9およびCas12のターゲティングは、点変異の導入をもたらすべきではありません。対照的に、NgTET の共発現により編集が成功し、変異誘発効率の向上につながることが期待されます。
    2. 単一のファージを単離するには、プレートから個々のプラークをピックし、100 μLのPi-Mgバッファー(26 mM Na2PHO4、68 mM NaCl、22 mM KH2PO4、1 mM MgSO4、pH 7.5)および1 μLのCHCl 3を含むチューブに移します。
      注意: クロロホルムは有毒で揮発性があり、少量であっても発がん性の疑いがあります。ヒュームフードでのみ取り扱い、白衣、安全ゴーグル、ニトリル手袋などの完全な保護具を着用してください。吸入や皮膚への接触を避けてください。換気の良い可燃性の化学薬品キャビネット内の密閉容器に保管してください。有害廃棄物収集によるクロロホルム廃棄物の処分。
    3. スクリーニングのテンプレートとして、Pi-Mgバッファー中の1 μLの単離ファージT4を使用します。
    4. 0.125 μMの各プライマー(挿入位置の周囲)と1x高精度ポリメラーゼマスターミックスで反応ミックスを調製し、増幅反応の総量を10 μLに調整します。30回の増幅サイクルでPCR反応を実行します。
    5. 2回目のPCRを実行して、バーコードを添付します。したがって、最初のPCRからの生成物の1:10希釈液を1 μLをテンプレートとして使用します。
    6. 0.3 μMのバーコードプライマーと忠実度の高いホットスタートポリメラーゼミックスを総容量7 μLで反応ミックスを調製します。20倍増サイクルでPCRを実行します。
      注:(一時停止ポイント)PCR-製品は-20°Cで数週間保存できます。
    7. すべてのバーコード付きPCR産物をプールし、次世代シーケンシングライブラリ調製のための標準プロトコルに従って磁気ビーズベースのクリーンアップを使用して精製します。
    8. 磁気ビーズを使用してDNAを捕捉し、80%エタノールで2回洗浄し、100 μLの溶出バッファー(5 mM Tris-HCl、pH 8.5)で溶出します。
    9. 分光光度法および蛍光法を使用してDNA濃度を測定し、必要に応じて広範囲または高感度アッセイのいずれかを適用します。
      注:(一時停止ポイント)DNAは-20°Cで数週間保存できます。
    10. 1 μgのインプットDNAから始めて、製造元の指示に従ってライゲーションベースのプロトコルを使用してシーケンシングライブラリーを生成します。

5. DNA修飾の変異体増殖回復と証明

注:目的のファージ変異体が同定されると、野生型大 腸菌 で増殖して、WTファージと同様のDNA修飾レベルを回復します。これにより、変異ファージは、導入された変異を除いて、その後の生物学的実験に妥協することなく利用できるようになります。

  1. LB培地で大 腸菌 B株の10 mL培養物を調製し、160 rpmで振とうしながら37°Cで一晩インキュベートします。
  2. 翌日、新鮮な50 mL LB培地に一晩培養物を接種し、0.1の初期OD600 を達成します。
  3. 培養物を37°Cで増殖させ、OD600 0.8に達するまで160 rpmで振とうします。
  4. 50 μLの変異ファージストック(4.2.2)を培養物に加えます。CHCl 3 が転移しないように、相を慎重に取り除きます。
  5. 感染した培養物を室温で120 rpmで穏やかに振とうしながら一晩インキュベートします。
  6. インキュベーション後、培養物を4000× g で遠心分離して細菌細胞を除去します。上清を0.45μmフィルターでろ過し、ファージを回収します。
  7. ろ過した変異ファージをガラス容器に移し、さらに使用するまで4°Cで保存します。
    注:(一時停止点)ろ過されたファージは、ガラス瓶内のLB培地に保存され、4°Cで数か月間安定です。
  8. DNA修飾、特にグリコシル化シトシンの再生のオプションの検証として、手順2.1で説明したようにLC-MS分析を実行します。
    1. この目的のために、ステップ2.1.1で概説したように、回収したファージDNAをファージの子孫から精製し、ステップ2.1.2のように単離し、その後、ステップ2.1.3で説明するようにLC-MS分析用に調製します。
    2. 手順 2.1.3 で説明したように、サンプル固有の内部標準として dG を使用して、各シグナルのピーク面積をサンプル内の dG ピーク面積に正規化することにより、イオンクロマトグラムを分析し、各修飾の相対存在量を計算します。
      注:5ghmdCの存在量を直接検証および比較するために、T4野生型ファージ、NgTETで処理されたT4ファージ、および不活性NgTET D234Aバリアントで処理されたT4ファージを対照として含めることが推奨されます10。

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結果

勾配におけるファージバンドの同定
グラジエントにおけるファージバンドの可視性は、グラジエントにロードされた最初のサンプル中のファージ濃度に依存します。ファージが十分に濃縮されている場合(~>1 × 1011 PFU/mL)、下からグラデーションを光源で照らすことでバンドがはっきりと見えます( 図3を参照)。

ただし、ファージ濃度が低いと、バンドが簡単に見えない場合があります。この場合、ファージの検出を可能にする暗闇の中でチューブを下から照らして視覚化の試みを繰り返すことをお勧めします。

ファージバンドがまだ見えない場合は、鈍いカニューレを使用して上部から勾配画分を慎重に取り除き、画分あたり1.5 mLを収集します。これらの画分は、プラークアッセイを介して分析され、ファージ濃度を決定できます。ファージ濃度が最も高い2つの画分を組み合わせて、その後のDNA抽出を行う必要があります。

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ディスカッション

この研究は、一塩基変化を含む正確な点突然変異をバクテリオファージゲノムに導入するための堅牢で適応性のある戦略を提示します。ワークフローの中心的な要素は、ゲノム編集の精度と効率の両方を確保するために不可欠な、各段階での厳格な検証ステップの統合です。これは、ワークフローの多段階の性質と、ファージとその細菌宿主の間の動的な相互作用を考慮すると、ファージ変異誘発の成功に直接影響する可能性のある多数の変数をもたらします。これらの要因には、とりわけ、I)標的DNA領域のアクセス可能性、II)CRISPR関連ヌクレアーゼの活性、III)大 腸菌 宿主株におけるCRISPR-Cas媒介変異誘発中のドナーDNAの安定性、IV)自然淘汰または進化による所望の突然変異の喪失、およびV)短いファージ感染サイクルによって課せられる時間的制約。これらのパラメータは、最終的に説明されているゲノム編集アプローチの全体的な効率を損なう可能性があります。

以下では、これらの潜在的な影響要因について説明し、ワークフロー内の重要なステッ...

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開示事項

KHとNPは、「ファージのエンジニアリング」の欧州特許出願、欧州特許出願番号23 175 257.7を提出しました。他の著者は、競合する利益を宣言していません。

謝辞

このプロジェクトは、ドイツ研究評議会(DFG;マックスプランク協会からのSPP 2330プロジェクト番号464500427、RTG 2355プロジェクト11、およびRTG 2937(プロジェクト番号505997786)(K.H.へのマックスプランク研究グループリーダーの資金提供)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mL反応チューブザルシュテット72.690.001
15 mLカノシャルチューブザルシュテット62.554.502
15 mL オープントップ薄肉ポリプロピレンチューブベックマン・コールター・ライフサイエンス36170616 mm x 95 mm(超遠心分離用)
50 mL 標準チューブザルシュテット62.547.254
5x GCバッファーサーモフィッシャーサイエンティフィック F519L
6x TriTrack DNAローディング色素 サーモフィッシャーサイエンティフィック R1161
アガロースメリディアンバイオサイエンスバイオ-41025分子グレード
Avanti J-30I 遠心分離機ベックマン・コールター・ライフサイエンスカタログなし 数セリエン-Nr.JKY14M01、https://www.beckman.de/centrifuges/ultracentrifuges/optima-xe
ホウ酸 メルク10043-35-3
BsaI-HF v2NEBR3733S
塩素カルシウムヘキサヒドラートアクロスオーガニック7774-34-797 %、超純粋 
細胞密度計ハーバードバイオクロム 80211630
ケミドックMP バイオラッド12003154
クロロホルムVWRの650498
キュヴェットザルシュテット67.742
ジメチルスルホキシド(DMSO) シグマ・アルドリッチD4540
リン酸水素二ナトリウムネオフロックスGmbH7558-79-4医薬品グレード
使い捨てガラスパスツールピペットVWRの612-1702230ミリメートル
DNase I ロシュ471672800110 U/µL
dNTPミックス(各10 mM dNTP) シグマ・アルドリッチ72004
DS_SPcas_ModA自社製品。https://github.com/MaikTungsten/CRISPRT4/tree/main/Plasmid_mapsCRISPR-Cas12/ModA sgRNAを含むプラスミドコンストラクト
DS-spCas(CRISPR-Cas9システム)Addgene 48645 (addgene アクセサリ番号)ファージ変異誘発のためのスペーサー含有CRISPR-Casプラスミド(CRISPR-Cas9システム)の構築のためのプラスミド(ステップ3.2)
大腸菌B株はT4感染に使用しましたDSMZのカタログなし 数大腸菌 (Migula 1895)Castellani and Chalmers 1919 (DSM 613、ATCC 11303)
大腸菌BL21(DE3)発現株、コンピテント細胞インビトロゲンC600003発現株、コンピテント細胞。
大腸菌DH5&α;クローニング株、コンピテント細胞インビトロゲン18265017クローニング株、コンピテントセル。 
EDTAのロス8043.2
エタノール(絶対) VWRの200-578-6
Flongleフローセルオックスフォード・ナノポア・テクノロジーズカタログなし 数R10.4.1. 化学、https://nanoporetech.com/document/flongle
ジーンJETプラスミドミニプレップキット サーモフィッシャーサイエンティフィック 10242490
GeneRuler 1 kb Plus DNAラダーサーモフィッシャーサイエンティフィック SM1331
GeneRuler ULR DNAラダー サーモフィッシャーサイエンティフィック SM1213
グラデーションマスター108バイオコンプカタログなし 数https://biocompinstruments.com/our-approach/gradient-forming
ヘレウス Pico 17 遠心分離機サーモサイエンティフィック75002410
インフォーサー HT インキュベーター ミニトロンインフォーズAGカタログなし 数https://infors-ht.com/de/produkte/inkubationsschuettler/minitron#productspecs
イソプロピル-&ベータ;-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)シグマ・アルドリッチ367-93-1
カナマイシンカール・ロスT832.1
LB-寒天カール・ロスX969.1
LB-ミディアム(ルリア/ミラー) カール・ロスX968.1
塩化マグネシウム六水和物 シグマ・アルドリッチ7791-18-6
硫酸マグネシウム シグマ・アルドリッチ7487-88-9
MinIONデバイス オックスフロッドナノポアテクノロジーカタログなし 数https://store.nanoporetech.com/eu/minion.html
ModA E165A_fwIDTのGAATTAGTTTCAGATGA
ACAAGCGGTAATGATAC
CAGCT		ModA E165Aの点変異の導入とゴールデンゲートクローニングの粘着性末端の導入のためのフォワードプライマー(ステップ3.1)
ModA E165A_revIDTのカタタガタアガ
TGACTATCCGGAAAC		ModA E165Aの点突然変異の導入とゴールデンゲートクローニングの粘着性末端の導入のためのリバースプライマー(ステップ3.1)
ModA_sgRNA_Cas12_fwIDTのTCTTGTTCATCTACAAC
AGTAGAAATTAATTTAAA
GTTCTTAGACCCG		ファージ変異誘発および対抗選択のためのCRISPR-Cas12/CRISPR-Cas9/CRISPR-Cas13システム用のスペーサーを生成するためのフォワードプライマー(ステップ3.2およびステップ4.1)
ModA_sgRNA_Cas12_revIDTのAGTAATGATAAAGAACT
TTAAATAATTTCTACTGT
TGTAGATGCTAC		ファージ変異誘発および対抗選択のためのCRISPR-Cas12/CRISPR-Cas9/CRISPR-Cas13システム用のスペーサーを生成するためのリバースプライマー(ステップ3.2およびステップ4.1)
NanoDrop ND-1000 分光光度計 サーモフィッシャーサイエンティフィックAZY2019944
NucleoMagキット マシェリー・ネーゲル品番 744970.50
ヌクレオシド消化ミックス ニューイングランドバイオラボM0649S
pBA560(CRISPR-Cas13システム)アドジーン186236 (addgene アクセサリ番号)プラスミドをコードするCRISPR-Cas13システム(ステップ4.1)
pCpfl-spプラスミド(CRISPR-Cas12システム)アドジーン122186
pCpfl-spプラスミド(CRISPR-Cas12システム)アドジーン122186 (addgene アクセサリ番号)ファージ変異誘発のためのスペーサー含有CRISPR-Casプラスミド(CRISPR-Cas12システム)を構築するためのプラスミド(ステップ3.2)
PCR反応容器ザルシュテット72.991.002
ペクグリーンVWRの732-3196
pET28a_NgTET 自社製品。カタログなし 数プラスミドはリクエストに応じて入手でき、プラスミドマップは次の https://zenodo.org/records/10615143  にあります。
pET28a_NgTET 自社製品。カタログなし 数ゴールデンゲートクローニング(ステップ3.1)によるpET28a_NgTET_donor DNAを構築するためのプラスミド、プラスミド リクエストに応じて入手でき、プラスミドマップは次の https://zenodo.org/records/10615143  にあります。
ペトリプレートザルシュテット82.1473.00192 x 16 mm(カム付き)
Phusion DNAポリメラーゼ サーモフィッシャーサイエンティフィック F-530XL2 U/&マイクロ;L
リン酸カリウムシグマ・アルドリッチ7778-77-0単塩基性
PowerPac ユニバーサル電源バイオラッド1645070
プロテイナーゼK カール・ロス 7528.1100 mg/mL
QIAquick PCR精製キット キアゲン28506
Quantus 蛍光光度計、QuantiFluor dsDNA システムプロメガE2670
RNase A / T1 サーモフィッシャーサイエンティフィックEN05512 mg/mL の RNase A 5000 U/mL の RNase T1  を混合します。
DNA抽出用Roti-Aqua P / C / I カール・ロスX985.1
酢酸ナトリウム シグマ・アルドリッチ127-09-3
塩化ナトリウム シグマ・アルドリッチ7647-14-5
SQK-LSK109ライゲーションシーケンシングキットオックスフォード・ナノポア・テクノロジーズカタログなし 数https://nanoporetech.com/document/gDNA-q-sqk-lsk109
Steritopフィルター、0.22およびマイクロ;M 細孔サイズミリポールS2GPT05RE250 mL および 500 mL
ストレプトマイシン 50 mg/Lカール・ロスHP66.1
サクロースネオフロックスGmbH57-50-1分子生物学 
スイングバケットアルミローター ベックマン・コールター・ライフサイエンスJS[1]24.15
T4 DNA リガーゼ 5 U/&ミクロ;Lサーモフィッシャーサイエンティフィック EL0011
T4 DNAリガーゼバッファーサーモフィッシャーサイエンティフィック B69
試験管、厚壁、リムレスカール・ヘクトGmbH42775054100 mm x 18 mm
サーマルサイクラー、T100バイオラッド1861096
サーモミキサーの快適さ エッペンドルフ5382000015
トリズマベースシグマ・アルドリッチ77-86-1
バス、VWB2 VWRの462-0557容量12L

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