高スループット形式を用いた微生物二次代謝物に対する葉の応答評価

サマリー

このプロトコルは、同じサンプル内で植物イオン漏れ、ペルオキシダーゼ活性、カロース生成を評価するためのハイスループットアプローチを記述しています。

要約

微生物は植物感染時に構造的に多様な二次代謝物を分泌し、その一部は植物細胞によって検出され、ストレス反応を引き起こします。この方法では、イオン漏れの誘導、過酸化物酵素活性、カロース生成を同じ葉片サンプルで測定します。まず、シロイナナズプシス(大麦の葉盤)を96ウェルのプレートに真空浸透させます。4〜6時間後に伝導度を測定し、その後24時間でペルオキシダーゼ活性とカロース沈着を行います。flg22ペプチドは3つの反応すべてを誘導し、手頃な価格の陽性対照群です。サーファクチンとグラミリン環状リポペプチドはそれぞれペルオキシダーゼ活性とイオン漏れを誘導し、植物毒性のT-2トリコテセンはペルオキシダーゼ活性を抑制します。全体として、このアプローチは植物遺伝子型または代謝物処理の複数の比較を可能にします。このアプローチは化学遺伝学やバイオプロピクションに応用され、さらなる研究のためのストレス調節化合物の特定に活用されます。植物遺伝学においては、このアプローチは遺伝的マッピングのための植物集団間の応答を比較し、植物と微生物の相互作用の理解を深めるために用いられます。

概要

植物は多様な微生物分子に反応し、細胞ストレス応答を活性化し、最終的に病気抵抗性につながります。細菌の鞭毛由来のflg22ペプチドのような微生物関連分子パターン(MAMP)は、植物受容体タンパク質によって検出され、さまざまな細胞シグナル応答を開始します。これには、キナーゼカスケード、活性酸素種(ROS)産生、カルシウムの急増、膜脱分極、そしてカロース沈着やペルオキシダーゼ活性誘導といった後期応答1^{が含まれます。}微生物二次代謝物(MSM)は、小さく(50〜1,500ダルトン)、構造的に多様な分子であり、成長や発生には不要ですが、微生物の生存を促進します。一部のMSMは植物に細胞ストレス応答を誘導しますが、これらの反応を開始するメカニズムは未解決のままです ^2,3。植物がMSMを認識する提案されたメカニズムには、機械センシング、酸化還元誘導タンパク質修飾、脂質ベースのシ^{グナル伝達}など^{があります。}場合によっては、MSMは濃度に応じてストレス反応を引き起こしたり、細胞に損傷を与えたりします。例えば、T-2毒素は1μMでカロースとROSの生成を誘導し、10μMで細胞死を引き起こし、通常はフィトトキシン⁴として説明されます。MSMは一部の植物と微生物の相互作用における病因に影響を与え、植物の感受性や耐性のいずれかを引き起こすことがあります。例えば、グラミリン環状リポペプチドはROS産生、イオン漏れ、カロース生成を誘発し、大麦に対するフザリウム・グラミネアラム²への感受性を高めます。シリンゴマイシンおよびシリンゴペプチンの環状リポペプチドは植物のROS産生を誘導し、Pseudomonas fluorescens細菌に対する宿主抵抗性を促進します³。他のMSMであるサーファクチンやイチュリンは非病原性微生物によって生成され、植物のストレス反応を誘導することでその後の病原体感染に対する耐性を促進します ^6,7。これらの生物保護MSMは、イオンフラックス、ROS産生、転写変化、カロー^ス産生などの細胞応答を誘導します8。MSMと植物の相互作用を理解することで、MSMが病気抵抗性に果たす役割を明らかにし、作物抵抗性を改善するために活用できる宿主遺伝子を特定する助けとなるでしょう。

MSMによる植物ストレス応答を評価する現在の方法は、通常^、1つのストレス反応を1つずつテストすることです。二次MSMは抽出が困難で代謝物の量も限られているため、同じサンプル内で複数の反応を検査することで、MSMが植物細胞に影響を与えることを確信させることができます。細胞内膜ROSバーストを評価する高スループット法の一つは、ホースラディッシュ過^酸化酵素9の存在下で酸化ルミノールによって発生する発光を検出することです。残念ながら、ルミノール系の発光はカチオンや一部の溶媒によって消滅されるため、塩を含む抽出物やDMSOに溶解しなければならない非極性分子への利用が制限されており、これらの^{汚染物質に対応する}方法が必要となります。これらの問題に対処するため、現在の手法を拡張して、同じ葉サンプルから3つのストレス反応(イオン漏れ、過酸化物酵素活性、コロース)を高スループットアッセイで評価しました(図1)10,11,12。私たちのアプローチは、96ウェルプレート内の真空浸透を用いたMSMの葉ディスク処理を含みます。次に、治療後4〜6時間で導電率測定を行いイオン漏れを評価し、その後24時間後に過酸化物酵素活性およびカルロス沈着測定を行います。私たちのアプローチはシロイヌズナと大麦に最適化されていますが、実験的検証により他の植物種にも拡張可能です。例えば、誘導された大麦の過酸化酵素活性はこの方法で検出できませんが、有毒化合物による活性の抑制は検出可能です。したがって、葉の特徴や誘導反応の振幅は種ごとに異なり、この手法の適用性を一部の植物種に限定します。

この方法を用いた実験設計では、最良の結果を得るために使用されているMSMの対照、再現性、濃度を考慮する必要があります。負傷の影響と統計的に異なるレベルのストレス反応を引き起こすMSMを特定するためには、陰性対照が不可欠です。理想的には、ネガティブコントロールにはMSMと同じ溶媒が含まれつつ、MSMは含まれていない状態です。疎水性MSMの典型的な溶媒にはDMSOやメタノールがあり、これらは高濃度でROS産生などの細胞応答を誘導します^13,14。このアッセイでは、10%以上のDMSOおよびメタノールがflg22誘導ペルオキシダーゼ活性を阻害する影響が観察されました(図2)。複雑な抽出物の場合、目的の代謝物が不明な場合、MSMを欠いた陰性コントロールの開発は困難になることがあります。代わりに、サイズ、極性、電荷に基づいて抽出物を分画することで、より応力を強い分画を特定し、さらなる解析に備えます。さらに、1μM flg22や10μM T-2毒素などの陽性対照を含めることで、研究者はアッセイの機能を評価することができます。複数のプレートを実験内で測定する場合、各プレートに4回の技術的再現を含めることを推奨します。

全体として、このアプローチはMSMによる3つの植物ストレス反応を捉え、植物とMSMの相互作用を調査するためのアクセスしやすく費用対効果の高い方法を提供します。ハイスループット形式により、研究者は同一実験単位内で植物遺伝子型や微生物抽出物間の微妙な違いを捉えることができます。これにより、システムレベルで植物遺伝子ファミリーを理解したり、植物集団を調査して遺伝的マッピングを行うことが可能となります。微生物側では、この手法は潜在的な生物保護化合物のスクリーニングや、特定のストレス応答を強化または抑制する化合物を特定する化学ゲノミクスに用いられる可能性があります。

プロトコル

1. サンプルの調製と処理

注意:実験者と環境へのリスクを最小限に抑えるために、すべての適切な安全対策と処分手順を講じるべきです。

1. 植物栽培
   1. シロイドプシスは、コーネルの土壌混合物(ピートモス300、630、バーミキュライト1、徐放肥料4.2石灰)で4〜5週間の育成期まで育てます。1鉢に24鉢、トレイごとに2株ずつ植えます。トレイに水を加えて、下から必要に応じて植物に水やりをします。成長室の温度を21 ^°Cに設定し、16時間の光と8時間の暗闇を保持し、湿度は約30〜50%に保ちます。5^{〜9番目の} 完全に広がった葉を実験に使い、朝に収穫してください。
   2. 大麦は1枚目と2枚目の真葉が完全に膨張するまで、培養土75:ブラックアース24、石灰土1混合土で育てます。1鉢に種を1つずつ、トレイごとに24区画に植え、必要に応じて水やりをします。成長室の条件は21 ^度C、16時間の光と8時間の暗い時間、湿度約30〜50%に設定されます。1枚目と2枚目の完全に展開した葉を試食し、朝に収穫してください。
2. 1株あたり直径4mmのコルクボーラーで3枚の葉盤を集め、中脈を避けます。ねじる動きのある鋭いボーラーを使って組織をマセレーションしないようにしましょう。
3. 葉ディスクを、無菌Milli-Q H₂O196μLの96ウェルプレートのうち1つのウェルに、直ちに優しく置いてください。必要なサンプル数が採取されるまで、ディスクの採取を続けます。
4. 希望の濃度で二次代謝物や溶媒処理を最終体積200μLの個別のウェルに加えます。
5. 蓋を外した96ウェルプレートを真空ノズル付きのベルジャーに入れます。
6. 真空ホースをベルジャーノズルに接続し、真空圧力を回して真空が9.8ポンド/平方インチ(通常10秒)に達するまで続けます。このプロセスをもう一度繰り返してください。
7. 蓋をプレートに置き、軌道シェーカー(55rpm)で、シェーカーの上23cmに置いた光(13W、50μmol∙^m-2∙^s-1)で4時間キュベートします。

2. イオン漏れ測定

1. プローブをミリキューの水で洗い、キムワイプを軽く叩いて乾かします。参考として水の導電率の読み取り値を確認してください。
2. 処理後4〜6時間後に、葉盤を周囲の液体にプローブを浸して個々の井戸から導電率を採取・記録します。プローブが完全に浮上していることを確認するために、プレートを45°の角度で保持してください。
3. サンプルの間にはMilli-Qの水に浸し、Kimwipeでプローブを軽く拭いてすすぐ。時折、プローブの測定値が安定しているか確認するために水の導電率をテストします。
4. プレートにプラスチックのシールフィルムを貼り、軌道シェーカーに戻して一晩抱卵します。

3. ペルオキシダーゼ活性測定

1. ペルオキシダーゼ基質は毎日新鮮に50mL溶液として準備します。蒸留された滅菌水40mLを、スターター付きのビーカーで70 ^°Cまで加熱し、5-アミノサリチル酸50mg(1 mg/mL)を加熱した水に溶かします。水を50mLまで加え、NaOHを使ってpHを6に調整します。溶液は光に敏感なので、アルミホイルで覆うか琥珀色のチューブを使います。
2. 50 mLの琥珀色円錐形チューブで、1% H₂O₂ 溶液として、30% H₂O₂ mL 1.7 mLを48.3 mLのMilli-Q H₂Oに加えて作ります。
3. アッセイ直前に、アッセイ生成に必要な5-アミノサリチル溶液1ミリリットルあたり10μLのH₂O₂ 溶液を10 μL加えます。
4. 処理済みの葉盤をサンプリングするには、各ウェルから所望の時刻で50μLを採取します。透明で平らな底の96ウェルプレートに移し、50μLのアッセイ媒体を加え、ピペッティングで5回混ぜます。
5. 室温で3分間培養し、20μLの2N NaOHを加えて優しくタップして混合し、反応を停止させます。
6. プレートリーダーで595nmのウェルの吸収を測定してください。

4. カロースイメージングと画像解析

1. ペルオキシダーゼアッセイのためにウェルをサンプリングした後、残りの液体を抽出し、酢酸・エタノール(1:3)溶液100μLを加えて固定と染色を行います。プレートに蓋をして、シェーカー(60rpm)でシェーカー(60rpm)で室温で24時間培養します。
2. 染色液を新鮮な溶液に置き換え、室温でさらに24時間培養します。
3. 染色液をピペットで抽出し、各ウェルに100μLの150 mM K₂HPO₄ を加えます。皿をシェイカーに置き、室温で30分間孵化させます。
4. K₂HPO₄ ウォッシュ液を除去し、150 mM K₂HPO₄ 100 μLに0.1 mg/mLのアニリンブルーを加えます。96ウェルの板を蓋とアルミホイルで覆い、シェイカーで少なくとも2時間(シロイナズナ)または一晩(大麦)培養します。
   注意:アニリンブルーは光に敏感で、各技術的複製ごとに新鮮に作る必要があります。
5. アニリンブルー溶液を取り除き、50%グリセロールに置き換えます。96ウェルプレートをアルミホイルで覆い、画像化準備が整うまで4°Cで保存します。
6. きれいなガラススライドの上に50%のグリセロール溶液を一滴置きます。ピンセットで葉っぱの円盤を優しく取り、スライドの上に背面が上に置きます。1.5のカバースリップでカバーし、気泡を最小限に抑え、必要に応じてカバースリップの下にさらに50%のグリセロールを加えて埋めます。
7. 葉の素材を20倍のドライ対物レンズの下で透過白光(明るい視野)でピントを合わせます。
8. アニリンブルーイメージングでは、励起波長を370nm、発光波長を509nmに選択し、露光時間を設定します。十分な信号を確保しつつ、ピクセルの過飽和を避けるために露光時間を最適化しましょう。画像の定量比較のためには、すべての生物学的複製、処理、技術的複製においてレーザー強度と露光時間が一貫していることを確認しましょう。
9. 各リーフディスクごとに3つの異なる視野角を選択し、ステップ4.8で設定したパラメータを使ってそれぞれの画像を取得します。植物素材が視野を完全に埋め、背景の領域が最小限(植物素材でない)で全ての画像を取得します。葉面の単一のZ平面で画像を取得します。
   注:背景情報は避けられない場合があり、後の画像定量化の段階で補正可能です。この例では、水銀ランプとDAPIフィルターキューブ(励起360/40 nm、放出460/50 nm)を用いた直立型エピ蛍光顕微鏡を用いて画像を撮影します。水銀ランプがない場合は、多波長LED光源を使用することが可能です。
10. 画像からカロース斑点を定量化するには、https://imagej.net/Fiji/Downloads のオンライン説明書に従って無料で入手可能なFIJI画像処理ソフトウェアをダウンロード・インストールしてください。FIJIを開いてアニリンブルーの画像をインポートして分析してください。この分析では、解像度が少なくとも300 dpiの.tiffファイルを使用します。分析前に顕微鏡ソフトを使って画像ファイルを.tiff形式にエクスポートするか、FIJIにファイルを開くようにしてください。
    注:Fijiはほとんどの独自ファイル形式(例: .czi、.nd2、.lif、.vsi)を開くことができます。
11. 画像のスケールを設定してください(「 分析」をクリック |顕微鏡セットアップの距離値を用いてスケールを設定しました。
12. 画像を32ビットのグレースケール画像に変換してください(画像をクリック |タイプ |32ビット)。
13. 閾値を調整してください(画像をクリック |調整 |Threshold)は、 自動をクリックし、 閾値曲線上の最小値と最大値を手動で調整することで、アニリンブルー染色を表す蛍光信号のみを含めることができます。閾値が確定したら、「 適用」 |マスクに変換する。スプレッドシートソフトを使って、各画像に選択された閾値パラメータを書き出します。
    注:植物サンプルの固有の自己蛍光と植物組織の除去により、閾値はサンプル間で異なる場合があります。再現性のためには、各画像のしきい値を記録し、サンプル間でしきい値を一貫して調整することが不可欠です。
14. アニリンブループンクタの数とサイズを「 Analyze Particles 」を使って定量化できます(「 Analyze」をクリック |Analyze Particles)をデフォルト設定で使用しています。画像内のすべての句点の平均値については、ポップアップボックスで 「要約 」を選択し、 OKをクリックします。
16. 実験中に取得したすべての画像について、ステップ4.11-4.15を繰り返します。FIJIの閾値画像を閉じる際は、「 保存しない」 を選択して、生データ画像を閾値マスクに変更しないようにしてください。
17. 画像に植物以外の背景面が含まれている場合は、 多角形 または フリーハンド 選択ツールを使って植物組織の領域を手動で輪郭を描き、 面積 を測定してください( 「分析」をクリック |測定)。この値を各画像のスプレッドシートにコピーしてください。
18. スプレッドシートで、1つの生物複製の3つの視野画像の値を平均します。実験の画像に植物以外の領域が含まれている場合(ステップ4.17参照)、各画像の植物組織の面積に基づいてすべての値を補正します。例えば、グラフ作成や統計比較の前に、各画像の植物組織面積でカウント値を割ります。

5. データ分析

1. 同じプレート内で 陽性対照群と陰性対照群をt検定を用いて比較して実験の質を評価します。陽性対照群がストレス応答に有意な変化をもたらさなかった場合は、植物の健康状態、処理のタイミング、陰性対照群、MSMの潜在的な劣化などの実験条件を再評価します。
2. 有意性検定
   1. すべての技術的再現が同じプレート内で評価されている場合、Tukey検定を用いた一方向ANOVAなどの標準的な統計手法を用いて個別処理と陰性対照の違いを分析します。
   2. 複数のプレートで技術的再現を評価した場合は、プレート間誤差の影響を最小限に抑えるために、各サンプルをネガティブコントロールに対して正規化します。各値を同じプレート内の陰性対照サンプルの平均で割ります。正規化された値を標準的な統計手法に適用します。

結果

この方法を用いることで、MSMが植物細胞のストレス応答の一部を活性化しているかどうかを判断できます。このアッセイの結果は、過酸化物酵素活性、イオン漏れ、カロース産生の定量化を提供し、MSMが陰性対照と比較して異なる応答を誘導するかどうかを判断します。化合物の陽性結果は、陰性対照群と有意な差を示すことを示す。グラミリンイオン球はイオン漏れとカロース生成を誘発する(図3)²。3つの反応すべてを誘導する1μM flg22のような陽性対照を含めることで、植物のパフォーマンスと実験条件が完全に維持されます(図3)^11,15。グラミリンとFLG22は水に溶け、疎水性サーファクチンとT-2毒素はDMSOに溶解します。疎水性分子を調製するために、まずDMSOで10 mMのストックを製製します。このストックは、0.1%のDMSOを含むミリQ水で最終濃度10μMの葉処理用に使用されます。スルファクチン(10μM)はペルオキシダーゼ活性とカロースを誘導し、T-2毒素(10μM)はペルオキシダーゼ活性を抑制し、カロース産生を誘導します。^これはおそらく細胞死による^{ものです。}適応された処理には、水または0.1%のDMSOを陰性対照として使用することが適切であり、両対照群とも類似した結果が得られるためです(図2)。

市販の100種類のMSMを対象とした予備スクリーニングでは、調査対象のほとんどの化合物でカロース誘導が見られました(>70%)一方で、イオン漏れやペルオキシダーゼ活性はより少ない化合物(30%と35%)によって引き起こされています。これらの化合物の大部分はフサリウム属によって産生され、デオキシニバレノール(DON)やT-2毒素など7種類のトリコテセンが含まれます。これらの結果を確認するためのさらなる再現研究は進行中ですが、陽性対照群(図3)で見られる傾向と似ており、すべての処理でカロースが誘導され、イオン漏れやペルオキシダーゼが一部の処理で誘発されたものの、すべての処理ではなかったことが示されています。

図1:葉のMSM誘導細胞応答を評価する手順の概要。 葉片のディスクは、対象処理を含む96ウェルのプレートに置かれ、ディスクは真空浸透されます。各プレートには、ネガティブコントロール(溶媒入りの水)とプラスコントロール(flg22またはT-2毒素)の4つのレプリケーションが含まれています。4〜6時間後、葉盤を取り巻く液体の導電率をイオン漏れの定量として測定します。24時間後、葉盤周囲の液体を用いた比色法でペルオキシダーゼ活性を定量し、葉盤を染色してカロース定型処理を行います。略称:MSM = 微生物二次代謝物。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:溶媒がflg22誘導イオン漏れまたは過酸化物酵素活性に与える影響。 4つの複製シロイナズナサンプルに対し、1μM flg22とDMSOまたはメタノールを組み合わせて処理しました(0, 0.01, 0.1, 1, 10%)。棒グラフは、単一実験(n = 4, SD)から処理後4時間後のサンプルの平均導電率または24時間後の過酸化物酵素活性(OD₆₀₀)を示しています。この実験は2回繰り返し行われ、結果は似たものでした。水管理からの有意な差は t検定で判定され、アスタリスク(p < 0.05)で示されました。略称:DMSO = ジメチルスルホキシド;MeOH = メタノール。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:微生物由来分子によるシロイナズナの葉盤におけるイオン漏れ、過酸化酵素活性、またはカロース沈着の誘導。 治療には免疫原性で無毒なペプチドFLG22(1μM)、環状リポペプチドグラミリンおよびスルファクチン(10μM)、およびT-2毒素(10μM^{)が含まれ}ていました^2,6。すべてのデータは水+0.1%のDMSO制御に正規化されました。ボックス&ウィスカープロットは、4時間後のサンプルの導電率、24時間後の過酸化物酵素活性(OD₆₀₀)、または単一実験(n=4-16株)からの24時間後のカロース堆積数を示します。箱プロットは平均値を示す「x」を示し、ボックスは処理の第一四分位数、中央値、第三四分位数を示します。外れ値でない最高および最低の観測値はヒゲで示されます(>1.5倍の四分位範囲、円で示されます)。水管理からの有意な差はアスタリスクで示され、Tukey検定を用いた一方向ANOVAで判定されました(p < 0.05)。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

ディスカッション

植物に定着する微生物群集は多様なMSMを分泌し、バイオフィルム形成を促進し、競合する微生物を抑制し、^植物宿主に影響を与えます。一部のMSMは植物に影響を与えませんが、他は急速な細胞死を引き起こしたり、細胞機能を抑制したり、植物の抵抗性を誘導したりします¹⁷。一部のMSMはMSM産生微生物に対する植物の耐性に影響を与え、耐性遺伝子型はMSMの不感度に基づいて選択できます ^2,3,18。他のMSMは全身耐性を誘導し、微生物病原体からの保護を提供し、農業で病気抑制のための生物保護製品の開発に利用^{されています8。}効果的かつ持続可能な作物改良戦略を開発するためには、最適なMSM応答性を可能にする有益なMSM遺伝子と植物遺伝子の特定が不可欠です。

有益なMSMを見つけるのは、これらの化合物が酵素的に生成されるため、完成品には複数の酵素が必要であることが複雑です^。そのため、遺伝学研究のためにMSM産生を廃止するためにどの遺伝子を標的にすべきかを判断することが困難です。酵素的生合成は、同一MSMに対して複数の構造変異をもたらし、異なる生体活性を持つ可能性があります¹⁹。これらのMSMを分離・精製してバイオアクティブ分子を見つけるのは時間がかかるか、不可能な場合があります。場合によっては、複数の精製ラウンドを経て低濃度の個別MSMのみを精製^{できることもあります。}一度生体活性化合物や抽出物が得られると、微生物が植物にどのような影響を与えているかを理解するためにいくつかのアプローチが用いられます。

過去の取り組みは、モデルプラントにおける転写再プログラミングや生物保護に対するMSMの影響のモニタリングに焦点を当て^{てきました。}モデルプラントを超えたMSMの反応を評価するためには、多様なMSMへの応答を捉え、最小限のMSMで済むハイスループットアッセイが有用です。最近の研究では、ROSの破裂はグラミリン、スルファクチン、シリンゴマイシン、シリンゴペプチン^2,3,7を含むMSMに対する一般的な初期反応であることを示しています。ルミノールベースのアッセイは、ペルオキシダーゼおよびNADPHオキシダーゼによって生成される離胞性ROSバーストを検出し、ハイスループ^{ット試験に適しています}。残念ながら、MSMによって誘発されるセルファクチンのような細胞内ROSは、^{この方法では}検出できません7。過酸化物酵素活性を定量化することは、ストレス時にROS産生酵素の一時的な活性化を検出するために、ルミノール系アッセイよりも感度の高い代替手段^{を提供します。}スルファクチンがペルオキシダーゼ活性を誘導するという観察は、シアビドナシスにおけるセルファクチンとボーベリシンによって誘発されることを示す最近の研究と一致しています(図3)²。さらに、flg22とイオン集グラミリンがイオン漏れを誘発し、flg22、T-2毒素、スルファクチン、グラミリンを含むすべての化合物が期待通りカロースを誘導することを示しました(図3^)2,4,7。

同一サンプル内で複数の反応を評価することで、それぞれの形質を個別に評価する際の実験的変動を最小限に抑え、植物ストレス応答に関するシステムレベルの研究において形質間の相関を可能にします。同じ実験単位内で複数の処理や遺伝子型を評価することで、集団遺伝学における集団レベルの表現型解析も可能となります。例えば、類似の手法が大麦²²におけるFLG22誘発ROS産生の基盤となるQTLを特定するために用いられました。このアッセイは、植物ストレス応答の調節因子を見つけたり、微生物抽出物から生物保護性のMSMを特定したりするための化学遺伝学スクリーニングにも利用できます。

実験手法が関心のあるシステム内で機能していることを保証するために、研究者は以下の要因と制限を考慮する必要があります。

葉組織の質
収穫前に植物の葉組織にストレスがかからないように注意してください。植物がストレスを受けている兆候は種によって異なりますが、一般的にはしおれ、黄ばみ、赤み、斑点、葉の過度な巻き上がりや巻き上げなどが含まれます。葉の組織を採取すると傷が出るため、組織の過剰なマセレーションを避けることで、取り扱いによる背景誤差を減らすことができます。

植物種
このプロトコルは大麦とシロイヌズナの葉に最適化されています。大麦の葉はシロイヌズプシスよりも染色に時間がかかりますが、これはおそらく草の粘土の粘土が厚く、疎水性が増し、処理剤の葉²³への拡散が制限されているためです。これはまた、私たちの手法で過酸化物酵素活性誘導が行われなかった部分を説明しているかもしれませんが、シロイナナズナで示したような毒性化合物による過酸化物酵素活性の抑制が確認されました(図3)。サンプルあたりの葉盤数を5に増やし、pHを5、6、または7に調整し、真空浸透回数を10に増やし、基質の濃度を修正するか、グアイアコール²⁴に変える試みを行いました。葉盤や浸潤の回数が増えるとペルオキシダーゼ活性が増加したものの、陰性対照とFLG22の差は依然として小さい(flg22で10%増加)または実験間で有意ではありませんでした。大麦はflg22に対してROS産生、カロース産生、ペルオキシダーゼ発現を誘導することがわかっています^25,26。トウモロコシの根では、タンパク質抽出物がMAMP誘導による過酸化酵素活性を示しており、誘導を観察するためにはタンパク質抽出が必要であり、本実験²⁴では葉ディスクからのタンパク質活性を検出するのではなく、誘導反応を観察する必要がある可能性が示唆されています。我々のアッセイでは、損傷は明らかに陰性対照サンプルでペルオキシダーゼ活性を誘導します。なぜなら、毒素曝露により細胞が死ぬとこの活性は消失するためです。FLG22治療は損傷と同じペルオキシダーゼを誘導し、誘導が起こっていないように見せかけることもあります。あるいは、アッセイの感度が微妙な変化を検出できないか、ペルオキシダーゼが溶液中にうまく溶け込んでいない可能性もあります。

このプロトコルを他の植物種に適用するには、説明した方法を使用し、シロイヌナズナをコントロールとして併用してプロトコルが機能しているか確認することを推奨します。ペルオキシダーゼ活性が低い場合は、サンプルあたりの葉盤数を増やし、真空浸透回数を5回または10回に増やし、他のMAMPやイオンノフォア、T-2毒素などの異なる処理を試すことで陽性の結果が得られる可能性があります。

ネガティブコントロール治療
この方法は比較のために効果的かつ適切な陰性コントロールに依存します。理想的には、ネガティブコントロールは対象のMSM処理と同じ背景溶媒を含みつつ、MSMは含まない状態です。背景溶媒は水で、水と同じくらい測定された応力に影響を与えます。これは、MSMがすでに精製されており、選んだ溶媒に溶解できる場合に実用的な方法です。微生物抽出物を比較する際、陰性対照はMSMの部分精製の副産物であり、同じ背景培地を含みつつ、分画後にMSM濃度が低下したものの、あるいは、実験者がMSM含有抽出物を生成するための培養培地をネガティブコントロールとして使用することも可能です。これらのより複雑な試料では、負の対照群に伝導率測定値を増加させる塩が含まれていたり、溶媒が過酸化物酵素活性を抑制したりすることがあります(図2)。塩がイオン漏れ結果に影響を与えているかどうかを判断するために、実験者は葉盤がない状態で陰の対照群とサンプルの導電率をテストし、試料自体か葉自体が導電率の変化を引き起こしているかを判断できます。溶媒がペルオキシダーゼ反応に影響を与えているかどうかを判断するために、実験者は陰性対照群にflg22を加え、水に溶けたFLG22と比較して違いがあるか確認します。ネガティブコントロールにおける溶剤、着色化合物、過剰な塩分がMSMの影響を覆い隠す可能性があり、したがってこの方法はすべてのシナリオに適しているわけではありません。

サンプリング時間
治療は朝に開始することが重要です。誘導性防御反応は概日リズムに従い、朝早くに最も振幅が大きいため^です。私たちの経験では、シロイヌナプシスはグラミリンに対してイオン漏れを大麦やトウモロコシ(4〜7時間)よりも速く(4時間)発生させ、そのため実験パラメータ^2,28を確立するには時間経過が必要になる場合があります。細胞応答性は時間とともに低下するため、治療後30+時間を超えるストレス反応の検査は推奨しません。

濃度
MSM濃度は植物のストレス反応を引き起こす非線形的な影響を及ぼす可能性があり、これをホルメシス²⁰と呼びます。MSMの入手可能性や溶解度に応じて、実験者は理想的には様々なMSM濃度でプラントの応力応答をテストします。典型的な濃度は100 nMから1,000 μMの間を出^{発点として}2,11,20です。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5-アミノサリチル酸	ミリポーア・シグマ	A79809
バーナート真空ポンプ	職人技術グループ	400-3910
COND-905マイクロ伝導率プローブ	ラザール研究所株式会社
FLG22ペプチド	アナスペック	AS-62633
インフィニット 200PRO F	テカン・グループ株式会社	30190086
サーファクチン	シグマ・オルドリッチ	S3523
T-2毒素	ケイマン・ケミカル・カンパニー株式会社	20433