カン ジダ・アルビカンス 水溶性抽出物誘発性川崎病関連冠動脈炎マウスモデルの確立と評価

サマリー

CARES誘導マウスモデルは、川崎病の急性炎症から慢性線維症への進行を効果的にシミュレートし、主要な病理学的および免疫病理学的特徴を明らかにし、川崎病の標的治療戦略の開発を促進する可能性があります。

要約

川崎病 (KD) は、主に小児が罹患する全身性血管炎であり、冠動脈病変が最も重篤な合併症です。本研究では、 カンジダ・アルビカンスの 水溶性抽出物(CAWS)を用いて最適化されたマウスKDモデルを確立しました。心筋の炎症および関連する病理学的変化は、HE 染色およびマッソン トリクロム染色を使用して評価されました。免疫蛍光法は、心臓組織における免疫細胞の浸潤を検出しました。心筋組織におけるVDAC1タンパク質の発現と局在は、免疫組織化学によって検出されました。 In vitroでは、RAW264.7マクロファージと カンジダ・アルビカンス 胞子を共培養することにより食作用モデルが確立され、LC3免疫蛍光染色とLyso-Tracker Redプローブを使用してオートファゴリソソームの形成と機能が評価されました。用量スクリーニングにより、8 mg が冠動脈炎症を誘発するための最適なモデリング用量であり、この用量での死亡率は中程度であることが判明しました。HE染色により、CAWS注射はマウスのヒト川崎病の特徴と一致する冠動脈病変を安定的に誘発することが示されました。マッソン染色により、マウスのCAWS群において冠状動脈および大動脈の周囲に有意なコラーゲン線維沈着があり、炎症領域と密接に一致し、14日で対照群と統計的に有意な差が観察されたことが確認された(p < 0.001)。免疫蛍光法により、モデリングの14日目に、CAWS群の心臓組織における複数の免疫細胞の浸潤が有意に増加していることが明らかになりました(p < 0.001)。免疫組織化学的結果は、モデリングの28日目に、CAWSグループの心筋組織におけるVDAC1タンパク質の発現が有意にアップレギュレートされたことを示しました(p < 0.001)。 in vitro 実験では、 カンジダ・アルビカンス 胞子に感染したマクロファージでは、初期段階ではオートファゴリソソームの形成が増加し、後期ではオートファジーの流れが遮断され、機能障害が示唆されています。

概要

皮膚粘膜リンパ節症候群の一種である川崎病 (KD) は、5 歳未満の子供に発生し、熱性血管炎を伴う自己免疫疾患です ^1,2,3。研究によると、重度の KD の未治療または 10 日を超える治療コースは、主に冠動脈瘤や冠動脈狭窄症などの重篤な心血管合併症を引き起こす傾向があることが示されています ^4,5。冠動脈瘤の破裂は、小児の後天性心疾患の主な原因である心原性ショックや突然死につながる可能性があります ^6,7。静脈内免疫グロブリンの適用により予後は大幅に改善されましたが、その病因と病因は不明のままであり、標的治療戦略の開発が制限されています ^8,9。したがって、ヒトの病気の特徴を正確にシミュレートできる動物モデルの確立は、現在の研究において緊急の必要性となっている。

現在、川崎病研究の大きな障害は、ヒトの病気の病理を完全に再現する十分に特徴付けられた動物モデルがないことです。現在開発されているさまざまなモデルの中で、ラクトバチルス・カゼイ細胞壁抽出物(LCWE)によって誘発される血管炎モデルは比較的成熟したシステムであり、このモデルは冠動脈炎を引き起こす可能性があります。これは、KD様血管炎における免疫調節不全および特定のサイトカインのメカニズムを研究するために広く使用されています^10,11。カンジダ・アルビカンス(CAWS)の水溶性抽出物によって誘発される血管炎モデルも、ヒト川崎病の病理学的特徴との類似性が高いため、多くの注目を集めています^12,13。複数の研究チームによる体系的な最適化と改善を経て、CARES誘発モデルは川崎病研究の重要なツールに発展しました¹⁴。CAWS は腹腔内注射によって冠動脈の炎症を誘発できますが、ヒト KD 血管炎の正確な病理学的プロセスを完全に再現できないという限界があります。たとえば、ヒトKDの後期病理学では好中球は見つかりませんでした¹⁵が、CAWS注射¹⁶後16週間までこのモデルでは好中球浸潤が依然として発生しました。さらに、CAWS によって引き起こされる血管炎のメカニズムは現時点では完全には解明されていないため、モデル⁹ の深い理解と応用が制限されています。この研究は、CAWS の導入プロトコルを最適化し、疾患メカニズムを解明し、標的療法の開発を促進することにより、KD の標準化された動物モデルを確立することを目的としています。

この研究では、CAWS を利用して、川崎病のより標準化された動物モデルを確立しました。体系的な用量最適化実験により、1日8mgを5日間連続して腹腔内注射することが最適な投与計画であることが判明しました。このレジメンは、動物の高い生存率を維持しながら、冠動脈病変を安定して誘発することができます。さらに、炎症から線維症への移行におけるミトコンドリアのアポトーシスを調節する重要なタンパク質である電位依存性陰イオンチャネル1(VDAC1)の考えられるメカニズムに焦点を当てて、KDの慢性期における線維症の形成におけるミトコンドリア機能障害の役割をさらに調査しました¹⁷。本研究におけるオートファゴソーム/リソソーム共局在解析により、このモデルで異常なオートファジー機能が観察されたことは注目に値します。この最適化されたモデルは、川崎病における冠動脈病変の病因を体系的に研究し、新しい治療戦略を評価するための重要なツールを提供します。

プロトコル

動物データを含むすべての研究実験は、南京医科大学付属淮安第一人民病院の倫理委員会によって承認されました (KY-2024-250-01)。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。

1. CAWSの準備

1. Duongらによって確立されたプロトコルに従って、Sabouraudデキストロースブロスに カンジダアルビカンスを 接種します¹⁸。次に、接種したブロスを37°Cで48時間嫌気性培養し、混合ガスとともに密閉された嫌気性チャンバー内で培養します。
   注:培地の無菌性を確保するには、37°Cでの嫌気性培養条件を厳密に制御して、雑菌による汚染を防ぐ必要があります。
2. C制限培地で繰り返しすすぎ、37°Cで4.5 x gの回転速度で48時間インキュベートします。
3. 同量の無水エタノールを加え、4°Cで一晩放置します。
4. 4.5 x g で4°Cで15分間遠心分離し、上清を取り除き、同量の無水エタノールを沈殿物に加え、4°Cで一晩放置します。
5. 遠心分離後、上清を廃棄し、沈殿物に50mLのアセトンを加え、遠心分離し、沈殿物を乾燥させます。後で使用するために、沈殿物を滅菌生理食塩水に溶解します。

2. 川崎病のマウスモデルの構築

1. 生後4〜6週間のSPFグレードの雄C57BL / 6マウス80匹を選択し、食物と水に自由にアクセスできる管理された条件下で飼育します。
   注:免疫および炎症反応に対するエストロゲンレベルの変動の潜在的な干渉を最小限に抑えるために、この予備モデル確立および特性評価研究では雄マウスのみを使用しました¹⁹。
2. マウスを乱数表法により、3つの異なる用量のCAWS注射群(4 mg、8 mg、12 mg)と1つの生理食塩水対照群を含む4つのグループに均等に分け、各グループに20匹のマウスを分けます。
3. 滅菌生理食塩水(0.9%NaCl)を使用して、CAWS粉末を40 mg / mL、80 mg / mL、および120 mg / mLの3つの濃度に調製します。実験群には実験1日目から5日目の朝に0.1mLのCAWSを注射し、対照群には同じスケジュールで同量の生理食塩水を投与します。
   注:腹腔内注射は、1 mLのインスリン注射器を使用して行いました。操作の際は、マウスを頭を低くして尾を高くして配置し、注射器を挿入したときに大腸や小腸などの臓器に損傷を与えないようにしてください。
4. 毎日午前9時に電子天秤を使用して、フィーダー内の残りの飼料の重量を同時に測定し、マウスのケージごとに24時間の食物消費量を計算します。
5. 最後の注射後3日目、7日目、14日目、28日目に、各グループから3匹のマウスをランダムに選択し、各時点で犠牲にします。
6. 室内の空気であらかじめ満たされた密閉チャンバーにマウスを置きます。圧縮された CO₂ をチャンバー容積の 30% の流量/分で導入します。5分後、死亡を確認するために子宮頸部脱臼が行われました。
7. 心臓検体を採取し、計量します。HE染色により心臓および血管の炎症性病変を観察します。

3. HE染色および等級付け基準

1. 心臓と大動脈弓(約3 mm×3 mm)が急速に分離されました。記載された方法²⁰に従って胸骨正中切開を行う。心臓を大動脈弓からすばやく分離します(約3 mm×3 mm)。収集した組織を10%中性緩衝ホルマリンで24時間固定した。
2. 固定後、段階的なエタノールシリーズ(70%エタノールで1時間、80%エタノールで1時間、95%エタノールで1時間、100%エタノールで1時間)で組織を脱水し、キシレンで透明にし、パラフィンに包埋します。最後に、ブロックを5μmの連続スライスに分割します。
3. H&E染色の場合、切片をヘマトキシリンで5分間染色し、流水で10分間すすぎ、エオシンで2分間対比染色した後、脱水とマウント²¹に進みます。
   注:血管内膜損傷の程度に応じて、3つのグレードに分類されます。グレードIは、主に内皮の腫れと好中球の凝集によって特徴付けられます。グレードIIは、平滑筋の変性、炎症細胞浸潤、および細胞小器官の損傷として現れます。グレード III は、内皮壊死や脱落、フィブリン沈着などの重度の病変を呈します。

4.マッソントリクローム染色

1. 固定後、組織サンプルを段階的なエタノールシリーズを通して脱水し、キシレンで透明にし、パラフィンに包埋します。
2. 脱ろう後、染色の準備として、段階的なエタノールシリーズを介して断片を蒸留水に水和させます。
3. Weigertの鉄ヘマトキシリンで核を5分間染色し、流水で完全にすすぎ、次に細胞質をLichun Red酸フクシンで5分間染色します。
4. 1%ホスホモリブジン酸で1分間分化し、コラーゲン線維をアニリンブルーで3分間直接染色します。1%氷酢酸で素早くすすいでください。
   注:染色の特異性を確保するために、分化ステップのタイミングを厳密に制御してください。
5. エタノールとキシレンで脱水して透明になった後、中性膜を密封します。
6. 汚れた部分を流水ですすぎ、余分な染料を取り除きます。
7. キシレンで透明な段階的なエタノールシリーズを通して切片を脱水し、中性ガムでマウントします。
8. 光学顕微鏡で一定の倍率で切片を観察します。コラーゲン線維は青色、筋線維と細胞質は赤、核は濃い青色に見えるはずです。

5.免疫蛍光染色

1. 細胞または組織切片を固定し、5%BSAで1時間ブロックして、非特異的結合を減らします。
2. 二次抗体と同じ種由来の正常血清を使用し、PBSで1:10の比率で希釈し、サンプルに滴下します。室温で30分間密封します。密封後、PBSで2回優しくすすいでください。
3. 切片を一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートします。 PBSで洗浄した後、蛍光二次抗体を加え、暗所で1時間インキュベートします。
4. コアをDAPIで染色し、焼入れ防止封入剤でシールし、共焦点顕微鏡下で観察します。

6. 免疫組織化学

1. パラフィン切片の脱ろうと水和後、抗原修復を行い、内因性ペルオキシダーゼをブロックします。
2. 抗体のインキュベーションと発色:まず、正常な血清でブロックし、次に一次抗体とHRP標識二次抗体を順番にインキュベートし、最後にDAB発色を行います。顕微鏡下で反応度を制御します。
3. 細胞核をヘマトキシリンで再染色します。脱水して透明にした後、プレートを密封し、顕微鏡下で茶色がかった黄色の正のシグナルを観察します。
   注:実験では、コントロールを設定し、修復と発色の条件を厳密に制御する必要があります。

7. オートリソソーム検出

1. RAW264.7マクロファージを カンジダアルビカンス 胞子と適切な割合(10:1)で共培養し、37°Cおよび5%CO₂ で4時間、8時間、12時間、16時間、20時間、24時間、28時間、32時間、36時間、40時間、44時間、および48時間インキュベートして、食作用モデルを確立します。
2. 予冷したPBSで3回洗浄して、非貪食性胞子を除去します。
3. まず、サンプルを5%BSAで30分間ブロックします。次に、LC3に対する一次抗体(1:200希釈)と室温で1時間連続してインキュベートし、続いてAlexa Fluor 488標識二次抗体を室温で30分間インキュベートします。
4. Lyso-Tracker Redリソソームプローブを細胞に直接添加して、リソソームの局在化を視覚化します。最後に、核をDAPI(1 μg/mL)で5分間対比染色します。
   注:抗体のインキュベーション時間と濃度が正確に制御されるように、操作プロセス全体を暗闇で実行する必要があります。

結果

最初に、マウスの異なる用量のCAWSによって誘発される心筋の病理学的変化を体系的に評価しました。PBS対照群、4 mg CAWS群、および8 mg CAWS群(各グループでn = 20)で死亡は観察されませんでした。対照的に、4 mg 群の炎症反応は軽度であり、モデリング要件を満たしていませんでした。死亡率は12mgのCAWS群(9/20、45%)で、注射後3日目から10日目に死亡した。これらの発見は、12 mg の用量が過度の局所炎症性損傷と全身毒性を引き起こす可能性があることを示唆しています。したがって、この用量はその後の研究から除外されました。8 mg の用量は、許容可能な生存率と最小限の局所副作用を維持しながら、重大な冠動脈炎を効果的に誘発できるため、最終的に最適な投与計画として選択されました。(図1A)。最終的に、8 mg CAWS の腹腔内注射が最適なモデリング用量であると判断されました。実験グループのHE染色結果は、炎症と線維症の典...

ディスカッション

KD における冠動脈瘤 (CAA) と心筋線維症は、長期にわたる心血管イベントの主な原因です。急性期治療の進歩にもかかわらず、患者の約 5% が依然として持続性 CAA を発症しています^28,29。この遅れた病理学的変化のメカニズムはまだ不明であり、動物モデルがその動的プロセスを明らかにすることが緊急に必要とされています³⁰。ヒト KD 患者の心臓組織サンプルは非常に限られており、冠動脈と心筋の長期的な変化を動的に追跡する臨床研究が困難であるため、急性血管炎から慢性線維症までの KD の全プロセスをシミュレートして、その根底にあるメカニズムを明らかにし、介入戦略を模索できる動物モデルが緊急に必要とされています^16、30.

この研究では、...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ヤギの二次抗体であるウサギのIgG Alexa Fluor 488	アブカム	AB15081	ヤギの二次抗体であるウサギのIgG Alexa Fluor 488
嫌気性チャンバー	サーモ・サイエンティフィック	サーモ・サイエンティフィック	嫌気性チャンバー
アニリンブルー	ソーラービオ	G3668	アニリンブルー
反LC3	アブカム	AB192890	LC3に対する一次抗体
生物学的安全キャビネット	サーモ・サイエンティフィック	1500	生物学的安全キャビネット
BSA	ソーラービオ	A8020	BSA
カンジダ・アルビカンス(株)	NBRC	1385	カンジダ・アルビカンス(株)
CD3e	BD バイオサイエンス	561827	FITC ハムスター アンチマウス CD3e(145-2C11)
CD86	BD バイオサイエンス	105013	CD86
CD8a	BD バイオサイエンス	100713	CD8a
細胞培養インキュベーター	サーモ・サイエンティフィック	311	細胞培養インキュベーター
遠心機	サーモ・サイエンティフィック	ST4R プラス	遠心機
共焦点顕微鏡	オリンポス	IX73	共焦点顕微鏡
ダピ	ビヨタイム・バイオテクノロジー	P0131-25ml	ダピ
DMEM	ギブコ	11965126	DMEM
埋め込み機	P.S.Jメディカル	BM450A	埋め込み機
エオシン	ソーラービオ	G1100	エオシン
F4/80	BD バイオサイエンス	123109	F4/80
FBS	ギブコ	16000044	FBS
ホルムアルデヒド	ソーラービオ	P1110	ホルムアルデヒド
完全自動組織脱水機	ライカ・バイオシステムズ	ASP3005	完全自動組織脱水機
ガラス顕微鏡スライド	シトテスト	250124A1	ガラス顕微鏡スライド
H&E染色	ビヨタイム・バイオテクノロジー	C0105M	H&E染色
IHCキット	アブシン・バイオテクノロジー	ABS996-5ml	IHCキット
LC3プローブ	ビヨタイム・バイオテクノロジー	C3018M	LC3プローブ
ロープロファイルミクロトームブレード	サーモ・フィッシャー	3052835	ロープロファイルミクロトームブレード
リソソームプローブ	ビヨタイム・バイオテクノロジー	C1046	リソソームプローブ
マーカーペン	デリ	SK109	マーカーペン
マッソン染料	ビヨタイム・バイオテクノロジー	C0189M	マッソン染料
ミクロトーム	ライカ・バイオシステムズ	HistoCore BIOCUT	ミクロトーム
ニュートラルガム	ソラルビ	G8590	ニュートラルガム
NK1.1	BD バイオサイエンス	561117	NK1.1
光学顕微鏡	ニコン	ニコン	光学顕微鏡
パラフィン	ソーラービオ	YA0012	パラフィン
パラフィンワックス	ソーラービオ	YA0012	パラフィンワックス
PBS	ソーラービオ	P1020	PBS
ホスホモリブ酸	ソーラービオ	G3472	ホスホモリブ酸
VDAC1	アブカム	AB34726	アンチVDAC1