カン ジダ・アルビカンス 水溶性抽出物誘発性川崎病関連冠動脈炎マウスモデルの確立と評価

皮膚粘膜リンパ節症候群の一種である川崎病 (KD) は、5 歳未満の子供に発生し、熱性血管炎を伴う自己免疫疾患です ^1,2,3。研究によると、重度の KD の未治療または 10 日を超える治療コースは、主に冠動脈瘤や冠動脈狭窄症などの重篤な心血管合併症を引き起こす傾向があることが示されています ^4,5。冠動脈瘤の破裂は、小児の後天性心疾患の主な原因である心原性ショックや突然死につながる可能性があります ^6,7。静脈内免疫グロブリンの適用により予後は大幅に改善されましたが、その病因と病因は不明のままであり、標的治療戦略の開発が制限されています ^8,9。したがって、ヒトの病気の特徴を正確にシミュレートできる動物モデルの確立は、現在の研究において緊急の必要性となっている。

現在、川崎病研究の大きな障害は、ヒトの病気の病理を完全に再現する十分に特徴付けられた動物モデルがないことです。現在開発されているさまざまなモデルの中で、ラクトバチルス・カゼイ細胞壁抽出物(LCWE)によって誘発される血管炎モデルは比較的成熟したシステムであり、このモデルは冠動脈炎を引き起こす可能性があります。これは、KD様血管炎における免疫調節不全および特定のサイトカインのメカニズムを研究するために広く使用されています^10,11。カンジダ・アルビカンス(CAWS)の水溶性抽出物によって誘発される血管炎モデルも、ヒト川崎病の病理学的特徴との類似性が高いため、多くの注目を集めています^12,13。複数の研究チームによる体系的な最適化と改善を経て、CARES誘発モデルは川崎病研究の重要なツールに発展しました¹⁴。CAWS は腹腔内注射によって冠動脈の炎症を誘発できますが、ヒト KD 血管炎の正確な病理学的プロセスを完全に再現できないという限界があります。たとえば、ヒトKDの後期病理学では好中球は見つかりませんでした¹⁵が、CAWS注射¹⁶後16週間までこのモデルでは好中球浸潤が依然として発生しました。さらに、CAWS によって引き起こされる血管炎のメカニズムは現時点では完全には解明されていないため、モデル⁹ の深い理解と応用が制限されています。この研究は、CAWS の導入プロトコルを最適化し、疾患メカニズムを解明し、標的療法の開発を促進することにより、KD の標準化された動物モデルを確立することを目的としています。

この研究では、CAWS を利用して、川崎病のより標準化された動物モデルを確立しました。体系的な用量最適化実験により、1日8mgを5日間連続して腹腔内注射することが最適な投与計画であることが判明しました。このレジメンは、動物の高い生存率を維持しながら、冠動脈病変を安定して誘発することができます。さらに、炎症から線維症への移行におけるミトコンドリアのアポトーシスを調節する重要なタンパク質である電位依存性陰イオンチャネル1(VDAC1)の考えられるメカニズムに焦点を当てて、KDの慢性期における線維症の形成におけるミトコンドリア機能障害の役割をさらに調査しました¹⁷。本研究におけるオートファゴソーム/リソソーム共局在解析により、このモデルで異常なオートファジー機能が観察されたことは注目に値します。この最適化されたモデルは、川崎病における冠動脈病変の病因を体系的に研究し、新しい治療戦略を評価するための重要なツールを提供します。

動物データを含むすべての研究実験は、南京医科大学付属淮安第一人民病院の倫理委員会によって承認されました (KY-2024-250-01)。使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。

1. CAWSの準備

1. Duongらによって確立されたプロトコルに従って、Sabouraudデキストロースブロスに カンジダアルビカンスを 接種します¹⁸。次に、接種したブロスを37°Cで48時間嫌気性培養し、混合ガスとともに密閉された嫌気性チャンバー内で培養します。
   注:培地の無菌性を確保するには、37°Cでの嫌気性培養条件を厳密に制御して、雑菌による汚染を防ぐ必要があります。
2. C制限培地で繰り返しすすぎ、37°Cで4.5 x gの回転速度で48時間インキュベートします。
3. 同量の無水エタノールを加え、4°Cで一晩放置します。
4. 4.5 x g で4°Cで15分間遠心分離し、上清を取り除き、同量の無水エタノールを沈殿物に加え、4°Cで一晩放置します。
5. 遠心分離後、上清を廃棄し、沈殿物に50mLのアセトンを加え、遠心分離し、沈殿物を乾燥させます。後で使用するために、沈殿物を滅菌生理食塩水に溶解します。

2. 川崎病のマウスモデルの構築

1. 生後4〜6週間のSPFグレードの雄C57BL / 6マウス80匹を選択し、食物と水に自由にアクセスできる管理された条件下で飼育します。
   注:免疫および炎症反応に対するエストロゲンレベルの変動の潜在的な干渉を最小限に抑えるために、この予備モデル確立および特性評価研究では雄マウスのみを使用しました¹⁹。
2. マウスを乱数表法により、3つの異なる用量のCAWS注射群(4 mg、8 mg、12 mg)と1つの生理食塩水対照群を含む4つのグループに均等に分け、各グループに20匹のマウスを分けます。
3. 滅菌生理食塩水(0.9%NaCl)を使用して、CAWS粉末を40 mg / mL、80 mg / mL、および120 mg / mLの3つの濃度に調製します。実験群には実験1日目から5日目の朝に0.1mLのCAWSを注射し、対照群には同じスケジュールで同量の生理食塩水を投与します。
   注:腹腔内注射は、1 mLのインスリン注射器を使用して行いました。操作の際は、マウスを頭を低くして尾を高くして配置し、注射器を挿入したときに大腸や小腸などの臓器に損傷を与えないようにしてください。
4. 毎日午前9時に電子天秤を使用して、フィーダー内の残りの飼料の重量を同時に測定し、マウスのケージごとに24時間の食物消費量を計算します。
5. 最後の注射後3日目、7日目、14日目、28日目に、各グループから3匹のマウスをランダムに選択し、各時点で犠牲にします。
6. 室内の空気であらかじめ満たされた密閉チャンバーにマウスを置きます。圧縮された CO₂ をチャンバー容積の 30% の流量/分で導入します。5分後、死亡を確認するために子宮頸部脱臼が行われました。
7. 心臓検体を採取し、計量します。HE染色により心臓および血管の炎症性病変を観察します。

3. HE染色および等級付け基準

1. 心臓と大動脈弓(約3 mm×3 mm)が急速に分離されました。記載された方法²⁰に従って胸骨正中切開を行う。心臓を大動脈弓からすばやく分離します(約3 mm×3 mm)。収集した組織を10%中性緩衝ホルマリンで24時間固定した。
2. 固定後、段階的なエタノールシリーズ(70%エタノールで1時間、80%エタノールで1時間、95%エタノールで1時間、100%エタノールで1時間)で組織を脱水し、キシレンで透明にし、パラフィンに包埋します。最後に、ブロックを5μmの連続スライスに分割します。
3. H&E染色の場合、切片をヘマトキシリンで5分間染色し、流水で10分間すすぎ、エオシンで2分間対比染色した後、脱水とマウント²¹に進みます。
   注:血管内膜損傷の程度に応じて、3つのグレードに分類されます。グレードIは、主に内皮の腫れと好中球の凝集によって特徴付けられます。グレードIIは、平滑筋の変性、炎症細胞浸潤、および細胞小器官の損傷として現れます。グレード III は、内皮壊死や脱落、フィブリン沈着などの重度の病変を呈します。

4.マッソントリクローム染色

1. 固定後、組織サンプルを段階的なエタノールシリーズを通して脱水し、キシレンで透明にし、パラフィンに包埋します。
2. 脱ろう後、染色の準備として、段階的なエタノールシリーズを介して断片を蒸留水に水和させます。
3. Weigertの鉄ヘマトキシリンで核を5分間染色し、流水で完全にすすぎ、次に細胞質をLichun Red酸フクシンで5分間染色します。
4. 1%ホスホモリブジン酸で1分間分化し、コラーゲン線維をアニリンブルーで3分間直接染色します。1%氷酢酸で素早くすすいでください。
   注:染色の特異性を確保するために、分化ステップのタイミングを厳密に制御してください。
5. エタノールとキシレンで脱水して透明になった後、中性膜を密封します。
6. 汚れた部分を流水ですすぎ、余分な染料を取り除きます。
7. キシレンで透明な段階的なエタノールシリーズを通して切片を脱水し、中性ガムでマウントします。
8. 光学顕微鏡で一定の倍率で切片を観察します。コラーゲン線維は青色、筋線維と細胞質は赤、核は濃い青色に見えるはずです。

5.免疫蛍光染色

1. 細胞または組織切片を固定し、5%BSAで1時間ブロックして、非特異的結合を減らします。
2. 二次抗体と同じ種由来の正常血清を使用し、PBSで1:10の比率で希釈し、サンプルに滴下します。室温で30分間密封します。密封後、PBSで2回優しくすすいでください。
3. 切片を一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートします。 PBSで洗浄した後、蛍光二次抗体を加え、暗所で1時間インキュベートします。
4. コアをDAPIで染色し、焼入れ防止封入剤でシールし、共焦点顕微鏡下で観察します。

6. 免疫組織化学

1. パラフィン切片の脱ろうと水和後、抗原修復を行い、内因性ペルオキシダーゼをブロックします。
2. 抗体のインキュベーションと発色:まず、正常な血清でブロックし、次に一次抗体とHRP標識二次抗体を順番にインキュベートし、最後にDAB発色を行います。顕微鏡下で反応度を制御します。
3. 細胞核をヘマトキシリンで再染色します。脱水して透明にした後、プレートを密封し、顕微鏡下で茶色がかった黄色の正のシグナルを観察します。
   注:実験では、コントロールを設定し、修復と発色の条件を厳密に制御する必要があります。

7. オートリソソーム検出

1. RAW264.7マクロファージを カンジダアルビカンス 胞子と適切な割合(10:1)で共培養し、37°Cおよび5%CO₂ で4時間、8時間、12時間、16時間、20時間、24時間、28時間、32時間、36時間、40時間、44時間、および48時間インキュベートして、食作用モデルを確立します。
2. 予冷したPBSで3回洗浄して、非貪食性胞子を除去します。
3. まず、サンプルを5%BSAで30分間ブロックします。次に、LC3に対する一次抗体(1:200希釈)と室温で1時間連続してインキュベートし、続いてAlexa Fluor 488標識二次抗体を室温で30分間インキュベートします。
4. Lyso-Tracker Redリソソームプローブを細胞に直接添加して、リソソームの局在化を視覚化します。最後に、核をDAPI(1 μg/mL)で5分間対比染色します。
   注:抗体のインキュベーション時間と濃度が正確に制御されるように、操作プロセス全体を暗闇で実行する必要があります。

最初に、マウスの異なる用量のCAWSによって誘発される心筋の病理学的変化を体系的に評価しました。PBS対照群、4 mg CAWS群、および8 mg CAWS群(各グループでn = 20)で死亡は観察されませんでした。対照的に、4 mg 群の炎症反応は軽度であり、モデリング要件を満たしていませんでした。死亡率は12mgのCAWS群(9/20、45%)で、注射後3日目から10日目に死亡した。これらの発見は、12 mg の用量が過度の局所炎症性損傷と全身毒性を引き起こす可能性があることを示唆しています。したがって、この用量はその後の研究から除外されました。8 mg の用量は、許容可能な生存率と最小限の局所副作用を維持しながら、重大な冠動脈炎を効果的に誘発できるため、最終的に最適な投与計画として選択されました。(図1A)。最終的に、8 mg CAWS の腹腔内注射が最適なモデリング用量であると判断されました。実験グループのHE染色結果は、炎症と線維症の典型的な動的プロセスを示しました。3日目に、主に血管周囲好中球と単球で構成される限局性炎症浸潤が起こりました。7日目までに、炎症範囲は心筋間質に拡大し、重大な心筋細胞の腫脹と間質性浮腫を伴いました。14日目に炎症がピークに達し、心筋線維配置障害と限局性壊死が起こりました。28日目には炎症は緩和されましたが、初期の線維症が形成されました(図1B および 図2A)。対照的に、心筋構造は対照群のすべての時点で正常なままでした。すべての結果は二重盲検評価によって確認され、8 mgのCAWS用量で川崎病の特徴に一致する心筋損傷モデルを安定的に誘導できることが確認されました。

その後、マッソン三色染色法を用いて、CARS誘発性川崎病様血管炎が冠動脈(CA)周囲に持続性線維症を引き起こすかどうかを調査しました。実験結果は、マウスのCAWS注射群において、炎症を起こした冠状動脈と大動脈の壁の周囲に明らかなコラーゲン線維沈着が検出され、これらの線維化領域が炎症細胞浸潤の分布位置と高度に一致していることを示しました。対照的に、PBS対照群のマウスは弱いコラーゲン染色のみを示し、血管壁の正常な構造範囲内に限定されていました(図2A)。定量分析により、14日で有意なコラーゲン線維沈着が起こり、線維化の程度は対照群と統計的に異なっていたことが示された(図2C)。

川崎病の中心的な病理学的変化は、複数の免疫細胞の協調作用を伴う血管壁の免疫炎症反応であることを考慮して22,23、次に、免疫蛍光(IF)染色を通じてCAWSモデルにおける免疫微小環境の特徴的な変化を調査しました。CAWS注射後14日目に、CAWSを注射したマウスの心臓組織に対して免疫細胞マーカーのIF染色を行いました。実験結果は、CAWS治療群のマウスのモデリングの14日目に、冠動脈および心筋組織におけるCD3 + T細胞、CD8 +細胞傷害性T細胞、CD86 + M1型マクロファージ、F4 / 80 +マクロファージ、およびNK1.1 +ナチュラルキラー細胞の浸潤がPBS対照群と比較して有意に増加したことを示しました(図2B,D)。これらの免疫マーカーの発現変化を体系的に分析することにより、CAWSモデルがヒト川崎病の免疫学的特徴を正確にシミュレートできることを検証しただけでなく、さらに重要なことに、疾患の発生と発症におけるさまざまな免疫細胞サブセットの考えられるメカニズムを明らかにし、その後の標的免疫介入戦略の開発に理論的基礎を提供しました。

研究により、ミトコンドリアの機能不全が心筋線維症の根底にある重要なメカニズムであることが確立されています 24,25,26。炎症ストレス下では、ミトコンドリアの品質管理に重要なタンパク質である電位依存性陰イオンチャネル 1 (VDAC1) が、その発現がアップレギュレートされると、ミトコンドリア透過性遷移孔 (mPTP) の異常な開口を引き起こす可能性があることが認識されています。これは、次に、アポトーシスを誘導し、線維芽細胞を活性化します17,27。このメカニズムを調査するために、免疫組織化学を使用して慢性期のVDAC1発現を評価しました。その結果、PBS対照群と比較して、CARES処理群のマウスの心筋組織におけるVDAC1タンパク質の発現がモデリング後28日で有意に上昇したことが明らかになりました(図3)。陽性シグナルは主に線維化領域と血管周囲に局在しており、VDAC1 を介したミトコンドリア機能障害が川崎病モデルにおける心筋線維症に寄与している可能性があることを示しています。これらのデータは、CAWS誘発性心筋損傷の分子メカニズムに関する実験的証拠を提供します。

これまでの研究では、VDAC1を介したミトコンドリア機能障害が川崎病の心筋線維化プロセスに関与していることがわかっていますが、その具体的なメカニズムはまだ解明されていません。ミトコンドリアの恒常性の維持は、オートファジー - リソソーム系の正常な機能に依存していることを考えると。VDAC1は、オートファゴリソソームの形成や機能に影響を与え、ミトコンドリアの異常な蓄積につながることで線維症を悪化させる可能性があると推測しています。この仮説を検証するために、まずマクロファージにおける カンジダ・アルビカンス 胞子感染モデル(RAW264.7)を確立し(図4)、モデルにおけるオートファジーフローとリソソーム活性の動的変化を検出しました。実験結果は、オートファジーリソソームの形成が初期段階(細胞感染後2〜3時間以内)で増加するのに対し、オートファジーの流れは後期(細胞感染後3〜4時間)でブロックされることを示しています。オートファジーフローの変化は、オートファゴソームとリソソームの共局在化後のマージ染色の変化によって評価できます。この結果は、オートファゴリソソームの機能不全が実際に細胞クリアランスの障害につながる可能性があることを裏付けています。

図1:心臓および冠状動脈の組織病理学的分析。 (A)PBSまたは異なる用量のCAWS(4 mg、8 mg、および12 mg;グループあたりn = 20)を注射したマウスの生存曲線。(B) 異なる時点 (3 日、7 日、14 日、28 日) における CAWS 治療群 (8 mg) の心臓の HE 染色結果が提示されました。スケールバー:1500μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:コラーゲン線維症と免疫細胞浸潤の分析。 (A)CAWS 8 mg群と対照群のマッソン染色結果。コラーゲン線維は特徴的な青色を呈し、筋線維と細胞質は赤色で、細胞核は濃い青色です。矢印は真菌の胞子を示します。スケールバー:1500 μm。(B)CAWS 8 mg群と対照群(CD3標識CD3+ T細胞、CD8標識CD8+細胞傷害性T細胞、CD86標識CD86+ M1型マクロファージ、F4/80標識F4/80+マクロファージ、およびNK1.1標識NK1.1+ナチュラルキラー細胞)の免疫蛍光染色結果。スケールバー:200μm。(C)心臓線維症の程度を評価します。心臓線維症の程度は、800倍の倍率で視野の心臓組織における三色染色領域の割合に基づいて評価されました。具体的な方法は次のとおりです。コラーゲン線維は高分子陰イオン染料で明るい緑色に染められているため、800倍の倍率で100視野(厚さ5μmのすべてのスライス)が観察され、心臓線維症の程度は、総面積に占める緑色の面積の割合によって決定されました。パーセンテージが高いほど、線維症はより深刻になります。(D)免疫蛍光染色の結果により、免疫細胞の割合を統計的に分析し、***p <0.001とした。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:28日目のPBS群およびCAWS群におけるVDAC1発現の免疫組織化学的分析。 (A)VDAC1発現の免疫組織化学的分析。スケールバー:800μm。茶色の黒色の粒子は陽性の結果です。(B) VDAC1 免疫組織化学陽性細胞の割合の統計分析、 p < 0.001。(C) VDAC1 免疫組織化学の H スコアの統計分析。データは複数の生物学的複製(グループあたりn = 20匹のマウス)から導き出され、結果は平均±標準偏差で表され、統計的に分析されました(***p < 0.001)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:マウスRAW264.7細胞による カンジダアルビカンスの 食作用後のオートリソソームの検出。 (A)矢印は真菌胞子を示します。スケールバー:25 μm。オートファジーフローの変化は、オートファゴソームとリソソームの共局在化後のマージ染色の変化によって評価できます。(B)オートリソソーム形成速度の経時分析により、関連するパラメータが定量化されます。結果は平均±標準偏差で表され、統計的に分析されました (***p < 0.001)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

著者らは開示するものは何もない。