クロマチンおよびエピジェネティック老化の画像バイオマーカーを用いた単細胞老化の測定

サマリー

このプロトコルは、画像診断に基づくクロマチンおよびエピジェネティック年齢(ImAge)を抽出し検証するためのイメージングおよび計算ワークフローを提示します。

要約

個別化医療の進展と潜在的な若返り戦略を評価するためには、生物学的年齢を反映したバイオマーカーが不可欠です。私たちは、単一核内でのクロマチンとエピジェネティックマークの空間的組織から導き出される画像ベースのバイオマーカーである画像ベースのクロマチンおよびエピジェネティック年齢(ImAge)を導入し、年齢関連の本質的な変化を捉えます。ImAgeは、若返り戦略(カロリー制限や一時的なOct4、Sox2、Klf4、Myc(OSKM)発現による部分的再プログラミングなど)後の有意な減少や化学療法などの治療後の増大による感受度の低下を効果的に捉え、定量化します。さらに、低いImAgeは運動活動の増加と相関しており、生物学的な年齢逆転と並行して機能的改善を捉えている可能性が示唆され、長寿介入を評価する有望な単細胞ツールを提供します。ImAgeは高品質な画像診断と綿密な計算解析を必要とする統合的手法であるため、抽出と検証のための徹底的な指導を提供することを目指しています。この包括的なプロトコルでは、湿式実験室手順(サンプル準備とイメージング)およびオープンソースの計算パイプライン(画像データの環境設定と処理)を適切に活用してImAgeを抽出・検証するためのワークフローを詳細に示します。

概要

平均寿命の増加と世界人口の高齢化は、機能的または生物学的年齢の効果的なバイオマーカーの重要性を強調しています^。1,2,3。これらのバイオマーカーは、病気のリスクや寿命を正確に予測するために不可欠であり、高齢者ケアを大幅に向上させ、関連費用を削減することができます。DNAメチル化(DNAm)時計は生物学^的老化の定量化に顕著な進歩をもたらし^{ましたが、}しばしば線形回帰に依存し、大規模なコホートを必要とするため^、個人特有の微妙で文脈依存的な生物学的要素を見落とす可能性があります^7,8。さらに、これらのシーケンスベースの技術は細胞分解、複雑なサンプル準備、各細胞ごとに高価な試薬を必要とし、サンプル破壊が不利となる高スループット、大規模、または縦断的研究ではコストが高く、困難^です9。

これらの制約を克服するために、私たちは画像診断に基づくクロマチンおよびエピジェネティック年齢(ImAge)を開発しました。これは、単一細胞分解能で老化と若返りを定量化する新しい手法です。この技術は、Alvarez-Kuglenらによって記述されたように、マウスの末梢血およびさまざまな固形臓器に適用・検証^{されました。}本出版物では、最適化されたプロトコルを詳細に説明しており、他の研究者がさまざまな応用に適応・採用できるようにしています。

このアプローチは、従来のDNAm時計と根本的に異なり、単核¹内のクロマチンおよびエピジェネティックマークの空間的配列に基づいて、年齢に伴う内在的な軌跡を捉えます。イメージングベースの方法は明確な利点を持ちます。それは本質的に非破壊的であり、シーケンシングベースの方法とは異なり、処理中に細胞が破壊されないことです。この非破壊的な性質は、クロマチンやエピジェネティックマークの空間構造を単一細胞レベルで保存し、組織内の細胞の空間的文脈を維持することを極めて可能にします。これは従来のシーケンスワークフローではしばしば失われがちな視点です。さらに、画像技術は高価な試薬や細胞ごとの複雑なライブラリー調製を必要としないため、大規模または縦断的な研究において一般的にコスト効率が良いため、時間をかけた繰り返し観察に適しています^10,11。

ImAgeの大きな利点は、年代の回帰を必要とせずに、年齢に関連する軌跡をデータ自体の本質的な主要特徴として明らかにできることです。ImAgeはマウス末梢血、単核細胞、さまざまな固形器官において、年代的年齢と強い相関を示し^ました。重要なのは、ImAgeが生物学的年齢への予想される乱れを効果的に捉えており、化学療法治療後に増加し、肝および骨格筋における一時的なOSKM発現によるカロリー制限や部分的な再プログラミングによる減少を示しています。さらに、ImAgeの読み取り値は、同一年代のマウスにおける運動活動と逆相関することが観察されており、生物学的および機能的年齢の測定において有用であることが示されています。

ImAge手法の導入には、ウェットラボ実験手順¹² と計算解析¹ (図1)の両方の専門知識が必要です。したがって、本論文は両側面に対する包括的かつ段階的なプロトコルを提供します。この最適化されたプロトコルは、ImAgeの普及を促進し、研究者がさまざまな細胞型や組織で単一細胞分解能で染色質やエピジェネティックな組織の変化を年齢に伴う変化を調査できるようにします。このプロトコルでは、ImAgeを決定するのに十分なコントラストと解像度を提供する2つのマーカーであるH3K27acとH3K27me3が代表マークとして選ばれました。研究者はこのプロトコルを再現して生物学的老化を定量化し、長寿介入の影響を評価し、個々の生物レベルでの老化と若返りの過程における本質的な異質性を探ることができます。

プロトコル

すべての動物実験は、スクリップス研究所の施設動物ケア・利用委員会(IACUC)が承認したガイドラインとプロトコルに従って実施されます(プロトコル09-0004-6)。本論文に掲載されたデータは、2か月から14か月までのオスのi4Fマウスを用いて取得されました。関心のある臓器(肝筋および骨格筋)は、13.8か月齢のi4Fおよび同胎対照マウスから採取し、低用量のドキシサイクリン(0.2 mg/ml)を1週間投与しました¹⁴。若年(3.2か月)、年齢(13.8か月)、およびドキシサイクリンでOSKM因子過剰発現(aged-OSKM)を施した年配のサンプルから核を分離しました。

1. 試料のイメージング

1. 試料の調製
   1. 新鮮に解剖したマウス(または他の関心種)から関心のある臓器(肝臓や骨格筋)を採取し、液体窒素で急速凍結します。サンプルは使用準備が整うまで-80°Cで保存してください。
   2. 臓器や組織を冷蔵したモルタルに移し、ドライアイスの上に置きます。凍結した組織に液体窒素を流し、冷えた乳棒で挽きます。事前に冷却された乳鉢と乳棒を使って試料を粉砕し、均一な細かい粉末が得られます。
   3. 事前に冷却した金属ヘラを使って砕いた組織を複数のチューブに分け、未使用サンプルは-80°Cで保存します。
      注:チューブ内の地面組織サンプルは-80°Cで保存するか、核の分離を進めることができます。
   4. メーカーの指示に従い、市販のNuclei Lysis Bufferキットを使用して凍結したアリコットから核を抽出します。
   5. トリパンブルーを使って核を数えます。核とトライパンブルーを等比例で別のチューブで混ぜます。10μlの核トリパンブルー溶液をヘモサイトメーターまたは自動細胞計に移します。
   6. PBS+0.5% BSAで希釈したサンプルを、20〜30 μL/ウェルの体積で10,000個の核をプレートすることが可能です。
2. 板付け準備
   1. プレートマップ( 補足ファイル1に記載)に、板の準備および計算解析に関するすべての関連メタデータを入力してください。サンプル識別子(例:数字や文字)を実際のウェルプレートと同じレイアウトでsampleIDタブに記録してください。実験条件(試料の年齢を含む)を、コンディションタブ内のウェルプレートと同じレイアウトで記録してください。
      注意:条件タブで提供された情報は、各サンプルの年齢層(若年か高齢か)を特定するために使用されます。これらの特定された年齢層は、後に老化(ImAge)予測モデルを構築する際の参考資料となります。したがって、条件タブには年齢に関連するデータや、必要に応じて関連する他の実験条件を含める必要があります。
   2. ターゲットバイオマーカー(例:H3K27me3)を実際のウェルプレートと同じレイアウトでチャネル#(#は数字に置き換える)タブに記録します。すべてのメタデータの組み合わせが一致し、プレートマップタブの連続したテーブル形式に正しく反映されているか確認してください。
      注意:テーブル内の各列は指定されたタブ名(例:「sampleID」)に対応しているべきです。プロジェクトの目的や詳細の記録用に「メタデータ」とラベル付けされた追加のタブが用意されています。この情報はデータ分析には利用されません。必要に応じてこのタブを活用してください。
   3. タブプレートマップをcsvファイル形式にエクスポートし、プロジェクト名(例:project.csv)を付けます。
      注:メタデータタブには、プロジェクトの目的や免疫染色情報をまとめるテンプレートが提供されています。プレートマップテンプレート内のメタデータタブの使用は、メッキプロセス自体では任意です。しかし、計算解析にはsampleID、channel#(#は数字に置き換えられる)などの他のタブが必要です。
3. ウェルプレート(例:384ウェルプレート)で、10,000個の核を20〜30μLの体積でプレートします。1,000 x g(加速度9、減速4)で4°Cで10分間スピンプレートを使います。
4. 8%パラホルマルデヒド(PFA)を1:1の体積でPBSに10分間固定します。
   注意:排気フード内でPFAの手順を実施し、施設の安全手順に従って廃棄物を処分してください。
5. 溶液を取り除きます。0.1Mグリシンを30μL、室温でPBSに5分間加えます。溶液を取り除きます。PBSを100μLで2回洗い、保存用にPBSを30μL加えます。
   注意:細胞は4°Cで保存することも、直ちに免疫標識を進めることもできます。
6. 免疫標識
   1. PBSを削除してください。ブロッキング溶液30μL(2% BSAおよび0.5% Triton X-100 in PBS)を加え、室温で1時間培養します。ブロッキング液を除去してください。
   2. 一次抗体25μLを加えます:マウス抗H3K27ac(1:250)およびウサギ抗H3K27me3(1:250)をブロッキングバッファー(0.4 - 2 μg/mL)で希釈したものです。4°Cで一晩孵化します。
   3. 一次抗体溶液を除去します。100μLのPBSで室温で3回、3分間洗います。
   4. 25μLの二次抗体を追加します:Alexa 488 Donkey Anti-Mouse(1:250)とAlexa 555 Donkey Anti-Rabbit(1:250)をブロッキングバッファー(1 - 10 μg/mL)で希釈します。4°Cで2時間、または室温で1時間培養します。
   5. 100μLのPBSで室温で3回、3分間洗います。30 μL、濃度0.01 mg/mLのDAPI/Hoechst染色。PBSを100μLで洗います。
      注意:プレートは4°Cのホイルで保管するか、直ちに画像検査を進めてください。核分割の段階ではDAPI/Hoechstが必要です。
7. イメージング
   1. 最大解像度を得るために高コンポストイメージャーの画像セル(このデータセットでは20倍が使用されましたが、63倍が推奨されています)。
      注意:任意の高コンテンツイメージャーでイメージングを行うことは可能ですが、このプロトコルは取得画像のフラットフォルダ構造と、取得画像出力として汎用画像フォーマット(例:.tiff)を前提としています(図2)。
   2. 1ウェルごとに複数のフィールドと複数のZスタックを収集し、理想的には細胞核の上から下までカバーします。z軸に沿って10μmのカバレッジ(例:0.5μmのZステップで20枚のzスライス)は通常、ほとんどのマウス細胞核を覆います。大きさや必要なカバレッジは、関心のある種や細胞の種類によって異なります。代表的なイメージングは 図3に示されています。
   3. 画像データをコンピュータに転送し、 図2に示されたフォルダ構造に従って計算解析を行います。
   4. 上記のステップ1.2.2で定義したプロジェクト名の角括弧付き注釈付き接頭辞を画像データフォルダ(例:[project]original_folder_name)に追加します。

2. 画像データの計算解析

1. システムソフトウェア要件準備(初期セットアップのみ必要)
   1. Windowsマシン上で動作する場合は、https://learn.microsoft.com/en-us/windows/wsl/install の指示に従ってWindows Subsystem for Linux(WSL)をインストールしてください。AnacondaまたはMinicondaは、https://www.anaconda.com/docs/getting-started/anaconda/main の指示に従ってインストールしてください
2. 計算環境の準備(初期セットアップのみ必要)
   1. GitHubリポジトリからワークフロースクリプトをダウンロード https://github.com/terskikh-lab/ImAge_workflow。ダウンロードしたファイルを解凍してください。
      注意:データ保存場所は任意に指定されることがあります。ただし、システムファイルの保存場所とは別のディレクトリ(例:WindowsのCドライブ)を選ぶことが推奨されます。
   2. クローンされたImAgeリポジトリを、適切なスクリプト実行のために仮定されたフォルダ構造に合わせるように整理してください(図2)。
   3. LinuxやmacOSで動作している場合はターミナルアプリを開いてください。Windowsで動作している場合はWSLアプリを開きます。
   4. フォルダをクローンされたリポジトリファイルに変更してください。以降、「Command:」という用語は、次のコードを端末アプリケーションにコピー&ペーストし、その後 Enter キーを押す命令を指します。
      コマンド:CD /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
      注意:「/PATH_TO_CLONED_REPOSITORY」をユーザー固有の設定に置き換えてください。例えば、Dドライブの「analysis」フォルダでリポジトリを解凍し、WSLからアクセスした場合、これは「/mnt/d/analysis」となります。
   5. Anaconda/minicondaでインストールされたコマンドラインアプリケーションcondaを使って、Pythonバージョン3.10で新しい計算環境を作成します。
      コマンド: conda create -n ImAge_workflow python=3.10
   6. 新たに作られた環境を起動しろ。
      コマンド:コンダ、起動ImAge_workflow
   7. pip installer(ImAge_workflow環境作成時にインストールされるpythonパッケージインストーラー)を使ってpoetry(pythonパッケージマネージャー)をインストールしてください。
      コマンド:pip install poetry
   8. Poetryを使って必要なPythonパッケージをインストールしましょう。
      コマンド:poetry install(詩のインストール)です
      注意:現在のフォルダがImAge_workflowフォルダであることを必ず確認してください。pwdというコマンドを実行して確認できます。
   9. CUDAをConda環境内で設定し、セグメント段階でグラフィック処理ユニット(GPU)の機能を有効にして高速計算を実現します(LinuxまたはWindows PC搭載Nvidia GPUのみ適用)。
      コマンド: mkdir -p $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d
      echo 'NVIDIA_PACKAGE_DIR=$(dirname $(Python -c "import nvidia;print(nvidia.__file__)")' >> $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d/env_vars.sh
      エコー 'for dir in $NVIDIA PACKAGE_DIR/*;もし [ -d "$dir/lib" ];次にエクスポート LD_LIBRARY_PATH="$dir/lib:$LD_LIBRARY_PATH";Fi Done' >> $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d/env_vars.sh
      注意:スクリプトは自動的にサーバー上のGPUの可用性を検出します。GPUがなければ、デフォルトでCPU上で動作します。
3. 以下に説明する計算を実行します。
   注:計算解析は、核の分割、画像特徴抽出、老化(ImAge)軸の構築、そしてImAgeの予測の4つのステップで構成されています。各プロセスはPythonスクリプトで実行されます。o1_illumination_correction、o2_segmentation、o3_extract_features、o4_ImAge_validation。これらすべてのステップは、1つのPythonスクリプト、main.py に含まれています。抽出されたImAgeの読み取り値は、以下に示されるボックスとバイオリンプロットを用いて可視化できます。 図4.ImAgeの読み出しは、サンプルを行、対応する読み出し、メタデータを列として表現するシンプルなテーブル形式(標準的な.csvファイル形式)でも抽出可能です。ユーザーは必要に応じてImAgeの数値解析を追加で行う柔軟性があります。これらのプロットとCSVファイルは、Pythonスクリプト visualization.py を使えば取得できます。ImAge予測プロセスは、同じ組織内の個々の細胞から得られたブートストラップ信号を利用します。これらのブートストラップ信号は、ランダムサンプリングと繰り返しの反復から導き出された平均化された信号です。このアプローチは、分析が最も信頼性が高く代表的な結果を捉え、分析の不確実性を組織の本質的な異質性に比例させることを目指しています。
   1. LinuxやmacOSで動作している場合はターミナルアプリを開いてください。Windowsで動作している場合はWSLアプリを開きます。
      コマンド:CD /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
      注意:現在のフォルダがImAge_workflowフォルダであることを必ず確認してください。pwdというコマンドを実行して確認できます。
   2. 環境を活性化しろ。
      コマンド:コンダ、起動ImAge_workflow
   3. コードやテキストエディタ(例:Notepadアプリ、Microsoft Visual Studio Codeなど)でワークフロー/main.py ファイルの解析パラメータを設定してください。
      1. 変数pのプロジェクト名を、出力を整理するための短いファイルシステム安全識別子(例:p = brain_3ages_k27me3)に設定します。
      2. chsで特徴抽出用のチャンネルリストを設定します。解析に必要な場合は、そのチャネルの特徴量をセグメントチャネルを含めます(chs = ['DAPI', 'H3K27me3', 'H3K27ac'])。
      3. imageIndexを使って、ファイル名からプレートマップの列へ画像チャネル識別子をマッピングします。イメージングシステムが画像データを取得するために使用するチャネルラベル形式を特定し、そのラベルをキーとして使用します。各ラベルを、ステップ1.2.2に保存されたプレートマップ内の正確な大文字・大文字別カラムヘッダーにマッピングします(例:imageIndex = {'1': 'Channel1', '2': 'Channel2', '3': 'Channel3'})。
         注意:列名は大文字に左右され、プレートマップファイルに対応している必要があります。
      4. データ位置を設定します:orgDataLoadPathをデータセットのルートに、必要に応じてorgDataSubFolderを画像のサブフォルダに、resultsSavePathを出力ルートに配置します。
      5. imageFileFormatでファイル拡張子を確認し、imageFileRegExを編集して、行、コール、フィールド、zposition、チャンネルなどすべての必要な部分にPython名付けのキャプチャグループを使わせてください。以下の構文をご利用ください:(?P\d+)で、ここでGROUPは行、コル、フィールド、zposition、またはチャネルに置き換えられます。
         注意:ファイル名が異なる場合は正言式を更新してください。すべての名前付きグループは正しく解析しなければなりません。例えば、ファイル名r01c11f01p01-ch1sk1fk1fl1.tiffは次のように変換する必要があります:r(?P\d+)c(?P\d+)f(?P\d+)p(?P\d+)-ch(?P\d+)sk1fk1fl1\.tiff.
      6. segmentation_chのセグメンテーションチャネルを物体検出に使う核チャネルに設定します(例:segmentation_ch = 'DAPI')。
      7. illumiCorrectionを設定することで照明補正を使うかどうか決めてください。Trueに設定してBaSiCモデルを計算・適用します。RAW画像を処理するためにFalseに設定してください。
         注:25ウェル≥プレートの場合、系統的バイアスを減らすために照明補正が推奨されます。
      8. 物理的なボクセルサイズ(マイクロメートル単位)を voxel_dim [z, y, x] と設定します。顕微鏡のメタデータを使って間隔を決定します(例:voxel_dim = [1.0, 0.6, 0.6])。ファイルを保存し、各パラメータを検証した後にエディタを閉じます
   4. ImAgeの読み取りや検証を行うスクリプトを実行します。スクリプトを実行する際は、ターミナルやWSLアプリを閉じないでください。
      コマンド:Pythonワークフロー/main.py
      注:スクリプト(main.py)は、セグメンテーション、特徴抽出、ImAge軸構築、予測などすべてのステップをデフォルトで含みます。スクリプトは各ステップ(例:核の分割)に対して推定完了時間を生成します。各プロセス(例:o1_illumination_correction)は、各プロセスの結果を含む.pickle形式の中間ファイルを生成します。ただし、これは標準化された処理を確保するためのプロセス間データ転送のみを目的としており、本記事でのユーザー操作を目的としたものではありません。それでも、ユーザーがこれらのファイルを操作または採用する必要がある場合は、各Python関数に含まれるデータ形状およびタイプ¹³のドキュメントを参照してください。
   5. 結果を可視化し、生のImAge読み取り値をエクスポートして外部ソフトウェアで追加解析を行います。コマンド:Pythonワークフロー/visualization.py
      注:このステップではImAgeの数値と表が作成され、ファイルはそれぞれfig_o4_ImAge_validation_VIOLINとexport_o4_ImAge_validationに配置されています(図2)。

結果

代表画像は十分に埋め込まれて単一の細胞を得る必要がありますが、個々の核同士が接触しているのは細胞核の断片の品質を損なうためであってはなりません。 図3 は、堅牢な計算解析結果を得るための代表的なイメージングを示しています。

この方法原稿で示された結果は、Alvarez-Kuglen らによる ImAge 原稿を基に^{しています。}ImAgeは、OSKMによる部分的な再プログラミングによる生 体内 での老化逆転を成功裏に検出しました(図4)。OSKM因子の誘導発現を可能にする遺伝子組み換えマウスモデルi4Fマウスの肝臓および骨格筋組織が分析されました。これらのマウスには低用量ドキシサイクリンが投与され、i4Fマウス¹⁴でOSKM発現を促す。若マウス(3.2か月)、老マウス(13.8ヶ月)、お...

ディスカッション

試料の調製
サンプル準備のために、目的のある組織を迅速に採取し、すぐに液体窒素で急凍します。乳鉢と乳棒で組織をすりつぶす際、サンプルの損失を防ぐためにモルタル用のシリコーンカバーを使用できます。組織が粉砕しにくい場合は、液体窒素をさらに加えてください。より脆弱な組織の場合、機械的な破壊や組織損傷を減らすために、サンプルは凍結ではなく新鮮に処理することもできます。核の分離プロトコルは組織タイプによって最適化が必要になる場合があります。メーカーのガイドラインを参照してください。核を分離・カウントした後、384ウェルプレートで1ウェルあたり最低20μLのメッキ容量を確保し、底を完全に覆い均一な分布を確保します。

メッキ準備
核は0.5%のBSAでPBSに懸浮させ、細胞の場合は、生存率を高めるために培地を使いましょう。サンプルは氷の上に置き、各ウェルの中央に懸濁液をピペットで固定して、端の凝固を防ぐようにしてください。遠心分離機を4°Cまで予冷...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
牛血清アルブミン	シグマ・オルドリッチ	A9647
ドンキー抗マウスIgG(H+L)高度に交差吸着した二次抗体、Alexa 488	インビトロジェン	A-21202
ドンキー抗ウサギIgG(H+L)高交差吸着二次抗体、Alexa 555	インビトロジェン	A-31572
グリシン	バイオ・ラッド	161-0718
ヒストンH3K27ac抗体(mAb)	アクティブモチーフ	39685
ヒストンH3K27me3抗体(pAb)	アクティブモチーフ	39155
ホエヒスト 33342	インビトロジェン	H3570
核分離キット:核 EZ 準備	シグマ・オルドリッチ	NUC101
オペレッタ CLS ハイコンテンクトイメージャー	リヴヴィティ	https://www.revvity.com/au-en/product/operetta-cls-system-hh16000020
パラホルマルデヒド 16%水溶液 EMグレード	電子顕微鏡科学	15710-S
PBS	サーモ・フィッシャー	AM9624
フェノプレート384ウェル・マイクロプレート	リヴヴィティ	6057302
トリトン-X	シグマ	T8787
トリパンブルー溶液、0.4%	Gibco	15250061