体性感覚ニューロンにおける神経膜プロテアソームの細胞サブタイプ特異的解析

Summary

ニューロン膜プロテアソーム (NMP) は、触覚、痛み、かゆみの知覚の重要な調節因子として、体性感覚ニューロンのサブセットで最近同定されました。この記事では、細胞ソーティング、トランスクリプトームプロファイリング、および培養ベースの免疫蛍光分析を使用して、細胞型特異的NMPの発現と機能を分析するための堅牢なワークフローを紹介します。

Abstract

感覚ニューロンのシグナル伝達は機能的なプロテアソームに依存し、それらの細胞内局在化は機能に影響を与えます。特殊なプロテアソーム複合体であるニューロン膜プロテアソーム (NMP) は、末梢体性感覚ニューロンの亜集団で最近同定されました。NMPは、体細胞の原形質膜と近位軸索と遠位軸索の両方にのみ局在します。単一細胞 RNA シーケンシング (scRNA-seq) により、通常の状態では、NMP が主に MrgprA3⁺ および Cysltr2⁺ ニューロンで発現し、機械的、かゆみ、および痛みの感覚を媒介することが明らかになりました。マウスの足の皮膚における急性の選択的NMP阻害は、熱感覚に影響を与えることなく、機械的および痛みの感受性を低下させました。特に、全体的なプロテアソーム阻害とは異なり、選択的 NMP 阻害は神経障害を引き起こしません。インビトロ研究では、NMPがシグナル伝達ペプチドの放出を通じてニューロン間のコミュニケーションを促進し、刺激に対する正常なニューロン反応に不可欠であることが示唆されています。これらの発見により、NMP が正常な触覚、痛み、かゆみの感覚に必要な感覚ニューロンのクロストークの重要な調節因子であることが特定されました。したがって、NMP は疼痛管理の潜在的なターゲットとなります。この記事では、抗体摂食と蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用して、NMP発現ニューロン集団と非NMP発現ニューロン集団の両方を単離する方法を紹介します。これらの集団は、scRNA-seqによる細胞型特異的発現プロファイリングや、NMP発現動態の培養ベースの分析に適しています。これらの方法を組み合わせることで、NMP 発現動態と痛みに関連する疾患状態への寄与を調査するための堅牢なワークフローが提供されます。

Introduction

プロテアソーム機能は、末梢神経系(PNS)^1,2,3,4,5,6の最適な発達と維持に不可欠です。プロテアソーム阻害剤を使用した in vitro および in vivo の両方の研究では、プロテアソーム活性が神経発達、髄鞘形成、興奮性、およびグリア細胞機能に重要であることが実証されています 7,8,9,10。さらに、プロテアソーム阻害剤ベースの化学療法は、患者の30〜60%に痛みを伴う神経障害を誘発し、多くの場合、慢性的な痛みと四肢の感覚の変化を特徴とします8,9,11,12,13。興味深いことに、これらの同じ阻害剤の低用量投与は、痛みを伴う刺激に対する感受性を低下させ、^{感覚処理における}プロテアソームの複雑な役割を示唆しています^6,14,15。しかし、これらの広範な研究にもかかわらず、PNS におけるプロテアソームの特定の機能は十分に理解されていません。

プロテアソームは、生命のあらゆる領域における主要なタンパク質分解機構であり、タンパク質の恒常性を維持するために不可欠です¹⁶。20Sコアプロテアソームは、α、β、β、αサブユニットの4つのヘプタマ環で構成され、ユビキチン非依存性タンパク質分解を媒介します^17,18。調節粒子との結合は、ユビキチン依存性タンパク質分解を媒介する26Sおよび30Sキャップ付きプロテアソームを形成します^4,17。ニューロンでは、プロテアソームはすべての細胞コンパートメントで同定されており、それらの細胞内局在は機能に影響を与えることが知られています¹⁹。しかし、一般的に使用されるプロテアソーム阻害剤の多くは、差次的に局在するプロテアソーム集団を選択的に標的とする特異性を欠いています。

実際、非透過性細胞における膜不透過性プロテアソーム阻害剤および抗体標識を用いて、ニューロン特異的プロテアソーム複合体が体性感覚ニューロンのサブセットにおいて原形質膜に局在することが判明した²⁰。プロテアソームサブユニットに対する抗体摂食とFACSソーティングを介してNMP⁺およびNMP^-集団に分離された初代後根神経節(DRG)ニューロンのscRNA-seq解析により、転写的に異なる20の細胞^{クラスター20}が得られました。さらなる分析により、NMP⁺ 細胞は 20 個のクラスターのうち 3 個にのみクラスター化していることが明らかになりました。特定のニューロンサブタイプの遺伝子マーカーセットを使用して、13の異なる体性感覚ニューロンサブタイプが同定されました²⁰。NMP⁺ ニューロンの大部分は、MrgprA3⁺ および Cysltr2⁺ 感覚ニューロンとクラスター化しました²⁰。最小数のNMP ⁺細胞が3番目のクラスターにクラスター化され、特定の遺伝子セットが同定されなかったため、このクラスターは割り当てられずに残されました²⁰。MrgprA3⁺ および Cysltr2⁺ ニューロンは、熱、機械的、および掻痒性刺激に敏感な C 型侵害受容器であり、それぞれ CGRP-θ および SST ニューロンのサブタイプ^21,22 に対応します。同定された20の細胞クラスターのうち、7つのNMP^{クラスター}は、シュワン細胞、サテライトグリア、免疫細胞などの非ニューロン細胞と一致する遺伝子マーカーを発現し、²⁰も割り当てられていませんでした。DRGニューロン培養中に非ニューロン細胞とニューロン細胞を分離することは不可能であるため、これらの細胞集団は予想されていました²⁰。

その機能を調査すると、NMP の in vitro 阻害は、KCl、ヒスタミン、および αβ-メチレンアデノシン 5'-三リン酸刺激に対するニューロンの興奮性を変化させました²⁰。In vivoでは、NMP阻害は、熱感覚に影響を与えずに、機械的および痛みの刺激に対する感受性を低下させました²⁰。これらの発見は、NMP が機械的、痛み、およびかゆみの感覚の重要な調節因子であり、疼痛管理の潜在的な治療標的であることを示しています²⁰。しかし、NMP 活性とさまざまな疾患状況にわたる疼痛の発症を結びつける具体的なメカニズムは、依然としてよくわかっていません。したがって、痛みおよび神経障害関連疾患における NMP 発現動態と機能に関するさらなる調査が必要です。

この記事では、NMP⁺ DRGニューロン集団を同定および単離するための堅牢なワークフロー(図1)について説明します。このアプローチにより、FACSソーティング、scRNA-seq、および免疫染色を使用して、NMP発現動態の細胞型特異的な調査が可能になります。これらのアプローチにより、細胞型特異的な方法で NMP 発現の高分解能分析が可能になり、正常およびさまざまな痛みに関連する状態における NMP の役割を調査するために使用できます。

Protocol

実験動物を使用して記述されたすべての方法は、シカゴのロヨラ大学ストリッチ医学部の施設動物管理および使用委員会 (IACUC) によって承認されました。

1. 消化液、DRG培地、FACS培地の調製

1. 137 mM NaCl、5.3 mM KCl、1 mM MgCl₂・6H₂O、25 mMソルビトール、10 mM HEPES、および3 mM CaCl₂・2H₂Oを含む完全生理食塩水(CSS)を調製します。NaOHでpHを7.2に調整し、ろ過滅菌します。
2. 190 μLのストック(H₂Oで5 mg / mL)、84 μLの50 mM EDTA、および6.5 mLのCSSを組み合わせて、組織解離酵素ブレンド作業溶液(中程度の粉砕)を調製します。使用前に新鮮なものを準備し、フィルター滅菌してください。
3. 190 μLの酵素ブレンド原液、150 μLのパパイン、84 μLの50 mM EDTA、および6.5 mLのCSSを含む組織解離酵素ブレンド(低粉砕)-パパイン溶液を調製します。使用前に新鮮なものを準備し、フィルター滅菌してください。
4. 7.5 mgのトリプシン阻害剤と7.5 mgのBSAを5 mLのDMEM / F12培地に組み合わせて、BSA / TI / DMEM溶液を調製します。新鮮なものを準備し、フィルター滅菌します。
5. 10%ウシ胎児血清(FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%グルタミン、および2%50x B27サプリメントを430 mLのDMEM / F12に組み合わせて、DRGニューロン培地を調製します。
6. 1%FBS、1x PBS、25 mM HEPES、および1%ペニシリン/ストレプトマイシンをオートクレーブ水で混合して、FACSバッファーを調製します。新鮮なものを準備し、フィルター滅菌します。
7. プロトコル開始の24時間前に、2本の5 mLポリスチレン丸底チューブにFACSバッファーを充填し、4°Cに置いてコーティングします。

2. 単一細胞DRGニューロン懸濁液の調製

1. 前述の方法^20,23に従って、4〜6匹のP20-P23マウスからすべてのDRGを採取します。
2. DRGを15 mLのコニカルチューブに移し、7 mLの組織解離酵素ブレンド(中程度の粉砕)作業溶液を加えます。37°Cで20分間穏やかに撹拌(回転)しながらインキュベートします。
3. 神経節を120 × g で2分間回転させます。ペレットを乱すことなく上清を慎重に除去し、神経節を7 mLの組織解離酵素ブレンド(低粉砕)-パパイン作業溶液に再懸濁します。37°Cで15分間穏やかに撹拌(回転)してインキュベートします。
4. 120 × g で 2 分間回転させます。上清を取り除き、神経節を500 μLのBSA / TI / DMEM溶液に再懸濁します。
5. 1 mLのプラグ付き火磨きガラスパスツールピペットで神経節を12〜16倍粉砕します。
6. 細胞を40μmの細胞ストレーナーに通すことにより、細胞の破片をろ過します。ストレーナーを1 mLのBSA / TI / DMEM溶液で洗浄し、すべてのDRGニューロンを確実に収集します。細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに移します。
7. 120 × g で 2 分間回転させます。上清を取り除き、ペレットを1 mLのDRG培地に静かに再懸濁します。
   注:これは単一細胞DRGニューロン懸濁液です。

3. NMP陽性ニューロンを標識するための抗体供給

1. DRGニューロン懸濁液を500 μLを含む2本の1.5 mLチューブに分け、2本のチューブに「一次」と「一次なし」とラベルを付けます。
2. 20 μLのヤギ抗プロテアソーム20Sサブユニットアルファ2(PSMA2)抗体を「一次」標識チューブに加えます(1:25希釈)。
   1. オプション:PSMA2抗体の膜の完全性と特異性をテストするには、ニワトリ抗ニューロフィラメント重鎖(NF-H)(1:1,000)とインキュベートした一次DRGの追加サンプルと続いて、抗ニワトリ(488結合など)二次(1:250)を含めます(ステップ3.10)。
      注:抗NF-H標識コントロールは、神経膜が無傷であれば、細胞標識を行わないはずです。
3. 細胞を37°Cで30分間穏やかに攪拌してインキュベートします。
4. 一次抗体のインキュベーション中に温めろ過され、滅菌された1x PBS。
5. チューブを200× g で2分間遠心分離し、上清の90%を除去します(廃棄)。
6. ニューロンを500 μLの温かい1x PBSに再懸濁します。チューブを37°Cで3分間穏やかに攪拌しながらインキュベートします。
7. 手順3.5〜3.6を繰り返して、合計3回の洗浄を行います。
8. 洗浄ステップの進行中に、4 μLの抗ヤギIgG(555nm蛍光色素)を1,000 μLの温かいDRG培地(1:250希釈)で希釈して二次抗体を調製します。
9. 3回目の洗浄後、「一次」チューブと「一次なし」チューブの両方を500 μLの二次抗体溶液に再懸濁します。
   注意: この時点から、チューブをアルミホイルで包んで光から保護します。
10. チューブを37°Cで40分間穏やかに攪拌しながらインキュベートします。
11. ステップ3.5〜3.6を繰り返して、合計3回洗浄して細胞を洗浄します。
12. 3回目の洗浄後、ニューロンを300 μLのFACSバッファーに再懸濁します。再懸濁した細胞を分離した5 mLのポリスチレン丸底チューブに移し、光から保護するために蓋付きのアイスバケツに入れて氷の上に置きます。
13. 前日のFACSバッファーを含む前処理済みの丸底チューブを、細胞を含むチューブと一緒にアイスバケツに入れ、FACS選別ステップに進みます。

4. FACSソーティングによるNMP陽性(NMP⁺)およびNMP陰性(NMP^-)ニューロンの分離

1. DRGニューロンの抗体供給と標識の直後に、細胞とコーティングされたチューブをFACS選別機に運びます。
2. 7-アミノアクチノマイシンD(7-AAD)(1:1,000)を「一次」チューブと「一次なし」チューブの両方に追加します。氷上で10〜30分間インキュベートします。
   注:7-AADは、選別プロセスから死んだ細胞を除外するために使用されます。
3. 一晩コーティングしたチューブからFACSバッファーを取り出し、1 mLの新鮮なFACSバッファーと交換します。これらのチューブは、選別されたニューロンの収集チューブとして機能します。
4. 「プライマリなし」のラベル付きチューブを使用して、ラベルなしニューロンのパラメータとゲーティングを設定します。
5. 前方散乱(FSC)ゲーティングを適用して、感覚ニューロンのサイズと一致する細胞を分離します。感覚ニューロンの直径は10〜50μmの範囲です。
6. 側方散乱(SSC)ゲーティングを適用して、死んだ細胞や破片を除外し(下側散乱)、DRGニューロンの粒度と一致するイベントを分離します(より大きな側方散乱)。
7. 「一次」チューブをロードし、「一次なし」サンプルで確立されたゲーティングパラメータを設定して、非標識(NMP^-)および555陽性(NMP⁺)ニューロン集団を検出します。
8. 100 μmのノズルと15〜20 psiの選別圧力を使用して、ニューロンを555⁺と555-に選別^します。
9. 選別されたニューロンの下流解析に進みます。

5. NMP⁺およびNMP^-ニューロンの単一細胞RNAシーケンシング

1. 選別された細胞を1.5mLチューブに移し、氷の上に置きます。細胞を単一細胞シーケンシングコアに輸送します。
2. NMP⁺およびNMP^でソートされたニューロンに対して、細胞あたり30,000〜100,000リードの深さでシングルセルRNAシーケンシングを実行します。
3. 無料で入手できるさまざまなソフトウェアプログラムを使用してscRNA-seqデータを解析し、特定の遺伝子発現プロファイルに従って細胞クラスターを生成します。以前に使用された分析ステップとプログラムの詳細については、Villalón Landeros et ^al.20を参照してください。
4. https://painseq.shinyapps.io/harmonized_painseq_v2/ や https://kleintools.hms.harvard.edu/tools/springViewer_1_6_dev.html?datasets/Sharma2019/all などの利用可能なデータベースを使用して個々のニューロン集団を識別するための特定の遺伝子マーカーのリストを構築します
5. 特定の遺伝子マーカーのリストを使用して、結果として得られる細胞クラスターを同定します。
   注:以前に実施されたscRNA-seq解析は、独立したコンサルティング会社(www.cmcherryconsulting.com)によって実施されました。

6. 濃縮NMP⁺およびNMP^-ニューロンの初代培養

1. 実験の前日に、12 mmの丸いカバーガラスを24ウェル培養プレート(1カバーガラス/ウェル)に入れ、70%エタノールで15分間洗浄します。次に、滅菌水で3回すすぎ、滅菌組織培養フードで自然乾燥させます。
2. カバーガラスが乾いたら、0.1 mg/mLのポリ-L-臭化水素酸リジン(PLL)でコーティングし、4°Cで一晩置きます。
3. 実験当日、PLLを取り外し、カバーガラスを滅菌水で3回すすぎ、組織培養フードで乾燥させます。
   メモ:PLLは保存して再利用できます。
4. 10 μLの1 mg / mLラミニンを125 μLのDRG培地で希釈し、各カバーガラスの中央に20〜30 μLをスポットします。
5. 使用前に、カバーガラスをラミニンで少なくとも40分間コーティングします。
6. FACSで選別した細胞を1.5mLチューブに移し、200 × g で5分間遠心分離して細胞を収集します。上清を除去し、ニューロンを50 μLの温かいDRG培地に再懸濁します。
7. カバーガラスからラミニンを吸引し、カバーガラスを乾燥させます。
8. 各カバーガラスに15〜20 μLの再懸濁ニューロンを播種します。シードカバーガラスを含むプレートを組織培養インキュベーターに慎重に移動し、少なくとも30分(1時間以内)インキュベートして細胞が接着できるようにします。
9. プレートを組織培養フードに戻し、カバーガラス上の細胞を含む各ウェルに1 mLの滅菌温温DRG培地を加えます。
   注:ピペットチップをウェルの下隅まで下げ、カバーガラスに触れて細胞を破壊しないようにゆっくりと分注します。培地の追加速度が速すぎると、乱流が発生し、細胞が外れる可能性があります。
10. 培養物を37°C、湿度5%CO₂/95%で維持し、75%培地を2〜3日ごとに交換します。

7. 細胞型特異的NMP発現解析

1. 140 mmの培養プレートまたは免疫蛍光染色トレイに大きなパラフィルムを敷いて準備します。
2. 滅菌5/45鉗子を使用して、カバーガラスを組織培養皿から染色トレイ上のパラフィルムに移し、DRGニューロンを含む側が上を向くようにします。
3. パラフィルム上の各カバーガラスに100 μLのDRG培地を加えて、細胞が乾燥するのを防ぎます。
   注:カバーガラスの端のすぐ上でゆっくりとピペッティングして液体を追加します。
4. ヤギの抗PSMA2一次抗体を温かいDRG培地で1:20希釈で希釈します。
5. P10フィルターなしチップを取り付けた吸引器を使用して、端から吸引してカバーガラスから培地をゆっくりと取り除きます。100 μLのヤギ抗PSMA2抗体溶液をカバーガラスに加え、室温で40分間インキュベートします。
6. 一次抗体溶液をカバーガラスから慎重に吸引します。100 μLのPBS(室温)を加え、室温で3分間インキュベートして洗浄します。
7. カバーガラスからPBSを吸引し、PBSの添加と吸引を合計3回洗浄します。
8. 抗ヤギ(555-結合など)二次抗体を温かいDRG培地で1:250希釈で調製します。
9. 3回目の洗浄後、100 μLの希釈した二次抗体をカバーガラスに加え、室温で40分間インキュベートします。
   注:このステップから、細胞を光から保護します。
10. 二次抗体溶液をカバーガラスから吸引し、ステップ7.6〜7.7で説明するように3回洗浄します。
11. 最後のPBS洗浄を取り除き、4%パラホルムアルデヒド(PFA)、4%スクロースを含む100 μLの固定液を1x PBSに加えて細胞を固定します。室温で10分間インキュベートします。
12. 固定剤を吸引し、手順7.6〜7.7を繰り返して3回洗浄します。
13. 100 μLの0.1%非イオン性界面活性剤(Triton X-100など)を1x PBSに添加して細胞を透過処理し、室温で5分間インキュベートします。
14. 透過処理溶液を吸引し、手順7.6〜7.7を繰り返して3回洗浄します。
15. 5%FBS、5%ロバ血清からなるブロッキング溶液100 μLを1x PBSに加え、室温で40分間インキュベートします。
16. ブロッキング溶液中の次の希釈液に従ってDRGニューロン細胞型特異的一次抗体混合物を調製します:ウサギ抗カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)(1:500);イソレクチンB4、ビオチン複合体(IB4)(1:50);鶏肉抗NF-H(1:1000)。
    注:これらの抗体は互いに干渉せず、同じ溶液に一緒に添加できます。
17. ブロッキング溶液を除去し、一次抗体混合物をカバーガラスに加えます。室温で45分間インキュベートします。
18. 抗体溶液を取り出し、手順7.6〜7.7を繰り返して3回洗浄します。
19. ストレプトアビジン(例:647-結合)、ロバ抗ウサギ(例:488-結合)、およびロバ抗ニワトリ(例:405-結合)をそれぞれ1:500に希釈して、二次抗体混合溶液を調製します。
20. 最後のPBS洗浄液を取り除き、100 μLの二次抗体溶液をカバーガラスに加えます。室温で45分間インキュベートします。
21. 手順7.6〜7.7を繰り返して3回洗います。
22. オプション:核染色を1〜10 μg/mLで調製します。100 μLの核染色液を加え、室温で30秒間インキュベートし、ステップ7.6〜7.7を繰り返して脱イオン水(diH₂O)で2回洗浄します。
23. カバーガラスから最後の洗浄液を吸引し、先端の細い鉗子を使用して、パラフィルムからカバーガラスを持ち上げます。カバーガラスの端を糸くずの出ないティッシュにそっと触れて、余分な液体を吸い取ります。
24. 7 μLの封入剤液滴を顕微鏡スライドに置きます。カバーガラスを封入培地液滴の上にそっと置き、細胞が下を向いて培地と接触していることを確認します。
25. カバーガラス付きの顕微鏡スライドを暗く乾燥した引き出しまたは箱に少なくとも1時間置き、カバーガラスの端を乾燥させて密封します。速乾性マニキュアでカバーガラスの端をシールし、10〜15分待ってからイメージングします。
26. 適切な光フィルターを備えた蛍光顕微鏡またはスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用してスライドを画像化し、青、緑、赤、および遠赤色蛍光を視覚化します。

Results

NMP と細胞内プロテアソームを区別する能力は、膜不透過性標識アプローチに依存しています。抗体摂食により、生きたニューロンにプロテアソームサブユニット特異的抗体を使用して、細胞の外部からのみアクセスできるプロテアソームを標識することができます。抗体は、そのサイズと親水性のために、無傷の細胞膜を通過することができません²⁴。生きたニューロンは膜の完全性を維持し、抗体が細胞に侵入するのを防ぎます。このアプローチを使用すると、NMPを確実に標識し、それを発現するニューロン(NMP⁺)と発現しないニューロン(NMP^-)を区別することができます(図2A)。二次抗体標識のみを受けた対照細胞は、NMP標識を示しません(図2B)。さらに、この方法は、DRGニューロンの亜集団のみがNMPを発現することを示しています。さらなる研究のためにDRGニューロンをNMP ⁺

Discussion

プロテアソームはすべての細胞に不可欠であり、細胞全体のすべてのコンパートメントに見出すことができます¹⁹。中枢^25、26、27および末梢²⁰ 神経系のニューロンにおける特殊なプロテアソーム複合体である NMP の最近の発見により、プロテアソームの機能に関する現在の理解が変わりました。以前の研究では、NMPが感覚ニューロン間のクロストークを媒介して、機械的、痛み、およびかゆみの感覚に対する感受性を調節するシグナル伝達プロテアソームとして機能することが示されています²⁰。NMPは細胞質20Sプロテアソームと構造的に同一であるようであり、その機能的独自性はその膜局在から生じることを示唆しています²⁰。N...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M HEPES緩衝液、pH 7.3	品質生物学	118-089-721	FACSバッファ
10 倍の PBS	サーモフィッシャーサイエンティフィック	70011-044	FACSバッファ
16% パラホルムアルデヒド (PFA) 原液;EMグレード	EMS対応	15710	固定液
1x リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	フィッシャーサイエンティフィック	10-010-023	FACS洗浄
5 mLポリスチレン丸底チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	14-959-6	FACSチューブ
7-アミノアクチノマイシンD (7-AAD)	インビトロゲン	A1310	死んだ細胞にラベルを付けます
B27サプリメント	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17504044	培地
ウシ血清アルブミン	ミリポアシグマ	A9647;CAS:9048-46-8	BSA/TI/DMEM
塩化カルシウム二水和物(CaCl?-2H?O)	ミリポアシグマ	C7902	完全な生理食塩水溶液
ニワトリ抗ニューロフィラメント重鎖(NF-H)	ミリポアシグマ	AB5539	抗体
DMEM/F12 1:1	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11320033	培地;BSA/TI/DMEM
ロバ抗ヤギ IgG (H+L) Alexa Fluor Plus 555	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A32816	抗体
ロバ抗ウサギ IgG (H+L) Alexa Fluor Plus 488	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A32790	抗体
ダイライト405ロバアンチチキン	ジャクソン・イムノリサーチ	703-475-155	抗体
EDTAの	ミリポアシグマ	E5134;CAS:6381-92-6	Liberase TM/Liberase TL-パパイン作業ソリューション
ウシ胎児血清 (FBS)	ミリポアシグマ	A9647	培地/FACS緩衝液/ブロッキング溶液
ガラスパスツールピペット、9インチ	フィッシャーサイエンティフィック	1367820D	滴定
ヤギ用抗PSMA2	自社製	NA	抗体
HEPESパウダー	ミリポアシグマ	H4034	完全な生理食塩水溶液
ヘクスト	サーモフィッシャーサイエンティフィック	H21492	核染色
馬の血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	26050070	ブロッキングソリューション
IB4、ビオチン複合体	ミリポアシグマ	L2140	抗体
ラミニン	シグマ・アルドリッチ	L2020-1MG	文化皿
L-グルタミン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25030081	培地
リベラーゼ粉砕低(TL)	ミリポアシグマ	54010200001	Liberase TLストック溶液
リベラーゼ粉砕中程度(TM)	ミリポアシグマ	5401119001	リベラーゼTMストック溶液
塩化マグネシウム六水和物(MgCl?-6H?O)	ミリポアシグマ	M2393	完全な生理食塩水溶液
取付媒体	サザンバイオテック	0100-01	フルオロマウント-G
パパイン	ワージントン	カタログ#: 9001-73-4	リベラーゼTL-パパイン作業溶液
ペニシリン/ストレプトマイシン	ミリポアシグマ	15140122	培地/FACSバッファー
ポリ-L-臭化水素酸塩(PLL)	ミリポアシグマ	P4707	文化皿
塩化カリウム(KCl)	ミリポアシグマ	P5405	完全な生理食塩水溶液
ウサギ抗CGRP	イムノスター	24112	抗体
塩化ナトリウム(NaCl)	ミリポアシグマ	S9888;CAS:7647-14-5	完全な生理食塩水溶液
ソルビトール	ミリポアシグマ	56755-M	完全な生理食塩水溶液
ストレプトアビジンAlexa Fluor 647複合体	サーモフィッシャーサイエンティフィック	S21374	抗体
蔗糖	シグマ・アルドリッチ	S0389-500G	固定液
トリプシン阻害剤	ミリポアシグマ	T9253;CAS:9035-91-8	BSA/TI/DMEM