このプロトコルは、IAVの鼻腔内投与およびマウス肺損傷および関連する肺細胞型への転写変化の下流分析の指示を提供します。
この記事について
サマリー
要約
ウイルス感染は、心血管系と外部環境の間のガス交換を担う特殊な組織構造である肺胞に急性および長期の両方の損傷を引き起こします。マウスにおけるインフルエンザAウイルス(IAV)感染は、ウイルス感染に対するヒト肺の応答の翻訳モデルであり、肺胞に一過性および持続的な細胞状態変化の両方を誘発します。場合によっては、ウイルス損傷によって誘発され、時間が経っても解決されない異常な細胞状態は、肺の重要なガス交換機能を永久に損なう可能性があります。この記事では、A / PR / 8 / 34 IAVによるマウスの鼻腔内感染の方法と、損傷した肺の細胞組成と組織構造に対する一過性および長期にわたる変化の特徴付けを示します。このモデルにより、肺の修復と慢性機能障害の根底にある分子および細胞メカニズムの詳細な調査が可能になります。このアプローチは、効果的な肺再生を促進し、ウイルス損傷後の呼吸機能を回復することを目的とした治療介入を評価するためのプラットフォームも提供します。
概要
肺は、局所組織に酸素と栄養素を供給する上で重要な役割を果たします。肺の小さな毛細血管に存在する内皮細胞 (EC) は、肺組織の適切な機能、血管の完全性の維持、効率的なガス交換に不可欠です1。ECは血管ニッチを形成し、上皮細胞、免疫細胞、間葉系細胞などの他の細胞と相互にクロストークします。これは、肺の発達と損傷や病気に反応した組織修復の調節に寄与します2。
H1N1 インフルエンザ A ウイルス感染は世界的な問題です3.H1N1 感染患者は、滲出性びまん性肺胞損傷 (DAD) と診断されることがよくあります4。H1N1 に感染すると、肺炎、重症急性肺損傷 (ALI)、急性呼吸窮迫症候群 (ARDS) などの重篤な肺損傷や重篤な結果を引き起こす可能性があります5。損傷は主にウイルスが肺上皮細胞に感染することによって引き起こされ、過剰な免疫反応を引き起こし、炎症、組織損傷、肺内の体液の蓄積を引き起こします。したがって、ガス交換に関与する気道と肺胞の内側を覆う上皮細胞は、H1N1ウイルスによって直接損傷を受け、肺の正常な構造の破壊につながります6,7。他の細胞型は、IAVに直接感染していないが、感染に反応して損傷を受ける可能性があることが明らかになりました8,9。したがって、インフルエンザ感染後の組織損傷は、肺のすべての細胞コンパートメントに影響を及ぼし、IAV感染は、複数の細胞コンパートメントの細胞状態に一時的および持続的な変化の両方を引き起こすことが最近示されています9。疾患に反応するこの細胞可塑性は、組織修復の成功に役立つ場合もあれば有害である場合もあり、さらなる研究が必要です。
インフルエンザとその病因を研究するために最も採用されている実験モデルは、インフルエンザウイルスA/PR/8/3410によるマウスの鼻腔内感染です。これは、疾患の重症度、死亡率、およびウイルス感染性の研究を可能にする重要な技術です。マウスの鼻腔内感染は、ヒトの自然な感染経路を模倣しており、ウイルスに対する適応免疫応答と自然免疫応答の両方の研究を可能にします。1934年、インフルエンザAウイルス「A/PR/8/34」の特定の株がプエルトリコの患者から分離されました11。このインフルエンザウイルス株は現在、マウスに適応しており、もはや人間に生産的に感染していません。マウスとヒトの免疫系の類似性により、マウスはIAV研究で最も人気のある動物モデルです12。この方法では、A/PR/8/34 H1N1株を鼻孔からマウスに直接投与し、自然感染を模倣する13。これは、野生型 (WT) およびノックアウト (KO) 状態で宿主肺組織に対するウイルス感染の影響を研究するための簡単で費用対効果が高く、便利な方法です。代替技術には、鼻腔内モデルと比較して長所と短所があります。気管内 (IT) 接種により、ウイルスを肺に正確に送達できますが、この技術は吸入による感染を完全に模倣しておらず、上気道の毒性に関する情報を提供しません。IT 接種には、気管損傷のリスクを軽減するための優れたスキルも必要です13,14。エアロゾル吸入 (AR) 接種は、自然な感染経路を模倣し、鼻腔内感染と比較してより均一な肺の病状を作成しますが、エアロゾル中のウイルス濃度を均一に維持し、ウイルス エアロゾルを正確に送達することは困難な場合があります。安全性もAR接種法10の重要な関心事です。したがって、IAV 投与の鼻腔内接種技術は、組織の損傷と修復におけるウイルス感染の下流の影響に関する肺に焦点を当てた研究への重要なアプローチです。化学的モデルや機械的モデルとは異なり、インフルエンザ誘発性肺損傷と宿主と病原体の相互作用を研究するための、より現実的で侵襲性の低い方法を提供します。
ここでは、インフルエンザAウイルスによるマウスの鼻腔内感染(A / PR / 8/34)と、ウイルス損傷に起因する肺胞の短期および長期の両方の細胞および構造変化を特徴付けるための再現性のある方法を確立します。この方法を使用した研究は、肺疾患の新しい治療標的を特定するための肺組織の損傷と修復のメカニズムの発見に役立ちます。
プロトコル
動物モデルでのインフルエンザAウイルスの操作は、バイオセーフティレベル2(BSL2)および動物バイオセーフティレベル2(ABSL2)と見なされます。このデータの生成に使用されたすべての動物手順は、国立衛生研究所、国立がん研究所がん研究センターの動物ケアおよび使用委員会によって承認されました(プロトコル#24-452)。このプロトコルは、国立衛生研究所国立がん研究所がん研究センターの施設バイオセーフティ委員会によっても承認されています。このプロトコルを開始する前に、ユーザーは施設の動物管理および使用委員会および施設のバイオセーフティ委員会の承認を求めることをお勧めします。
1. 作業ストックの準備
注:インフルエンザウイルスに関するすべての作業は、バイオセーフティキャビネット内の氷上で行う必要があります。チップやウイルスに接触するその他のものは、10%漂白剤の入った容器に入れます。アイスバケツ、ピペット、チップボックスには、浸漬するのではなく、10% の漂白剤溶液をスプレーする必要があります。室温で少なくとも30分間インキュベートします。固形廃棄物はバイオハザード廃棄物容器に捨て、液体廃棄物はシンクに捨て、水で洗い流します。
- バイオセーフティキャビネット内の氷上のウイルスの冷凍ストック(0.5 mL)を解凍します。
- 水道水に漂白剤10%を入れた廃棄物容器を設置します。最大100本のサンプルチューブを収納できるプラスチック製または段ボール製のフリーザーボックスを-80°Cの冷凍庫に2つ置いて予冷します。
- ウイルスのアリコート用に160本の1.5 mLチューブを事前に標識します。スクリュートップチューブは、ウイルスストックチューブを開封して使用するときにエアロゾルの発生を避けるために、フリップキャップチューブよりも好ましいです。ウイルスのアリコートを作る前に、チューブを氷の上に置いて予冷させます。
- 校正済みのP20ピペットとチップを使用して、ウイルスを予冷チューブにのみ入れ、アリコートを常に氷上に置いておくと、ウイルスのアリコートを3 μLのアリコートで作ります。
- アリコートを作った後、「A/PR/8/34 インフルエンザウイルス(IAV)」とカタログ番号、ロット番号、賞味期限が記載された予冷冷凍ボックスに保管します。
注:ウイルスのロットが異なれば感染力も異なるため、混合しないでください。 - 箱を-80°Cの冷凍庫に入れます。凍結/解凍サイクルごとにウイルス力価が低下するため、すべてをできるだけ冷たく保つようにしてください。
2. 鼻腔内感染実験に使用するウイルスのアリコートの希釈
- バイオセーフティキャビネット内の氷上で3 μLのウイルスストックを1個解凍します。
- 3 μLアリコートの2 μLを、198 μLの冷たいD-PBSを含む予冷した1.5 mLチューブに移すことにより、1:100の希釈(希釈A)を作ります。
- 使用したマウスの系統バックグラウンドで0.5〜1 LD50 の適切な濃度に達するまで、ウイルスストックを希釈し続けます。ウイルスが過度に温められないように、すべてを氷の上に置き、事前に冷やしたチューブを使用してください。
注:例えば、VR-95PQ、ロット70063082の場合、1:500,000希釈で12,600〜31,500 CEID50/μLウイルス(体重でスケーリング)をマウスに感染させます。 - 希釈A(1:100)から、予冷した15 mLチューブで4990 μLの低温D-PBSに10 μLの希釈Aを加えて、1:50,000の希釈液(希釈B)を作ります。5 mLの血清学的ピペットを使用して上下にピペッティングしてよく混合します。
- 希釈Bから、予冷した5 mLチューブで1.8 mLのD-PBSに200 μLの希釈Bを加えて、1:500,000の希釈(希釈C)を作ります。上下にピペッティングしてよく混ぜます。
注:新しいロットを購入するときに動物の感染に使用するウイルスの理想的な希釈を決定するために、製品シートに示されているウイルスの力価を使用して推定し、前のロットの力価に基づいて希釈を調整することができます。理想的な希釈を決定する最良の方法は、野生型C57BL / 6マウスを使用して新しいロットのウイルスを経験的に力価することです。1:50,000から1:500,000に及ぶ希釈範囲を計画し、希釈ごとにC57BL / 6メスマウスのケージを1〜2個注文してテストします。マウスをさまざまな濃度で感染させ、体重減少を監視します。ウイルス力価をテストするために、この研究では、マウス間の性別や体重の違いによって引き起こされる可能性のある変動を減らすために、雌マウスのみを使用することを提案しています。雌マウスは、おそらくサイズが小さいため、または他の形態のマウス肺損傷で発生するように、インフルエンザ感染に対する反応の性特異的な違いが原因で、雄マウスよりも病気になることがよくあります15。これは詳細に研究されていませんが、力価実験では雌マウスを使用しましたが、雄マウスを使用して力価を測定すると、雌マウスは決定された用量で死亡する可能性があるためです。しかし、雄マウスは、雌マウスのみを使用して測定されたウイルス力価に感染すると、かなり病気になり、顕著な肺損傷を負うことがわかりました。混合バックグラウンドマウスまたは近交系マウスを使用する場合の理想的な希釈は、「1 LD50」、つまり野生型C57BL / 6マウスの50%が死亡する希釈液です。近親交配マウスは感染に対してより耐性があり16 、この希釈で負傷し、よく回復します。実験用のマウスが近交系C57BL / 6バックグラウンド上にある場合、理想的な用量はこの「0.5 LD50」の半分になります。これらの実験の目的は損傷と修復を研究することであるため、マウスが病気になり、体重の20〜25%が減少するが、ほとんどのマウスが最終的に回復する用量を定義することが理想的です(図1)。研究のすべてのマウスがほぼ同じ体重(~25 g)である場合、インフルエンザウイルスを適切な希釈液50 μLで各マウスに投与することが可能です。ただし、マウスの体重は15〜35 gの範囲です。したがって、体重1グラムあたり2 μLのウイルス希釈液を投与します(たとえば、15 gのマウスは30 μLのインフルエンザを受け取り、35 gのマウスは70 μLのインフルエンザを受け取ります)。これにより、さまざまなサイズの動物間で、より一貫したレベルの感染と組織損傷が生じます。この情報は、希釈量 C を計画するために必要です。
3. 動物施設へのウイルスアリコートの輸送
- 最終的なウイルス希釈液を入れた5 mLチューブを氷に入れ、容器にバイオハザードステッカーを貼ります。プラスチック製のサンプルキャリアボックスにペーパータオルを敷いて、こぼれの可能性を吸収します。
- 鼻腔内感染に必要な材料をバイオハザードラベルの箱の中に入れます:P200ピペット、ろ過されたP200ピペットチップの未開封の箱、ペン、およびウイルス廃棄物用の新鮮な10%漂白剤で満たされた50 mLの円錐形チューブ。感染制御として、IAVを希釈するために使用したのと同じ冷たいD-PBSを1.5 mLチューブに充填します。
4. マウスへのIAVの投与
注:動物施設でインフルエンザウイルスを扱うには、ABSL2安全レベルの施設が必要です。標準的なPPEには、スクラブ、使い捨て白衣、ヘアボンネット2個、二重ニトリル手袋、二重靴カバー、保護メガネ(安全メガネ)、マスクが含まれます。希釈したインフルエンザウイルスは、感染力の喪失を避けるために、投与プロトコル全体を通して氷上に保管する必要があります。
- ウイルスに関するすべての作業は、バイオセーフティキャビネット内で行う必要があります。A/PR/8/34インフルエンザウイルスはマウスに適応した株ですが、インフルエンザウイルスは変異を起こしやすいため、ウイルスをあたかもヒトに感染する可能性があるかのように扱います。
- イソフルラン麻酔を気化器で2.5〜3%の流量で一度に1匹ずつ動物に投与します。インフルエンザを投与する前に、動物を麻酔ボックスからノーズコーンに移動します。
- マウスが麻酔下にあるときは、呼吸をチェックし、つま先をつまんで反応するかどうかを確認します。マウスは、つま先のつまみに小さなけいれんや「ジャンプ」で反応すると、IAV感染の準備ができていますが、頭を動かすのに十分なほど起きている場合はそうではありません。
- 50 μL(または2 μL / g体重、ステップ2.5の下の注を参照)に設定されたP200ピペットを使用して、氷上のバイアルから希釈したIAV(またはPBSコントロール)を吸引し、チップが手袋やバイオセーフティキャビネットの表面に接触しないチップボックスまたはペーパータオルの上にピペットを置きます。
- 麻酔をかけたマウスを首筋で持ち上げ、マウスを45°の角度で直立させて持ちます。吸入が良くなるように気管が伸びるのに十分なほどマウスをしっかりと首筋にしますが、呼吸が妨げられるほどきつく締めないでください。マウスの呼吸が浅いが、あえぎ声を出さずに一服していることを確認してください。
- IAV希釈液をマウスの鼻孔にゆっくりとピペットで入れます。これは、手順 4.6.1 と 4.6.2 で説明されている 2 つの方法のいずれかを使用して正常に実行できます。
- ウイルスが鼻の両側に入るように、ウイルスの希釈液を鼻孔を交互に鼻孔に滴下します。
- 両方の鼻孔にまたがるウイルスの「泡」を作成し、マウスが液体を吸い込むときに一貫してゆっくりとピペッティングすることによって維持されます。
注: この研究では、より制御され再現性のある気泡点眼法を一貫して使用しました。この方法により、麻酔下でウイルス懸濁液を鼻孔に容易に送達でき、自然な呼吸が促進されます。ドロップワイズ法も同様に有効ですが、どちらの方法を使用する場合でも、結果のばらつきを少なくするために、実験間で方法の一貫性を適用する必要があります。
- ピペットチップを鼻に近づけますが、鼻に触れないでください。マウスが目覚めている場合は、用量の半分を投与し、用量の後半を投与する前にマウスをイソフルラン鼻円錐に戻します。
- マウスが頭を振ったり、咳をしたり、ウイルスを吐き出したりできるほど起きている場合は、エアロゾル化ウイルスの発生を避け、良好な感染を確実にするために、より多くの麻酔が必要です。マウスが目覚めていない場合は、全用量を投与します。マウスをノーズコーンに戻した場合は、ステップ4.6を繰り返して残りのIAVを投与します。
- チップを新鮮な10%漂白剤の入った廃棄物容器に排出します。マウスのケージごとに新しいチップを使用してください。
- 各IAV投与後、マウスを1〜2分間直立させて気道を開いたままにし、インフルエンザが肺に適切に送達されていることを確認します。インフルエンザウイルスがマウスの肺への送達に成功した場合、マウスの胸の両側に1本の指を置くとパチパチ音を感じることができます。
- マウスが回復し始めたら、マウスをケージに戻して完全に回復させます。マウスはイソフルランからすぐに回復しますが、歩行可能になるまで監視する必要があります。
- IAVが十分に吸入されたことを示す胸のパチパチ音や深呼吸、またはIAVの一部がマウスの鼻孔から排出されたことを示す泡や鼻スプレーなどのイベントを記録します。この情報は、傷害ログスプレッドシート(補足ファイル1)とラボノートブックで追跡します。
- 感染するマウスごとに手順4.2〜4.12を繰り返します。
5. 研究室への送迎
- 漂白剤を含む50 mLの円錐形とチップを、残りのIAV希釈液(ある場合)とインフルエンザ感染に使用した実験用品とともに、プラスチック製のサンプルキャリアボックスに戻します。
- 研究室に戻ったら、ウイルスと接触したものを10%漂白剤でインキュベートします。氷バケツ、ピペット、チップボックスに浸すのではなく、10%の漂白剤溶液をスプレーします。室温で少なくとも30分間インキュベートします。固形廃棄物はバイオハザード廃棄物容器に捨て、液体廃棄物はシンクに捨て、水で洗い流します。
6. マウスのモニタリングと追加の実験手順
- インフルエンザ感染後、感染の翌日(1日目)または感染の3日後(4日目)から、すべての対照(PBS)およびIAV感染マウスの体調スコア(BCS)17 および体重を毎日監視します。IAVに感染したマウスは、感染後4日目まで大幅な体重が減少する可能性は低い(図1)。
注:体重の30%以上を失ったマウス、または体調スコア1に達したマウスは安楽死させる必要があります。 - 必要に応じて、腹腔内(ip)注射または飲料水中でマウスにEdUを投与して、インフルエンザ感染後の細胞増殖を監視します。
注:マウス肺の多くの細胞型は、IAV誘発性損傷後に増殖します9。特定の実験目的のために、他の薬剤、特殊食品、特殊水などを必要に応じて投与することが可能です。マウスはインフルエンザからの回復中は通常ほど食べたり飲んだりしないため、注射ベースの投与方法がより望ましい場合があることに留意してください。一方、BCSが2〜2.5のマウスに注射することは難しい場合があります。
7. 下流アプローチのための肺組織の採取
- 免疫蛍光分析、フローサイトメトリー、シングルセルRNAシーケンシングなど、マウス施設またはバイオセーフティキャビネット内の実験室でのダウンストリームアプリケーション用に肺組織を採取します。
- CO2を使用してマウスを一度に1匹ずつ安楽死させます。気管の脱臼を避けるために、頸部脱臼しないでください。両側開胸術は通常、承認された二次安楽死方法です。
注: この研究は、施設が承認した動物管理ガイドラインと CO2 安楽死プロトコルに従っており、肺損傷や組織病理学的転帰に重大なばらつきをもたらすことなく、以前のインフルエンザ研究でこの方法を一貫して使用してきました。ケタミン/キシラジンは、CO2 吸入による損傷を避けるためにマウスを安楽死させるためにも使用できます。ただし、ケタミン/キシラジンの取得に費用がかかりすぎる場合、または DEA ライセンスの取得が難しすぎる場合は、CO2 吸入が許容される方法です。 - 胸腔を解剖し、胸郭と気管を露出させます。
- 横隔膜を切り開き、肺に穴を開けないように胸郭から慎重に解剖します。胸郭の側面に沿って切り、上部の胸郭を取り除きます。鎖骨を切断し、骨と軟部組織を気管の前部から切り離します。
- 軟骨リングが見えるまで気管の周囲の筋肉と組織を解剖しますが、気管に穴を開けないでください。湾曲した鉗子を使用して、食道を気管の後ろから押し出し、気管から切り離します。
- 気管の後ろに縫合糸を通し、緩んだ縫合糸の結び目を作ります(一方の鉗子の端をもう一方の鉗子に二重ループし、縫合糸の緩い端をつかみ、緩い端をループを通して引っ張ります)。
- 循環器系にD-PBSを灌流します。大きな血管(前肢の下または横隔膜の下部)をクリップし、注射器の端をゆっくりと押して、右心室(心臓の底、上を向く)にD-PBSを灌流します。針が心臓壁を通して見えない場合は、左心室にある可能性があります。これにより、肺から血液が除去されます。
注意: 気泡を押さないでください。ラインに気泡がある場合は、シリンジでD-PBSを押す前に気泡を排出してください。内皮細胞死が懸念される場合は、PBSを手で押すよりも重力灌流を使用する方が穏やかです。 - 組織学または免疫蛍光のみのために組織を収集する場合は、ステップ7.9に進みます。単一細胞懸濁液のみで収集する場合は、すべての肺葉を切り取り、氷上のPBSに入れてから、ステップ7.11に進みます。
- 下流の免疫蛍光または組織学のための肺膨張:
- 肺を2%パラホルムアルデヒド(PFA)で膨らませ、パラフィン包埋のためにエタノールで脱水するか、2%PFAで膨らませて凍結切片のためにスクロースで脱水します。
- RNAscopeやハイブリダイゼーション連鎖反応(HCR)などのRNA検出技術では、肺を4%PFAで固定します。最良の固定のために、2%超低融点アガロースで肺を膨らませ、すぐに振動ミクロトームを組織培養プレートで2%または4%PFAに切片し、下流の免疫蛍光を行います。
- 手による肺の膨張:
- チューブの有無にかかわらず、またはベンチ表面から30 cm上のリングスタンドにPFAのチューブを取り付けて、注射器と21〜23 Gの針で手で肺を膨らませます。
- 気管を隔離した後、気管の上部に針を挿入し、気管の下部に穴を開けずに面取りし、気管と針の周りの縫合糸を締めてから液体を挿入します。
注: 鋭利な針を使用すると、先端が鈍い針に比べて気管穿刺のリスクがわずかにあるため、研究者は損傷を避けるために処置中に細心の注意を払う必要があります。鋭利な針が気管に穴を開けている場合は、先端が鈍い針を使用する必要があります。
- ダウンストリームフローサイトメトリーまたはシングルセルシーケンシング分析用のシングルセル懸濁液を作成するには、D-PBSから肺組織を除去し、はさみで肺組織をみじん切りにし、カミソリの刃で2〜3分間切り刻んで、さらに細かい組織片を実現します。
- 480 U/mLコラゲナーゼI、100 μL/mLディスパーゼ、および2 μL/mL DNaseをD-PBS中の消化バッファー中で、37°Cで30〜35分間解離します。100 μmおよび40 μmフィルターでろ過し、塩化アンモニウム-塩化カリウム(ACK)溶解バッファーを使用して残りの赤血球を溶解し、下流の処理と分析のためにPBS中の1%BSAに再懸濁します。
注:肺でのウイルス感染と感染後のクリアランスを検出するために、肺ホモジネートのqRT-PCRまたはTCID50アッセイを使用してウイルス量を評価し、ウイルス複製を測定することができます。ノイラミニダーゼとカプシド染色は、ウイルス感染の検出にも使用できます。ウイルスクリアランスは感染後8〜9日目までに発生するはずです18,19、肺組織の修復と再生は数週間続きます9。
結果
感染していないPBS処理マウスと比較して、IAV感染マウスは不均一な組織損傷を示します(図1A)。組織損傷は、MATLAB20 の k 平均値クラスタリング アルゴリズムを使用して定量化できます (図 1B)。IAVに感染したマウスは、感染後3〜4日で体重が減り始めます。理想的な力価では、マウスは初期体重の20〜30%を失い、最大の体重減少は感染後8〜10日(dpi)で発生します(図1C)。11〜12 dpiまでに、マウスは体重が増加し始め、14 dpiで初期体重の10〜15%以内に戻るはずです。再生の研究では、実験のほとんどのマウスが体重が減り、組織の損傷を経験するが、死なない場合に役立ちます。しかし、組織損傷の不均一性(図1A、B)および鼻腔内投与の変動性により、実験中の数匹のマウスが体重を減らさず、組織の損傷を経験せず、数匹のマウスが体重を>30%減らし、安楽死をもたらすのは正常である(図1D)。例えば、特定の遺伝子のKOを有するマウスとそのWT対照との間の生存率と体重減少の差を決定しようとする実験では、IAVの力価と投与量を調整する必要があり、これら2つのパラメータにおけるそのような差を検出するために必要なサンプルサイズを決定するために検出力計算を実行する必要がある。
全体的な組織構造とマウスの健康状態の変化に加えて、すべての肺細胞コンパートメントへの転写変化は、損傷に対する組織の応答の過程で発生します。これには、移行期または中間上皮細胞状態および骨髄性免疫細胞状態を含む、組織が修復されるにつれて最終的に解消する一過性の細胞状態と、Krt5+上皮細胞およびTrkB +内皮細胞9などの機能修復に寄与しない持続性細胞状態の両方が含まれます。例えば、マウス肺の毛細血管内皮では、インターフェロン刺激遺伝子の高発現を特徴とする一過性のインターフェロン刺激内皮細胞状態が6 dpiで発生します(図2A)。この状態は11〜19dpiで解決されます(図2A)。損傷誘発性毛細血管内皮(iCAP)状態は11 dpiで発生し、 Ntrk2 (TRKB)、 Sparcl1、および Bnip3 の高発現を特徴とします(図2B)。インターフェロン刺激された内皮細胞状態とは異なり、iCAP内皮細胞状態は、重度に損傷した組織の領域に持続し、感染後1年でも存在します(図2C)。肺胞移行細胞および未熟な肺胞I型上皮(AT1)細胞状態を含む一過性の肺胞上皮細胞状態も、感染後に発生します(図2D)。最後に、感染により、多くの内因性肺胞マクロファージ (aMAC_a) が失われ、炎症性単球 (iMON) と内因性 aMAC の両方から再構成されます。感染後1年の肺胞マクロファージは、その起源に応じて異なる転写状態(aMAC_aおよびaMAC_b)を持っています(図2E)9。急性肺損傷後に発生する一過性および持続的な細胞状態は、ニッチ内での異常な挙動が組織修復の成功とその後の組織機能に生産的または否定的に寄与する可能性があるため、さらなる研究が必要です。シングルセルRNAシーケンシングデータは以前に公開されており 9、GEO:GSE262927としてGene Expression Omnibusに寄託されています。
図1:肺損傷と動物の健康のモニタリング。 (A)左側の模擬感染(PBS処理)肺、右側のIAV感染肺からの肺組織切片のヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色。損傷していない肺と比較して、IAVに感染した肺は不均一な組織損傷を示します。スケール バー、1 mm。(B) MATLAB20 の k 平均値クラスタリング アルゴリズムを使用すると、組織損傷は重度 (赤)、損傷 (緑)、または正常 (青) として特徴付けることができます。左側のPBS処理肺葉では、気道上皮細胞の密度と染色強度により、気道構造が「重度」に分類されることに注意することが重要です。ただし、このベースラインを考慮すると、PBS で処理された肺とインフルエンザに感染した肺の違いを簡単に識別することは可能です。スケールバー、1 mm。(C)感染後13日(dpi)にマウスの肺を採取した代表的なIAV感染実験からの体重減少曲線の例。曲線には6匹の野生型マウスのデータが含まれており、ドットは平均を表し、エラーバーは平均の標準誤差を表します。(D)感染後14日(dpi)にマウス肺を採取した代表的なIAV感染実験からの生存曲線の例。曲線には、7匹の野生型マウスからのデータが含まれています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:IAV感染後の毛細血管内皮細胞状態の変化のモニタリング。 (A)インターフェロン刺激EC状態は6 dpiで発生し、11〜19 dpiの間で分解されます。インフルエンザ感染後のいくつかの異なる時点でのマウス肺からの公開された単一細胞RNA配列決定データの再分析は、すべての毛細血管内皮細胞型におけるインターフェロンモジュールスコアが6dpiで最も高いことを示しています。データは R を使用して再分析され、インターフェロン モジュール スコアは、各細胞型内の 87 のインターフェロン刺激遺伝子の発現に基づいています。CAP1、毛細血管1型内皮細胞;iCAP、損傷誘発性内皮細胞;CAP2、毛細血管2型内皮細胞;EC、内皮細胞。(B)対照的に、Ntrk2(TRKB)の発現を特徴とする損傷誘発性EC状態は、11 dpiで発生し、感染後最大1年間持続します。スケールバー、500 μm。(C)インフルエンザ感染後の肺毛細血管内皮細胞の単一細胞RNA配列決定からの転写データは、組織修復中の毛細血管内皮細胞状態の動的な性質を示しています。(D)肺胞上皮細胞もインフルエンザ感染後に細胞可塑性を経験します。肺胞移行細胞型は6〜11 dpiの間で発生し、19 dpiで分解されます。未熟なAT1細胞状態(AT1_c)は11 dpiで発生し、90 dpiまで持続します。(E)感染後、多くの既存の肺胞マクロファージ(aMAC_a)が失われ、6 dpiで炎症性単球(iMON)の流入が見られます。肺胞マクロファージ集団は、aMAC_a集団を再生するための既存のaMACと、aMAC_b集団を生成する炎症性単球の両方によって再構成されます。どちらも肺胞マクロファージ状態を表しますが、結果として得られるaMACは転写的に区別できます。(C-E)のグラフは、縦断的インフルエンザ感染データセットの各時点での各集団の細胞の割合を示しており、Rを使用して生成されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:インフルエンザ感染後の動物をモニタリングするためのサンプル傷害ログ、体重ログ、および体調スコア(BCS)ログ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ディスカッション
ここでは、インフルエンザウイルスをマウスに移してマウスの肺に迅速かつ効果的な損傷を開始する便利な方法を報告し、再生の成功と異形成修復の両方のメカニズムを研究しました。A/PR/8/34 IAV の鼻腔内接種がストレスのない技術であることを実証します。イソフルラン麻酔後の接種が完了するまでにマウス1匹あたり2分もかかりません。これは、自然な感染経路をたどる単純で非侵襲的なウイルス接種技術であり、より生理学的に関連する方法で組織と免疫系の両方の反応を研究することを可能にします。マウスの鼻孔から接種されたウイルスは、粘膜免疫と全身免疫の両方を誘導することができます21。さらに重要なことは、ウイルス感染によって引き起こされる損傷が、ヘマトキシリンとエオシン(HE)染色で染色された肺組織スライスではっきりと見えることです22 (図1)。肺の各コンパートメントにおける肺細胞型の予想される転写変化の完全なタイムラインは、以前に公開されています9。ここでは、このデータのサブセットを再分析して、マウス肺の毛細血管内皮、肺胞上皮、および骨髄免疫コンパートメントにおいて、感染していないマウスからのインフルエンザ感染に対する応答の過程で一過性および持続的な転写変化が感染後1年まで起こることを実証しました(図2)。
このプロトコルにはいくつかの重要なステップがあり、これらのステップを適切にトラブルシューティングすることで、実験を成功させることができます。A/PR/8/34 インフルエンザ ウイルスは、ヒトに生産的に感染しないマウス適応型インフルエンザ株です23 が、実験室職員の感染の可能性を避けるために、実験中に示されたすべての安全手順に従うことが常に重要です。イソフルラン麻酔の投与は、マウスが起きているときにウイルスをうまく吸い込まないため、ウイルスの送達を確実に成功させるための重要なステップです。呼吸をチェックし、処置中にマウスの頭の動きを監視して、ウイルスが両方の鼻孔に接種されていることを確認します。マウスが完全に麻酔されていない場合、気泡が発生し、ウイルスの吸入が制限され、エアロゾルが生成される可能性があります。両方の結果は避けるべきであり、くしゃみや鼻孔の泡が観察された場合は、マウスをイソフルラン鼻円錐に戻す必要があります。体重減少、体調スコア、健康状態の測定、回復栄養補助食品の提供などの感染後のモニタリングも、この実験の重要な要素です。マウスが十分な体重を減らさない、または予想される量の組織損傷がないことが観察された場合(図1)、用量が低すぎる可能性があります。一方、多くのマウスが30%の体重減少エンドポイントに達する場合は、用量が多すぎる可能性があります。いずれの場合も、ここで説明するように、C57BL/6マウスのコホートを使用して、ウイルスのロットの経験的力価を通じて適切な用量を決定することが最善です。
インフルエンザ感染は世界中で蔓延し続けており、重度の呼吸器疾患を引き起こし、致命的となる可能性があるため、ウイルス感染のプロセスと、感染に対する細胞反応および肺の組織損傷を理解することが最も重要です。したがって、この研究で説明されている鼻腔内感染法は、重要な調節メカニズムの特定と肺疾患の新しい治療アプローチの開発に役立つ可能性があります。さらに、この技術の将来の応用では、X31などのマウス適応インフルエンザウイルスの別の株を使用して、反復性呼吸器感染症の場合の肺組織の構造と機能への影響を判断する可能性があります。多くの人が生涯に複数の呼吸器感染症に罹患しているため、このモデルのこのような拡張は、肺組織再生の研究、ひいては公衆衛生にとって重要な意味を持つ可能性があります。
開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、米国国立衛生研究所 (NIH)、国立がん研究所、がん研究センターの学内研究プログラムによって支援されました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1.5 mLチューブ | フィッシャー・サイエンティフィック | 02-682-557 | |
| 100 & マイクロ;M細胞ストレーナー | ファルコン | 352360 | |
| 15 mL円錐形チューブ | ファルコン | 352196 | |
| 1倍PBS | Gibc0 | 10010-023 | |
| 40 & micro;M細胞ストレーナー | ファルコン | 352340 | |
| 5mLチューブ | グローブ | 6101C | |
| 50 mL円錐形チューブ | ファルコン | 352098 | |
| A/PR/8/34 インフルエンザウイルスストック | ATCC | VR-95PQ | ロットによってウイルス価が異なります |
| ACK溶解バッファー | クオリティ・バイオロジカル | 118-156-101 | |
| 抗TRKB抗体 | R&Dシステムズ | AF1494 | |
| ブリーチ | クロロックス | 漂白剤10% | |
| 牛血清アルブミン | シグマ・オルドリッチ | A8022 | |
| CO2麻酔誘導室 | どんな人でも | 該当なし | |
| コラーゲナーゼタイプI | ギブコ | 17100017 | |
| ダピ | ミリポール・シグマ | 28718-90-3 | |
| 散らす | コーニング | CB-40235 | |
| 解剖用具:はさみ、曲がったピンセット、直線ピンセット | どんな人でも | 該当なし | |
| ドナース | シグマ・オルドリッチ | 4716728001 | |
| D-PBS | コーニング | 21-031-CM | |
| エタノール | ファームコ | 111000200 | |
| ガラス製バイアル | DWKライフサイエンス | 986562 | |
| アイスバケツ | どんな人でも | 該当なし | |
| イソフルラン | コヴェトルス | 29404 | |
| 針、21–23G | どんな人でも | 該当なし | |
| P20/P200ピペット | ピペットマン | F144056M/F144058M、 | |
| P20/P200 ピペットチップ | トーマス・サイエンティフィック | 1159M43/1159M40 | |
| パラホルムアルデヒド(PFA) | サーモ・サイエンティフィック | J19943-k2 | 2%PFA |
| ピペットマン | どんな人でも | 該当なし | |
| プラスチック製または段ボール製の冷凍庫 | どんな人でも | 該当なし | |
| カミソリの刃 | どんな人でも | 該当なし | |
| リングスタンド | どんな人でも | 該当なし | |
| 血清学的ピペット、5 mL | ファルコン | 357543 | |
| スライドトップ誘導マウスイソフルランチャンバー | ソムニ・サイエンティフィック | ||
| 縫合 | フィッシャー・サイエンティフィック | NC9422522 | |
| 注射器チューブとルーアロック | どんな人でも | 該当なし | |
| 注射器、10mL | どんな人でも | 該当なし | |
| テーブルトップ麻酔装置イソフルラン | オーメダ | オーメダ・イソテック - 4 | 流量は2.5とndashであるべきです。3% |
| 超低融解アガロース | シグマ・オルドリッチ | A5030-1G | |
| 計量バランス | オーハウス | CS200 |
参考文献
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