CD44 は、PI3K/Akt 経路の活性化を介して炎症カスケードと破骨細胞の分化を調整することにより、疾患の病因を促進します。グリシテインは、CD44 を介したシグナル伝達の標的を絞った減衰を通じて、併存する骨粗鬆症 (OP) + 歯周炎 (PD) 症状に対して治療効果を発揮します。
研究記事
CD44 は、PI3K/Akt 経路の活性化を介して炎症カスケードと破骨細胞の分化を調整することにより、疾患の病因を促進します。グリシテインは、CD44 を介したシグナル伝達の標的を絞った減衰を通じて、併存する骨粗鬆症 (OP) + 歯周炎 (PD) 症状に対して治療効果を発揮します。
この研究は、プロテオミクスプロファイリングを通じて骨粗鬆症(OP)と歯周炎(PD)の併存に関連する重要な分子決定因子を解明すると同時に、OPマウスモデルにおける実験的歯周炎におけるCD44の調節機能を描写します。フェーズ I では、比較プロテオミクス分析のために当施設で定期的な健康評価を受けている OP+PD 患者 (n = 3) と健常対照者 (n = 6) から血清検体を採取しました。その後、差次発現遺伝子(DEG)および関連するシグナル伝達カスケードの翻訳検証が、臨床検体およびOP+PDマウスモデル全体で実施されました。骨粗鬆症条件下での PD 進行における CD44 の役割を機構的に特徴付けるために、両側卵巣摘出術によって OP マウス モデルが生成され、続いて結紮留置による実験的 PD 誘導が行われました。包括的な評価には、ヘマトキシリン-エオシン染色による組織形態計測的変化、マイクロCTを使用した上顎第一大臼歯領域の微細構造骨分析、およびホスホイノシチド-3-キナーゼ(PI3K)/Akt経路成分のイムノブロッティング評価が含まれていました。分子ドッキングシミュレーションと組み合わせた並列ネットワーク薬理学的スクリーニングを実行して、治療の可能性を秘めたアンジェリカシネンシスの生理活性成分を特定しました。プロテオミクス調査により、CST3、A2M、CD44、CDH13、CETPおよびVWFがOP+PD病因の候補病原性メディエーターとして同定されました。私たちの手では、遺伝子セット濃縮分析により、PI3K/Akt シグナル伝達が OP+PD 疾患進行の主要なメディエーターとして機能することが明らかになりました。定量的逆転写PCRベースの検証により、臨床および実験のOP+PDコホートの両方で有意なCD44アップレギュレーションが確認されました。CD44抑制によるin vivo調節は、PI3K / Akt経路阻害と同時に、OPマウスの歯周組織の完全性を大幅に回復し、炎症細胞浸潤を減少させ、歯槽骨の微細構造を強化しました。ネットワーク薬理学により、グリシテインがアンジェリカ・シネンシスの主要な生理活性植物化学物質であり、CD44 がその中心的な分子標的として特定されていることが明らかになりました。グリシテインは、OP+PDマウスの歯槽骨構造を改善し、骨体積分率(BV/TV)、骨柱厚(Tb.Th)、骨密度(BMD)を増加させ、小柱帯数(Tb.N)、骨表面対骨体積比(BS/BV)を減少させ、より健康な骨質を示し、機械的にCD44シグナル伝達軸の減衰に起因します。
歯周炎 (PD) は、歯肉溝1 における病理学的バイオフィルムの沈着によって引き起こされる複雑な混合微生物疾患です。これは、宿主内の病理学的炎症カスケードを引き起こし、最終的には歯周付着系の構成要素であるセメント質、歯周靭帯、歯槽骨に不可逆的な進行性の損傷をもたらす微生態学的環境の不均衡を特徴としています。これにより、歯が緩んだり、喪失したりする可能性があります2.この量は比較可能性のために標準化されており、最新の疫学データ3 は、世界中で 10 億 6,600 万人以上が重度の歯周炎に苦しんでおり、年齢標準化された有病率は約 12.5% であることを示しており、国際的な人口間でかなりのばらつきがあることが浮き彫りになっています。
全身性骨疾患である骨粗鬆症 (OP) は、骨の微細構造の大幅な劣化と骨量の体系的な損失を特徴とします 4,5。骨折のリスクは、特に高齢者において、この構造的弱点によって大幅に増加します。特に、日本の65歳以上の人は、30歳から64歳までの成人よりも歯周病の有病率が高かった。閉経後の女性は歯周病の発生率が高く、他の健康上の問題を経験することがよくあります 6,7。この研究では、2005年から2025年にかけて、疾病負担は50%以上増加し、経済的コストは170億ドルから250億ドルに増加すると予測しています。この研究では、2005年から2025年にかけて、疾病負担は50%以上増加し、経済的コストは170億ドルから250億ドルに増加すると予測しています。この傾向は、これらの歯周病が社会経済に及ぼす重大な影響を浮き彫りにしています。さらに、歯周病および歯肉炎の女性患者では、病気の期間とその慢性化と健康リスクの増加との間に明らかな正の相関関係があります8。
以前の研究では、OP は、加齢、喫煙、カルシウムとビタミン D の不十分な摂取など、両方の疾患に共通する危険因子により、PD の発症を促進する可能性があり、その逆も同様であることが示されました。閉経後の女性集団では、重度の OP は下顎ミネラル含有量の減少を伴う可能性があり、これは歯周付着のレベルの欠乏に関連している可能性があります9。OP に関連する骨密度の低下は、PD 誘発性歯槽骨吸収を促進し、それによって歯周病原体の侵入を促進する可能性があることが実証されています10。加齢および生理学的変化に関連するさまざまな健康課題の中で、PD と OP は、世界的な人口の高齢化の加速と閉経期女性の数の大幅な増加に伴い、特に顕著です。したがって、関連する指標とその関連性を明らかにすることは、病気の予防、治療、予後評価にとって非常に重要です。これらの側面に動機付けられて、この研究では、OP+PDの開発において、 CD44を介したPI3K/Aktシグナル伝達に重点を置いて、プロテオミクスを使用して主要なタンパク質をスクリーニングし、OPマウスの実験的PDモデルを使用して主要なタンパク質の調節的役割と考えられるメカニズムを調査しました。抗炎症作用と骨保護作用のために臨床現場で広く使用されており、骨粗鬆症や歯周病における骨量減少を軽減し、炎症反応を調節することが以前に報告されている伝統的な漢方薬 であるアンジェリカ・シネンシスに含まれる標的治療薬のさらなるスクリーニング。ネットワーク薬理学と分子ドッキングに基づいて、グリシテインは主要な生理活性植物化学物質であり、OP+PD 介入の合理的な候補として特定されました。
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すべての動物実験は、実験動物の世話と使用に関する施設のガイドラインに従って実施されました。研究プロトコルは動物倫理委員会によって審査され、承認されました。動物の苦しみを最小限に抑えるためにあらゆる努力が払われました。
この研究は、骨粗鬆症と歯周炎 (OP+PD) を併発する骨粗鬆症 (OP+PD) 中の破骨細胞分化と炎症進行における PI3K/Akt 経路の CD44 を介した調節の役割を評価し、アンジェリカ シネンシスの生理活性化合物であるグリシテインがこれらの効果を治療的に調節できるかどうかを判断することを目的としています。理論的根拠は、CD44の過剰発現をOP+PDの病理学的骨吸収および免疫調節不全に関連付ける新たな証拠に由来しています11,12,13。プロテオミクス、in vivo モデリング、およびネットワーク薬理学を統合することにより、このプロトコルは、疾患の進行を軽減するための分子メカニズムと治療介入を体系的に調査します14。
in vivo 実験のサンプル サイズは以前の研究と検出力分析に基づいており、グループあたり n = 6 となり、治療条件間で有意差 (P < 0.05) を検出するのに十分な統計的検出力が保証されます。グリシテインを50 mg / kgおよび100 mg / kgの用量で投与し、オリーブオイルの5%DMSOに懸濁し、毎日の経口強制経口投与によって送達されました。マウスは、PDの導入後8週間にわたって監視されました。歯周炎症を誘発するための結紮糸の配置は5-0絹糸を使用し、両側卵巣摘出術は0.3%ペントバルビタールナトリウム麻酔(0.5 mL / 100 g)下で行われました15。さらに、RT-qPCR、ウェスタンブロッティング、ELISAなどの分子アッセイは、検証済みのプロトコル16を使用して実施され、ヘマトキシリン-エオシン(H&E)やメチレンブルー染色などの組織学的評価は、確立されたタイムラインと染色期間に従いました。
化学試薬、染色剤、および生物学的試料を含むすべての実験手順は、健康リスクを最小限に抑えるために、標準的なバイオセーフティプロトコルに従って実施されました。ホルマリン、EDTA、メチレンブルー、酸性フクシンなどの危険物は、手袋、マスク、安全ゴーグルなどの個人用保護具(PPE)で取り扱われました。使用済み試薬や汚染された使い捨て製品を含むすべての廃棄物は、指定されたバイオハザード容器に収集され、制度的および環境安全ガイドラインに従って認定された有害廃棄物処理サービスを通じて処分されました。 図1 は、実験ワークフロー全体を示しています。
臨床データ収集
私たちの研究では、3 人の OP+PD 患者と 6 人の対照被験者のベースライン臨床データと、人口統計学的要因やライフスタイル要因、解剖学的および転移プロファイルを含む詳細な病歴を体系的に収集し、包括的に分析しました。さらに、HPV感染の検査結果(陽性または陰性)の厳密な確認が行われました。転移性病変の進行段階または再発パターンを詳細に記録しました。免疫療法の最初の 7 日間、患者の血液サンプルが体系的に収集され、血液定期検査などの生化学的指標を含めて標準化されました。定期的な血液検査は、血小板、リンパ球、好中球などの主要なパラメーターを正確に評価するために、標準手順に厳密に従って実施されました。血清アルブミンを並行して測定し、グロブリン濃度指数の定量分析によって肝機能を評価しました。
患者
骨密度の評価と参加者の層別化
腰部と大腿骨頸部の骨密度測定値を体系的に比較しました。すべての検査は、当科の経験豊富な放射線科医が精密機器を用いて骨密度値を正確に定量化しました。標準化されたサンプル収集を確実にするために、参加者はサンプリングの少なくとも 8 時間前に絶食する必要がありました。骨密度データと包括的な歯周評価データを統合することにより、被験者を歯周炎を伴う骨粗鬆症 (OP+PD) グループまたは健康な対照グループ (HC) のいずれかに厳密に分類し、2 つのグループ間で性比が完全に一致するようにしました。性別一致とは、OP+PD 群と健康な対照群の間で女性が均等に分布することを指します。ただし、閉経後の骨粗鬆症に焦点を当てるために、この研究には女性参加者のみが含まれていました。どちらのグループにも男性被験者はいませんでした。この研究はヘルシンキ宣言の倫理ガイドラインを遵守し、すべての参加者が正式なインフォームドコンセントフォームに署名し、自分たちの権利を完全に保護しました。
診断パラメータ
骨粗鬆症は、原発性骨粗鬆症の診断と管理に関する中国ガイドライン (2022)17 に従って定義され、腰椎 (L1-L4) または股関節 BMD の診断閾値は T スコア ≤ -2.5 標準偏差 (SD) に設定されました。歯周炎の病期分類は、2018 World Workshop Classification of PeriodontalDiseases 18 に従い、グレード A のステージ II-III の症例に限定されました。包含基準:50〜65歳の閉経後の女性、上記の基準を満たすOPとPDの二重診断、自己免疫疾患の欠如、悪性新生物の病歴なし、正常な心肺、肝、および腎機能。除外基準:患者または家族による参加の拒否、OPまたはPDに対する最近(≤6か月)の薬物療法。
血清サンプルのプロテオミクスプロファイリング
プロテオミクス分析のために、3 人の OP+PD 患者と 6 人の対照被験者からの血清サンプルが収集されました。相対的なタンパク質定量は標準的な手順によって達成され、差次的に発現されたタンパク質は、P < 0.05、倍数変化 > 1.519 のタンパク質として定義されました。
遺伝子セット濃縮解析(GSEA)
GSEA を使用して、対照コホートと OP+PD コホートの間で調節不全の主要なシグナル伝達経路を特定しました。生のトランスクリプトームデータは、最初にlog2変換を使用して変換され、分位点正規化によって正規化されてバッチ効果が除去されました。複数の生物学的機能を持つ遺伝子セットを分子シグネチャデータベース(MSigDB)からスクリーニングし、ノンパラメトリックウィルコクソン順位和検定を使用して統計的有意性を評価しました。濃縮結果は、正規化された濃縮スコアと誤発見率(FDR<0.25)を使用して報告されました。
重み付け遺伝子共発現ネットワーク解析(WGCNA)
WGCNAを使用して、OP+PD表現型に有意に関連する遺伝子モジュールを特定しました。スケールフリーのネットワークトポロジー(R2 > 0.85)を達成するために12のソフトしきい値検出力が選択され、ピアソン相関分析を使用してモジュール固有遺伝子と臨床形質の間の関係が評価されました。機能濃縮分析を実施して、強く相関するモジュールにおける関連する生物学的経路を明らかにしました。
卵巣摘出術誘発性骨粗鬆症マウスモデルの確立
この研究には、116 匹の SPF グレードの雌マウスが参加しました。実験の前に、動物は7日間の適応段階で制御された温度と湿度の条件下で飼育され、その間に標準化されたげっ歯類の餌と蒸留水が与えられました。すべての動物取り扱い手順は、西安交通大学健康科学センターの倫理委員会によって承認された倫理プロトコルに厳密に従っており、承認 ID 0609 で行われました。この研究はプロジェクト番号 [2024-054] で登録されました。
両側卵巣摘出術 (OVX) 手術プロトコル:
マウスに0.3%ペントバルビタールナトリウム(0.5 mL / 100 g体重)の腹腔内注射によって麻酔をかけました。背側の毛皮は外科的に脱毛され、動物は加熱された無菌の手術プラットフォーム上で背側に横たわった状態で配置されました。75%エタノールで無菌調製した後、腎脂肪パッドのレベルで両側傍脊椎切開(脊椎の外側1 cm)を行いました。卵巣滑液包を外部化し、卵管を5-0シルク縫合糸を使用して卵巣の近位に結紮し、続いて両側卵巣、関連する脂肪組織、および部分的な卵管構造を切除しました。筋膜層と皮膚層を 4-0 吸収性縫合糸で順次閉じました。術後の消毒は75%エタノールで行いました。
偽手術コントロール:
偽手術マウスは、卵巣摘出を行わずに、卵巣曝露および周囲脂肪組織切除を含む同一の処置手順を受けました。
術後管理:
麻酔後の回復は、完全に歩行するまで循環水加熱パッドを使用して促進されました。鎮痛は、術後 72 時間カルプロフェン皮下投与 (1 日 5 mg/kg) によって維持され、手術部位の感染を防ぐために予防的ペニシリン G (50,000 IU/kg) が 48 時間補充されました。体重は、6週間の骨粗鬆症モデリング段階で毎週監視され、除外基準は>20%の体重減少または臨床的苦痛を示す動物に適用されました。
実験的OP+PD動物モデルの構築
実験用PDモデルは、以前に確立されたOP動物モデルに基づいて開発されました。糸の断線を防ぎ、大臼歯間のスムーズな挿入を確保するために、結紮には 5-0 シルク縫合糸が使用されました。処置中、マウスの口角をそっと引っ込め、鉗子で糸をつかみ、第一大臼歯と第二大臼歯の間の頸部領域に慎重に配置しました。ワイヤーと鉗子の先端は水平に保たれ、頬粘膜への外傷を最小限に抑え、それによって出血や死亡のリスクを軽減しました。もう一方の手はワイヤーの反対側の端をそっと引っ張り、大臼歯の間の歯間空間に徐々に導きました。糸が適切に配置されたら、頬側近くのセクションを鉗子でクランプし、同じ技術を使用して第 2 大臼歯と第 3 大臼歯の間を慎重に通過させました。穏やかな下向きの牽引力により、シルクのスムーズな通過が保証されました。最後に、糸は頸部中央部の第二大臼歯の周りにしっかりと結び付けられました。その後、マウスは回復を許されました。
定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)
材料表には、CD44、CDH13、VWF、GAPDHなど、炎症、凝固、細胞接着に関連する遺伝子を標的とするRT-qPCRの特定のフォワードおよびリバースプライマー配列がリストされています。RT-qPCR解析に用いられるプライマー配列を表1にまとめます。
ウェスタンブロット分析
歯周組織における主要なシグナル伝達経路タンパク質の発現特性は、ウェスタンブロッティングを使用して体系的に研究されました。全タンパク質を効率的に抽出するために、プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤を含むRIPAバッファーを使用して歯周組織を凍結融解均質化しました。高速遠心分離(12,000 × g、4°C、10分)して溶解物を分離した後、上清を使用してBCAキットでタンパク質濃度を正確に測定し、その後の実験に信頼できるデータを提供しました。
各実験グループについて、30 μgの総タンパク質をロードし、10%SDS-PAGEシステムを介して分離しました。次に、分離されたタンパク質をセミドライブロッティング法を使用してPVDFメンブレンに転写しました。バックグラウンド干渉を最小限に抑えるために、膜は周囲温度で h の間 5% 脱脂粉乳でブロックされました。その後、膜を安定した環境で4°Cに保ち、さらなる処理を行いました。
次に、膜を特異的一次抗体( 材料表を参照)とともに°Cで2時間インキュベートした。 翌日、TBSTバッファーを使用して徹底的な洗浄を行い、メンブレンをHRP結合二次抗体で1:10,000希釈で室温で1.5時間処理しました。すべての免疫検出ステップは、シグナル伝達経路解析の一貫性と妥当性を確保するために、標準化されたプロトコルに厳密に従って実行されました20。
増強化学発光(ECL)基質を使用してシグナルをキャプチャし、高解像度イメージング装置を使用してタンパク質バンドを正確に特定することにより、ImageJソフトウェアを使用してバンドの光学密度値を定量的に分析しました。最終的に、各グループの標的タンパク質/β-アクチンの相対発現レベルを対照群と体系的に比較することにより、さまざまな介入の下でのPI3K/Akt経路の活性化程度と動的変化を正確に評価しました。
酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)
ELISAキット( 材料表を参照)を用いて、血清サンプル中のTNF-α、IL-6、IL-1β、IL-4など、様々な炎症性サイトカインの正確な定量化を達成しました。また、破骨細胞活性のマーカーとして、TRAP5b、ALP、およびTGF-βの濃度も評価しました。捕捉抗体でプレコートされた96ウェルプレートを、PBSで1:10に希釈した血清サンプルとともに25°Cで2時間インキュベートし、抗原が固定化された捕捉抗体に特異的に結合できるようにします。インキュベーション後、PBS-T(Tween-20を含むリン酸緩衝生理食塩水)を使用した3回の洗浄により、結合していない物質を除去しました。続いて、ビオチン標識検出抗体を添加し、同じ温度で1時間インキュベートした。次に、ストレプトアビジン-HRPを導入してビオチン化抗体に結合し、混合物を光保護条件下で室温でさらに20分間インキュベートしました。次に、酵素反応を停止溶液を使用して終了し、マイクロプレートリーダーを使用して吸光度を450 nmで測定し、サイトカイン濃度を決定しました。
ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色
標準的な方法を使用して、歯周組織のパラフィン包埋切片に H&E 染色を実行し、微細構造の変化を分析しました。サンプル調製プロセスには、4%パラホルムアルデヒド溶液に24時間固定し、続いて段階的なエタノール脱水(70%、80%、95%、および100%)およびキシレン中での透明化、そして最後にパラフィンに包埋して厚さ4μmの切片を生成することが含まれていました21。キシレンで脱ろうした後、サンプルはエタノール濃度の下降(100%〜70%)で再水和されました。染色プロセスは、ヘマトキシリン(マイズナー氏)に5分間浸漬することから始まり、続いて流水ですすぎ、エタノール中の1%酸性アルコールで分化し、さらにすすぎました。次に、切片を0.5%エオシンで10秒間染色して、プロトコルを完了しました。
染色後、スライドを段階的なエタノールシリーズで再度脱水し、キシレンでクリアし、封入剤で密封しました。観察は、高解像度画像取得のための10倍および40倍の対物レンズを備えた顕微鏡下で行われました。組織学的分析により、歯周結合組織の構造的完全性、炎症細胞浸潤、および歯槽骨吸収形態が評価されました。炎症のレベルは、改善された Loe-Silness 指数を使用してスコアリングされ、サンプルの同一性を知らされていない 2 人の病理学者が、客観性と再現性を確保するために半定量的スケールを介してサンプルを独立して評価しました22。
メチレンブルー染色
この研究では、骨吸収の程度を定量化するために、標準化され処理された上顎歯槽骨切片にメチレンブルー染色法を採用しました。実験手順は組織固定から始まり、歯周組織を10%中性ホルマリン溶液で24時間固定し、続いて10%EDTA(pH 7.4)溶液で21日間脱灰処理しました。脱灰後、サンプルをパラフィン包埋し、厚さ4μmの組織切片に調製し、シラン化スライドにマウントしました。切片前処理プロセスには、キシレン脱ろう、勾配エタノール水和、および60°Cのウォーターバスでのインキュベーションが含まれていました。次に、スライドを0.1%メチレンブルー溶液で15分間染色しました。
染色後、60°Cに予熱した蒸留水を使用して切片を1分間洗浄し、組織構造を損傷することなく余分な色素を効果的に除去しました。次に、組織構造間のコントラストを高めるために、0.1%酸性フクシンで5分間対比染色しました。この染色プロトコルは、歯槽骨吸収の定量分析のための一貫した信頼性の高い視覚化を提供しました23。最後に、スライドを段階的なエタノールを使用して脱水し、キシレンで除去してマウントしました。染色された骨組織をライトフィールド顕微鏡で分析し、高解像度の画像を取得して、その後の形態学的評価のために歯槽骨縁の吸収を正確に評価しました。
マイクロコンピュータ断層撮影(Micro-CT)解析
マイクロCTスキャンは、OP+PDモデルマウスの歯槽骨の3D微細構造変化を評価するために実施され、特に上顎第一大臼歯領域を標的としました。術後8週間のモニタリング後、マウスは顎顔面構造の保存に適した方法であるCO2 吸入によって人道的に安楽死させた。次に、上顎標本を採取し、4%パラホルムアルデヒドで4°Cで48時間24間固定しました。
マイクロCT解析は、スキャンした標本に対応するデータセットを選択することにより、ソフトウェアにインポートされた上顎領域の再構成DICOM画像を使用して実行されました。標準的な関心領域 (ROI) は、矢状面および冠状面の歯槽骨構造の輪郭を描くことにより、上顎第一大臼歯の根元の近心頬側 3 分の 1 の部分として手動で定義され、通常、約 50 個の連続したスライスが含まれ、その領域を完全に覆いました。
小柱骨を周囲の軟部組織および背景から分離するために、180〜220 mgHA / cm3 の密度閾値を適用しました。次に、セグメンテーションを実行して、小柱骨のみを表す二元構造を生成しました。形態計測分析は、ソフトウェア内の骨形態測定モジュールを使用して実行されました。骨体積率 (BV/TV)、小柱帯の厚さ (Tb.Th)、小柱帯数 (Tb.N)、骨表面対骨体積比 (BS/BV)、骨密度 (BMD) などのパラメータが自動的に計算されました。分析後、数値結果をスプレッドシートとしてエクスポートしました。
これらの測定値は、OP+PD の病理学的状態に関連する歯槽骨の微細構造損傷の程度を評価し、骨質の回復におけるグリシテインの治療効果を評価するために使用されました。このアプローチにより、歯周骨環境における構造的完全性の高解像度、再現性、定量的評価が可能になり、治療結果に関する重要な形態学的洞察が得られました。
ネットワーク薬理学プロファイリング
骨粗鬆症と歯周炎 (OP+PD) の併存に関連する主要な生物学的経路を調節する可能性のある伝統的な漢方薬 (TCM) の生理活性成分を体系的に調査するために、この研究ではネットワーク薬理学的アプローチを採用してアンジェリカ シネンシスを分析しました。この植物は、骨粗鬆症と慢性歯周病の両方に関連する症状を含む、骨関連の障害や炎症を管理するための中医学における歴史的な使用に基づいて選択されました。化合物スクリーニング段階では、アンジェリカシネンシスの有効成分をTCMSPおよびTCMIDデータベース[データベースの詳細はToMに移動]を使用して取得し、経口バイオアベイラビリティ(OB)≥30%および薬物類似性(DL)≥0.18基準を使用してフィルタリングされました。化合物と標的の相互作用は、STITCHを使用して予測され、DisGeNETおよびOMIMを介して標的部位の検証が行われました。DAVID 2021プラットフォームを使用して経路濃縮解析を実施し、選択された化合物によって調節される可能性のあるKEGGシグナル伝達経路を特定しました。分子相互作用を可視化するために、トポロジカル指標(程度中心性、中間中心性)に基づいて「化合物-標的-経路」ネットワークを構築しました。この分析により、天然フラボノイドであるグリシテインが、良好な薬物動態特性と CD44 への強い結合性を持つ化合物として特定され、OP+PD における潜在的な治療的関連性が示唆されました。しかし、グリシテインは骨粗鬆症や歯周炎の治療薬として臨床的に承認されていません。これらの発見は、インシリコ予測に基づいており、その後のin vivo検証実験のための理論的枠組みを提供します 25。
分子ドッキングの検証
CD44(PDB ID:1UUH)およびPI3K(PDB ID:4L23)のタンパク質構造は、RCSBタンパク質データバンク(https://www.rcsb.org)から取得されました。リガンド構造(グリシテイン、リグスチリド)は、分子力場を使用したエネルギー最小化によって最適化されました。ドッキングシミュレーションは、100回の実行、母集団サイズ150、および25×10の6つの エネルギー評価のパラメータの下で遺伝的アルゴリズムを使用して実施されました。結合ポケットは、結晶学的リガンド座標に基づいて定義されました(CD44:20×20×20 Å3;PI3K: 25×25×25 Å3)。得られたドッキングポーズは結合エネルギー(ΔG、kcal/mol)によってランク付けされ、二乗平均平方根偏差(RMSD)閾値<2.0 Åを使用して再現性が検証されました。
OP+PDマウスモデルにおけるジシタインの治療的評価
グリシテイン (純度 ≥ 98%) は、in vivo 実験用の分析グレードで認定された生化学サプライヤーから入手され、アン ジェリカ シネンシスに存在することが知られている天然イソフラボンであり、抗炎症作用と骨保護作用が報告されています26。骨粗鬆症性歯周炎は、両側卵巣摘出術(OVX)および結紮誘発性歯周炎症により、11週齢の雌C57BL/6マウスに誘発されました。マウスは無作為に4つのコホートに割り付けられました(グループあたりn = 6)。
偽手術 + ビヒクル (オリーブオイル中の 5% ジメチルスルホキシド [DMSO]、毎日経口強制経口投与)
OP+PD:疾患モデル+ビヒクル
OP+PD + 低用量グリシテイン (50 mg/kg): 疾患モデル + ビヒクル中のグリシテイン懸濁液
OP+PD + 高用量グリシテイン (100 mg/kg): 疾患モデル + ビヒクル中のグリシテイン懸濁液
統計分析
推論統計テストが実行され、グラフ生成とデータ視覚化のための視覚的なデータ表現が作成されました。数値データは平均 ± SD として表されました。グループ比較は、&l 0.05 の値を統計的に有意であると考慮して、両側対応のない t 検定によって評価されました。これらの方法により、データの堅牢性が確保され、その後の分析結果の信頼性が向上しました。
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OP+PDコホートのプロテオミクスプロファイリング
OP+PD 患者 (n=3) および健常対照者 (n=6) の血清の定量的プロテオミクス分析により、疾患の病因に関与する調節不全タンパク質が特定されました。比較分析により、OP+PD血清と対照では、9つのダウンレギュレーションタンパク質(APOL1、CST3、IGLV3-27、IGHV3-33、PF4、CLEC3B、SRGN、C6、SELL)および6つのアップレギュレーションタンパク質(IGLV9-49、A2M、VWF、CETP、CD44、CDH13)が明らかになりました(図2A、B)。重み付け遺伝子共発現ネットワーク分析(WGCNA)は、表現型に関連する転写モジュールを描写しました。モジュール固有遺伝子の階層的クラスタリングは、ターコイズモジュールとOP + PD表現型の間に強い相関関係(ピアソンのr > 0.85)を示しました(図2C-E
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この研究は、骨粗鬆症と歯周炎 (OP+PD) の併存疾患の根底にある分子メカニズムを調査するために、プロテオミクス プロファイリング、遺伝子発現検証、in vivo 動物モデリング、およびネットワーク薬理学を組み合わせたトランスレーショナル リサーチ フレームワークを提案します。中心的な仮説は、CD44 が PI3K/Akt シグナル伝達軸を調節し、それによって OP+PD 状態での炎症性骨量減少を悪化させ、アンジェリカ シネンシスのフラボノイドであるグリシテインが CD44 を阻害することによってこのプロセスを弱める可能性があるというものです。この統合されたアプローチは、分子病因とハーブ薬理学を橋渡しし、全身性骨格炎症性疾患における治療法発見のためのプラットフォームを確立します 27,28,29,30。
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著者には宣言すべき利益相反はありません。
この研究は、中国甘粛省医療産業科学技術財団(助成金番号。GSWSKY2020-77)、甘粛省自然科学財団(助成金番号25JRRA314および21JR7RA620)、甘粛省人材プログラム、甘粛省病院の青少年育成研究プログラム(助成金第23GSSYF-35)。
著者の貢献:
Jing Qi は、実験作業とデータ分析の大部分を実施しました。Yunqing Pangは、サンプル収集、データキュレーション、統計分析に貢献しました。Yu Wangは実験計画を支援し、技術サポートを提供しました。Dawei Hou と Jing Wang は共同でプロジェクトを監督し、重要な知的内容について原稿を批判的に修正し、最終版を承認しました。すべての著者が最終原稿を読み、承認しました。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ELISAキット | 上海酵素リンクバイオテクノロジー | 炎症性サイトカイン(TNF-&α;、IL-6、IL-1&β;、IL-4、ALP、TRAP5b、TGF-β、VWF、CD44)の定量 | |
| RNA抽出キット | 上海 Yesheng バイオテクノロジー | 血清RNA抽出 | |
| cDNA合成キット | 上海 Yesheng バイオテクノロジー | 高活性逆転写 | |
| qPCRキット | 上海 Yesheng バイオテクノロジー | 定量的PCR増幅 | |
| 抗体(一次/二次) | 細胞シグナル伝達技術 / Abcam / 杭州賢利バイオテクノロジー / 北京中山金橋バイオテクノロジー | 特異的一次抗体;&β;-アクチン内部コントロール;ヤギ用抗ウサギIgG二次抗体 | |
| 組織学試薬 | Beyotime Biotechnology / 上海上商 | ヘマトキシリン–エオシンとメチレンブルー染色 | |
| 化学発光基質 | ヤッケンバイオテクノロジー | ウェスタンブロット検出 | |
| マイクロCTシステム | Scanco Medical AG (ビバ CT40) | 高分解能微細構造解析 | |
| LC-MS/MSシステム | サーモサイエンティフィックQエグゼクティブHF-X | 高分解能プロテオミクス解析 | |
| ソフトウェア:MaxQuant(v2.1.0)、Andromeda | ブロード研究所 | プロテオミクスデータの前処理 | |
| ソフトウェア: GSEA (v4.3.2) | ブロード研究所 | 経路濃縮分析 | |
| ソフトウェア: R (v4.0.3)、WGCNA (v1.73)、pheatmap (v1.0.12) | R財団 | 統計計算、ネットワーク解析、クラスタリング、ヒートマップ | |
| ソフトウェア: AutoDock 4.2、AutoDockTools 1.5.7 | スクリップス研究所 | 分子ドッキングとグリッド定義 | |
| ソフトウェア: Open Babel 3.1.1 | Babelプロジェクトを開く | リガンド構造の最適化 | |
| ソフトウェア: PyMOL 2.5.2 | シュルöディンガーLLC | 分子ドッキングの可視化 |
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