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研究記事

PAK5はトランスクリプトミックプロファイリングによって明らかになる食道扁平上皮がんの進行を促進します

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DOI:

10.3791/69085

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2025年12月16日

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1Cancer Center, The Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University, 2Department of Radiology, The Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University, 3Department of Pathology, The Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University

この記事について

サマリー

本研究は、ESCCにおけるPAK5機能を評価する方法を提示し、その過剰発現が予後不良を予測し、PAK5-GAREM1シグナル伝達軸を通じて腫瘍の進行を促進することを示しています。

要約

食道扁平上皮癌(ESCC)は、世界的に、特にアジアでがん関連死亡の主な原因の一つです。初期症状がないため、多くの患者は進行期に診断され、治療効果が制限され、予後が悪化します。ESCCのメカニズムを理解し、バイオマーカーや治療対象を特定することは、患者の転帰を改善するために不可欠です。P21活性化タンパク質キナーゼ5(PAK5)は、ミトゲン活性化タンパク質キナーゼファミリーの一員であり、細胞周期、移動、侵入を調節することで様々な悪性腫瘍に関与していることが示されています。しかし、ESCCにおけるその役割は依然として不明です。本研究では、免疫組織化学を用いてESCC組織および隣接する正常組織におけるPAK5発現を評価し、PAK5と予後との関連を評価するためにKaplan-Meier生存解析を実施しました。PAK5の過剰発現およびノックダウンを用いたESCC細胞モデルが確立され、CCK-8、コロニー形成、トランスウェルアッセイなどの機能的アッセイが実施されました。さらに、mRNAシーケンスを実施し、PAK5によって調節される下流標的およびシグナル伝達経路を特定しました。これらの結果は、PAK5発現がESCC組織で正常組織と比べて有意に上昇し、予後が悪化していることを示しました。機能的アッセイにより、PAK5はESCC細胞の増殖、コロニー形成、移動、侵入を促進し、トランスクリプトミクス解析ではGAREM1が重要な下流効果因子であることが示されました。これらの発見は、PAK5がESCCの進行に寄与し、予後バイオマーカーおよび治療標的として機能する可能性があることを示しています。

概要

世界的に見ても、食道がんは最も致死率の高い悪性腫瘍の一つに数えられています。中国では、食道扁平上皮がん(ESCC)が主要な組織学的サブタイプです。治療法の進歩は達成されていますが、ESCC患者の予後は依然として厳しく、5年生存率はわずか10%から25%と表れています1。これは主に早期検出の課題と効果的な分子標的治療法の利用可能性の限界によるものです。他の固形腫瘍で標的治療が大きな期待を示しているのとは異なり、ESCCにおけるこうしたアプローチはまだ初期段階にあり、実践的な分子標的が不足しているため困難を抱えています。

PAK5はグループII PAKであり、細胞骨格動態と生存促進シグナルを統合し、3,4,5,6,7,8,9,10,11の複数の悪性腫瘍における化学抵抗性と関連しています。ESCCの生物学および治療反応におけるMAPKシグナル伝達の重要な役割を踏まえ、PAK5はESCCで上型調節され、MAPKシグナル伝達の調節を通じて悪性表現型を促進していると仮説されました。GAREM1がアダプター/調節因子として関与する可能性があります。13,14,15,16.定量的IHC、機能的遺伝的撹乱、トランスクリプトミックプロファイリングを用いてこの仮説を検証しました。

ESCCの治療は通常、食道切除術、化学療法、放射線療法の組み合わせを伴います。食道切除術は治癒効果があるものの、罹患リスクが高い4,8。さらに、化学療法と放射線療法はすべてのがん細胞を除去できず、耐性、再発、転移を引き起こすことが多い8,9。免疫療法は近年、腫瘍学の重要な焦点として注目されており、進行がんの治療に効果があることを示しています。この関心の高まりは、ESCCの早期診断や治療計画を支援する新たなバイオマーカーの緊急性を強調しています。過去の研究では、PAK1やPAK4など他のPAKファミリーがESCCにおける増殖、浸潤、治療抵抗性を促進することが示されており、このキナーゼファミリーのESCC生物学における重要性が強調されています。しかし、あまり研究されていないグループII PAK5の役割は依然として不明瞭であり、本研究の動機となっています17,18。

P21活性化キナーゼ5(PAK5)はPAK II亜ファミリーの一員であり、2002年に脳特異的キナーゼとして初めて同定されました。PAK5は20p12染色体に位置し、約80 kDaのタンパク質をコードし、主にミトコンドリアと核に存在し、細胞調節10、11、13に多様な役割を果たします。ミトコンドリアにおけるその機能はエネルギー代謝と調節を含み、核の存在は遺伝子転写や細胞周期の制御に関連しています。PAK5は同等のものほど研究されていませんが、神経発達、細胞生存、がんの進行に不可欠であると考えられています10。特に、PAK5は細胞骨格の調節、抗アポトーシス機構、細胞増殖に関与していることが示されています12。腫瘍細胞でのそのアップレギュレーションは新たな薬剤耐性と関連しており、PAK5の過剰発現が腫瘍細胞の化学療法耐性の上昇と関連しているという発見と一致しています10,11,13,14。しかし、PAK5がESCC進行に果たす正確な役割は依然として不明です。本研究はPAK5がESCCのトランスクリプトミック環境に与える影響とその機能的影響を探ります。トランススクリプトミックプロファイリングを行い、ESCC細胞におけるPAK5活性に関連する遺伝子発現変化を特定しました。さらに、PAK5調節制御されたESCC細胞モデルを作成し、腫瘍成長および転移の可能性におけるその役割を明らかにしました。ESCCにおける従来のバイオマーカー発見戦略が主にウェスタンブロッティングや単一モダリティの転写本測定に依存するのに対し、現在のワークフローは定量免疫組織化学、トランスクリプトムプロファイリング、機能的アッセイを統合しています。この組み合わせにより、分子および表現型の同時検証が可能となり、メカニズム的な洞察を提供するとともに生物学的関連性が向上します。さらに、プロトコルは実験的再現性を重視し、腫瘍と隣接組織サンプルのペア、標準化された免疫染色手法、高品質なRNA入力(RNA完全性番号≥7)を用いたシーケンスを行います。これらの特徴は、特にESCCにおける臨床的に意味のあるキナーゼ駆動制御ネットワークの定義を目指す研究において、アッセイの堅牢性と実験室間の適用性を高めています。

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プロトコル

すべての手続きは、海南医科大学第二附属病院の倫理委員会によって承認されました(承認番号:LW2022602)、および各参加者からヘルシンキ宣言に従いインフォームド・コンセントが得られました。本研究で使用される試薬および機器は 材料表に記載されています。

1. 患者および組織サンプルの採取

病理学的に確定したESCC患者40名が登録され、手術前は肝機能および腎機能が正常でした。腫瘍標本(グループT)および隣接する正常組織(グループN;腫瘍縁≥2cm)を手術切除直後に採取しました。組織はパラフィン埋め込み前に、室温のPBSで4%パラホルマルデヒド(PFA)を7日間固定しました。

2. 免疫組織化学的染色

パラフィン埋め込みブロックは5μmで切断され、60°Cで1時間焼かれました。切片はキシレン代替品で脱脂され、グラデッドエタノールで再水和され、10 mMのシトレートナトリウムバッファー(pH 6.0)で95-98°Cで20分間抗原回収を行いました。内因性過酸化物酵素活性は3%過酸化水素で10分間消滅し、その後室温で5%の正常血清で30分間ブロッキングしました。切片は4°Cで12〜16時間、抗PAK5一次抗体(1:100希釈、 材料表参照)で1晩インキュベートされました。PBS洗浄後、スライドはホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合の二次抗体で室温で30分間培養され、DABで着色が出るまで現像(1〜5分間、過度染色防止のため顕微鏡でモニタリング)し、ヘマトキシリンで30〜60秒間カウンター染色しました。断片は脱水され、マウントされ、明視野顕微鏡の下で画像化されました。染色の強度および陽性細胞の割合は、画像解析ソフトウェアを用いて、各断面に少なくとも5つのランダムフィールド(200×倍率)で定量化しました。定量化方法はHスコアの計算を採用しており、式は次の通りです:Hスコア=∑(染色強度グレード×陽性細胞の割合)(強度は0=陰性、1=弱、2=中程度、3=強さ;パーセンテージは0-25%、26-50%、51-75%、76-100%に分類されます)。信頼性を確保するため、2人の独立した病理医が盲検を行い、観測者間合意のκ値は0.75≥しました。品質管理基準は厳格に実施されました。陽性対照(既知のPAK5陽性ESCC組織)および陰性対照(一次抗体をPBSに置き換えたもの)は検証に合格しなければなりません。背景染色の強度はあらかじめ設定された閾値以下でなければなりません(例:Hスコア<50)。重複バッチ間の染色結果の変動係数(CV)は、実験のばらつきを排除するために<20%でなければなりません。

3. 細胞株と培養

KYSE-150(ヒトESCC)およびHEK-293(ウイルスパッケージング)細胞はショートタンデムリピート(STR)プロファイリングにより認証され、マイコプラズマフリーであることが確認されました。KYSE-150細胞はRPMI-1640培地に胎児用牛血清(FBS)10%およびペニシリン・ストレプトマイシン1%(ペニシリン100 U/mLおよびストレプトマイシン100 μg/mL)を補足して培養しました。HEK-293細胞は同じ添加剤を補足したDMEMで維持されました。細胞は70%〜80%の合流に達した時点で0.25%のトリプシン-EDTAを用いてサブ培養し、各実験の24時間前に適切な密度にシードしました。

4. レンチウイルス媒介者の構築と感染

レンチウイルスベクターは、PAK5(pLV-EF1α-PAK5-PGK-Puro)を過剰発現させるか、PAK5(pLV-U6-shRNA-PAK5-PGK-Puro)を沈黙させるかのいずれかに設計されました。HEK-293細胞は10cmの皿にシードされ、トランスファープラスミドと70%〜80%の合流度でトランスフェクトされ、プラズミド(gag/polおよびrev)、およびエンベローププラスミド(VSV-G)を脂質系トランスフェクション試薬を用いて4:3:1の比率で包装し、合計DNA量は10cm皿あたり約20μgあたりです。培地はトランスフェクション後6〜8時間後に交換されました。ウイルス上清液は48時間と72時間に採取され、500× g で10分間遠心分離して異物を除去し、0.45μmフィルターでろ過し、−80°Cで濃縮または保存されました。 伝達のために、感染の前日にKYSE-150細胞を播種し、感染倍数(MOI)が5〜10のウイルス上清液に曝露し、8 μg/mLのポリブレーンの存在を用いました。MOIは感染単位と標的細胞数の比率として定義されました。GFP計数法またはqPCRを用いたMOI推定の前置実験が行われ、MOIは5〜10と選定されました。培地は12〜16時間後に交換され、非遺伝子質誘導細胞に対して0〜4 μg/mLのプロマイシン濃度を72〜96時間処理し、致死量の最小値を決定することでプルマイシンキルカーブを確立しました。選択用濃度は1-2 μg/mL、維持濃度は0.5-1 μg/mLでした。細胞は48時間後にプロマイシン(1-2 μg/mL)で選択されました。PAK5の過剰発現またはサイレンシングは、RT-qPCRによってPAK5(前方5′-CCAAGACCTATGGTGGGACCC-3′、逆5′-AGGCCGTTGAGGAGGTTTC-3′)およびGAPDH(前方5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′、逆5′-AAAGGGTAACGACGCAACTA-3′)の特異プライマーを用いて検証されました。PAK5の相対的発現は2−ΔΔCt 法を用いて計算されました。すべての実験は少なくとも3つの生物学的複製を用いて実施されました。

5. CCK-8細胞生存能力アッセイ

細胞の生存可能性は、細胞脱水素酵素によるWST-8試薬の還元に基づくCell Counting Kit-8(CCK-8)を用いて評価されました。対数成長中のKYSE-150細胞は、100μLの完全培地中、96ウェルプレートに1,000セルあたり2,000セルのシードを行った。0時間、24時間、48時間、72時間、96時間の各ウェルに10μLのCCK-8試薬(WST-8を含む)が追加されました。37°Cで2時間インキュベーションした後、マイクロプレートリーダーで450nm(A450)での吸収を測定しました。培地のみを含む空洞井戸も含まれていました。各実験群には少なくとも3つの生物学的複製が含まれ、各測定は5つの技術的複製で実施されました。

6. コロニー形成アッセイ

KYSE-150の単細胞懸液は、6ウェルプレートに1,000セルずつシードされ、14日間培養され、培地は2〜3日ごとに交換されました。コロニーは4%のPFAで15分間固定され、20%メタノールに0.1%のクリスタルバイオレットで15分間染色され、水ですすいで空気乾燥させました。50個以上の細胞を含むコロニーは画像解析ソフトで数えられ、コロニー形成率を計算しました。

7. トランスウェル侵入分析

8μmの孔を持つインサートは基底膜マトリックス(1回あたり50μL、希釈1:8)で事前にコーティングされ、37°Cで1時間培養されました。細胞のシーディング前に品質管理が行われ、細胞なしのブランク挿入と化学誘導剤なしの陰の対照挿入物を設置してアッセイの有効性を検証し、基底膜マトリックス層の均一性は目視検査(またはより厳格な制御のための重量測定)で確認されました。細胞は1%のFBS培地で6〜12時間血清不足させ、上部チャンバーに2×10⁵ cell/mL(1回あたり200 μL)を注入しました。下部チャンバーには600μLの培地があり、20%のFBSが化学誘引剤として使われていました。24時間の培養後、上表面の侵入していない細胞を取り除き、下面の侵入細胞は10分間メタノールで固定され、0.1%の結晶バイオレットで15分間染色されました。染色された細胞は明視野顕微鏡で画像化され、1枚の挿入物あたり少なくとも5つのランダム顕微鏡視野(200×倍率)でカウントされました。カウントは主観的なバイアスを避けるため、盲検法で行われました(カウント担当者はグループ割り当てを知らなかったため)。

8. アポトーシスのフローサイトメトリー検出

細胞(浮遊細胞を含む)を採取し、PBSで2回洗浄し、1 ×10 6 cell/mLの結合バッファーに再懸浮させました。アンネキシンV-FITC(5μL)とヨウ化プロピジウム(5μL)を懸濁液100μLに加え、室温で暗闇で15分間培養しました。インキュベーション後、各サンプルに400μLの結合バッファーが追加されました。フローサイトメトリー解析の前には、蛍光のスピローフローを除去するために単一染色対照群(Annexin V-FITC 単染色細胞およびPI単染色細胞)を用いて補償調整を行い、FSC/SSCゲートは細胞残骸や集合体を除く単一細胞を選択するように設定されました。サンプルは488nmレーザーを搭載したフローサイトメーターで1時間以内に分析され、1サンプルあたり少なくとも10,000件のイベントが取得されました。アポトーシー指数はフローサイトメトリー解析ソフトウェアを用いて定量化し、すべてのサンプルに一様なゲート閾値を適用して一貫性を確保し、初期アポトーシー細胞(Annexin V⁺/PI⁻)と後期アポトーシーズ細胞(Annexin V⁺/PI⁺)の割合を別々に報告し、各グループのアポトーシスプロファイルを特徴づけました。

9. RNAシーケンシングとバイオインフォマティクス解析

総RNAを抽出し、純度(A260/280 が1.8から2.1の間で)および完全性(RIN ≥7)を品質管理閾値として評価しました。mRNAはオリゴ(dT)ビーズで精製され、94°Cで5〜7分間断片化され、逆転写されてcDNAに変換されました。ライブラリーはエンド修復、アダプターライゲーション、PCR増幅(8〜12サイクル)で準備され、Illuminaプラットフォーム上でシーケンスされて、サンプルあたり3,000万〜5,000万対の読み取りペアエンド150 bpリードを生成しました。リードはトリミングされ、STARまたはHISAT2を用いてヒト参照ゲノムにアラインメントされました。遺伝子カウントはfeatureCountsで取得され、DESeq2で差分発現解析が行われ、FDR < 0.05および|log2 倍の変化を適用しました。≥ 1.遺伝子オントロジーおよびKEGG経路のためのclusterProfilerを用いた機能豊か解析(Benjamini-Hochberg(BH)補正FDR < 0.05)を用いて、差異発現遺伝子の機能豊富解析を行い、STRINGデータベースを用いてタンパク質間相互作用ネットワークを構築しました。

10. 統計解析

連続データは少なくとも3つの独立した実験からの平均標準差±表されました。2つのグループ間の比較は両側無対t 検定で行われ、3つ以上のグループ間の比較は一方向ANOVAとTukeyの事後検定で行われました。適切な場合には非パラメータ検定が適用されました。生存分布はカプラン・マイヤー解析と対数ランク検定で推定されました。RNA-seqデータについては、ベンジャミニ・ホッホバーグ法を用いて複数検査補正が行われました。正確なp値は図の凡例で報告されます。統計的有意性はp < 0.05で考慮され、*はp < 0.05、**はp < 0.01を示しました。

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結果

PAK5はESCCで高発現しており、予後が悪いと関連しています
図1は、PAK5の臨床検証から機能解析およびトランスクリプトミック解析に至るまでの全体のワークフローを示しており、GAREM1を下流標的として特定しています。PAK5がGAREM1 を介して MAPK経路を調節することでESCCの進行を促進するという仮説を検証するため、ESCC組織におけるPAK5の発現パターンと臨床予後との関連を調べました。まず、遺伝子発現オムニバス(GEO)データベースから得られた遺伝子発現データセットGSE269447を用いて、ESCCと正常組織間の有意に発現に差をつけた遺伝子(DEGs)をスクリーニングしました。その後、ヒートマップと火山プロットが作成されました(図2A、B参照)。ヒートマップを作成し、発現分散が最も大きい上位...

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ディスカッション

本研究は、臨床サンプル、機能的アッセイ、トランスクリプトム解析を組み合わせることで、食道扁平上皮がん(ESCC)の進行におけるPAK5の役割を詳細に検証します。これらの発見は、PAK5のESCCにおける関与の理解を広げ、予後マーカーおよび治療的標的としての潜在力を強調しています。

ESCC組織におけるPAK5の著しい過剰発現と患者の生存率低下との関連は、他のがんの所見と一致しており、そこでPAK5は腫瘍の進行や予後不良と関連しています10,11。PAK5をESCC進行の調節因子として特定することで、本研究はキナーゼ媒介性がんの理解を深め、食道がんにおけるMAPK経路の調節に関する新たな知見を提供します。注目すべきは、PAK5だけがESCCの病因に関与しているPAKファミリーのメンバーではないことです。過去の研究では、この疾患における他のPAKアイソフォームのがん性役割が強調されています。例えば、グル...

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開示事項

著者らは、本論文で報告された研究に影響を与えた可能性のある競合する財政的利害関係や個人的な関係はないと述べています。

謝辞

この研究は中国海南省自然科学基金(助成金番号822QN474)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アネクシンV-FITCアポトーシス検出キットビヨタイム・バイオテクノロジーC1062Sアポトーシス検出染色キット
抗PAK5抗体アブカムAB110069IHCの一次抗体、希釈1:100
自動電気泳動システムアジレント2100バイオアナライザーRNA完全性評価
cDNA合成キットインビトロジェン1896649逆転記キット
結晶バイオレット溶液シグマ・オルドリッチC3886コロニーや侵略用の染料
DMEMメディアGibco(サーモフィッシャー)11965092細胞培養培地
胎児用牛血清(FBS)Gibco(サーモフィッシャー)16000044細胞培養サプリメント
フローサイトメーターBDバイオサイエンスFACSCanto II細胞解析用の機器
GraphPad プリズムGraphPadソフトウェアバージョン8統計解析およびグラフ作成ソフトウェア
H&E染色キットソーラービオG1120ヘマトキシリンとエオシン染色液
HRP結合抗ラットIgGアブカムab150165IHCに対する二次抗体
イルミナ・ノヴァセクシーケンサーイルミナノヴァセク6000ハイスループットシーケンシングプラットフォーム
KYSE-150細胞株理研セルバンクRCB2057ヒト食道扁平上皮癌細胞株
リポフェクタミン3000サーモフィッシャーL3000008トランスフェクション試薬
マイクロプレートリーダーバイオテック・インストゥルメンツELx808吸収度測定装置
DynabeadTM Oligo(dT)25sサーモフィッシャー・サイエンティフィック61005mRNA精製のために
ペニシリン・ストレプトマイシンGibco(サーモフィッシャー)15140122細胞培養用の抗生物質
ヨウ化プロピジウム(PI)シグマ・オルドリッチP4864DNA染色染料
RPMI-1640 ミディアムGibco(サーモフィッシャー)11875093細胞培養培地
分光光度計サーモ・フィッシャーナノドロップ ND-1000RNA濃度と純度測定
SPSSソフトウェアIBMバージョン23統計解析ソフトウェア
トランスウェルインサートコーニング3422細胞侵入アッセイ挿入

参考文献

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PAK5発現予後バイオマーカー治療標的細胞増殖細胞遊走免疫組織化学カプラン＝マイヤー分析mRNAシーケンシング
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