方法論記事

気液界面培養システムを用いたヒト人工多能性幹細胞由来平面毛髪皮膚オルガノイドの作製

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DOI：

10.3791/69088

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2025年10月17日

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1Department of Anatomy and Embryology, Leiden University Medical Center, 2The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Leiden University Medical Center, 3CEA, Inserm, IRIG, UA13 BGE, Biomics, University of Grenoble Alpes

この記事について

サマリー

このプロトコルは、皮膚の構造と機能を複製するために、平面の生理学的に関連する気液界面培養システムを使用して、ヒト人工多能性幹細胞から毛包を含む皮膚オルガノイドを製造する方法を概説します。

要約

毛包を含むヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)由来の皮膚オルガノイド(SO)は、皮膚微小環境内の細胞間相互作用を調査するための高度なin vitroモデルを提供します。当初は、真皮が環境にさらされ、表皮がオルガノイド中心に向かって内側を向く逆嚢胞構成で開発されましたが、その後、SOは、人間の皮膚生理学により近い気液界面(ALI)培養システムで平面構成に転移できます。この原稿は、平面SOに解剖し、ALI培養システムでさらに開発できる嚢胞性SOを生成および選択するための包括的なプロトコルを提示します。このプロトコルには、オルガノイド発生の重要な段階での巨視的定性評価のための定義されたチェックポイントが含まれており、嚢胞性SOを平面皮膚に平坦化するために必要な技術的ステップを詳述し、ALI培養の最適な条件を指定し、分子分析を通じて結果を実証します。27日目に、系統特異的マーカーによる免疫蛍光染色により、毛包や皮脂腺様構造を含む皮膚付属器を伴う多層色素上皮が明らかになりました。このプロトコルは、付属物を有する平面SOを生成するための堅牢な方法を提供し、生理学的に関連するin vitroモデルを提供します。このシステムは、皮膚研究における多様な応用をサポートし、病原体感染、紫外線による組織損傷、薬物反応のモデル化にすでに成功しています。

概要

皮膚は、生物とその環境との間に重要な保護バリアを形成すると同時に、体温、水分バランス、感覚入力も調節します。それは3つの主要な層で構成されています:表皮、角質化された表面を持つ層状ケラチノサイト上皮。真皮は、細胞外マトリックス、線維芽細胞、神経、血管、および免疫細胞が豊富な結合組織です。皮下組織は、主に皮下脂肪細胞で構成されています。人間の皮膚の機能は、毛包 (HF)、皮脂腺、汗腺などの特殊な付属器にも依存します1.

皮膚疾患は、世界中で最も一般的な病状の一つです 2,3。歴史的に、皮膚に焦点を当てた研究のほとんどは、全身的な文脈内で臓器の生理学的複雑さを再現する動物モデル4を使用して実施されてきました。しかし、種間の重大な違い4 と倫理的懸念の高まりにより、生理学的に関連するヒト皮膚モデルの開発が推進されています。

従来のヒト皮膚モデルは、層状ケラチノサイトからなる再構築されたヒト表皮と、コラーゲンマトリックスに埋め込まれた線維芽細胞で構成される下にある真皮コンパートメントを追加で組み込んだ再構築ヒト皮膚の2つのカテゴリーに分類されます5。どちらのモデルタイプも皮膚生理学の理解を大幅に進めましたが、ネイティブの人間の皮膚の完全な構造的忠実度と細胞の多様性が欠けています。これらのモデルの主な制限は、HFなどの皮膚付属器がないため、発毛と再生を伴う皮膚疾患に関連する研究や薬物試験には適さないことです6。HFを組み込んだより高度なシステムが報告されていますが、HF構造と微小環境の複雑さを完全に再現できないか、バイオプリンティングやマイクロモールディングなどの複雑な技術に依存しています7,8,9,10。

これらの課題のいくつかに対処する新しい皮膚モデルは、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)11から生成された皮膚オルガノイド(SO)です。胚発生を模倣して、hiPSCは頭蓋表面の外胚葉および頭蓋神経堤系統に向けられ、人間の皮膚によく似た嚢胞構造に自己組織化することができます。これらのSOには、ほぼすべての非免疫皮膚細胞タイプが含まれており、層状表皮と細胞外マトリックスが豊富な真皮に組織化されています。重要なことに、SOは皮膚付属器であるHFと皮脂腺の発達をサポートします。hiPSCの事実上無制限の拡張性を考えると、SOは高度な遺伝子工学と新しい機能ツールの開発を可能にします。そのため、SO はこの分野における大きな進歩を表しており、発生生物学、疾患モデリング、薬物検査、再生医療への応用が期待されています。

しかし、かなりの制限が残っています:SOは、表皮が真皮嚢胞の内側に位置し、機械的な力から保護され、水性媒体に沈められている逆嚢胞構造を形成します。この構成は生理学的に不正確であるだけでなく、気液界面 (ALI) の確立も妨げます。その結果、嚢胞性 SO は、表皮バリア、機械的力、または直接的な根尖治療を含む研究への応用が限られています。この問題に対処するために、嚢胞性SOを機械的に平らにし、その後ALI条件下で平面皮膚として培養する再現性のある方法を以下に示します。このアプローチは、もともとJungらによって報告され、根尖表皮が空気にさらされるように組織構造を再編成し、それによってさらなる層化とバリア機能を促進します12。得られた平面の毛を生やしたオルガノイドは、人間の皮膚の複雑な構造を保持しながら、生理学的に正確な組織の向きを反映し、頂端表面への実験的アクセスを可能にします。この手順は長く(~100日)、特に嚢胞性SOを平面SOに解剖する場合、技術的に困難なステップがいくつか必要ですが、モデルシステムの生理学的関連性を高めたいと考えているSOまたは他のヒト皮膚同等物をすでに扱っている研究者にとっては特に興味深いかもしれません。

プロトコル

図1 は、ALI培養システムを使用して平面SOを生成するためのワークフローを示しています。最初のセクションでは、Karl R. Koehler11によって開拓された方法論に基づいて、hiPS細胞からの嚢胞性SOの生成を若干変更して概説します(図2)。2番目のセクションでは、前述のようにALI培養システムを使用して嚢胞性SOを平面SOにさらに発達させる手順を詳述します12、変更を加えて(図3)。すべての化学物質と材料は、材料表に記載されています。前述の3つのhiPS細胞株(LUMCi001-A、LUMCi004-A、およびWT2)を使用して、SOを生成しました(https://hpscreg.eu/)13。

1.嚢胞性SOの生成

図2 は、主要なステップで予想される異常な形態を示しています。

  1. 細胞凝集(-2日目)
    1. 標準的な6ウェルプレートでhiPSCを70〜80%のコンフルエンスに達するまで培養します。
    2. 1 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で細胞を洗浄します。1 mLの細胞解離試薬(CDR)を加え、37°Cで5%CO2 で~6分間インキュベートして、hiPS細胞をマトリックスから剥がさずに緩めます(過剰消化を避けます)。
    3. CDRを吸引し、10 μM ROCK阻害剤を含む1 mLのhiPSc維持培地(hiMM)を加えます。P1000ピペットで上下にピペッティングして細胞を穏やかに切り離し、3.5×103 細胞/ mLで細胞懸濁液を調製します。
    4. マルチチャンネルピペットを使用して、100 μLの細胞懸濁液を96ウェルU底の超低付着プレートの各ウェルに分注します。プレートを室温で110× g で6分間遠心分離し、5%CO2で37°Cでインキュベートします。
  2. ROCK阻害剤の希釈(-1日目)
    1. 100 μg/mL の抗生物質 - 抗真菌サプリメント (AAS) を含む hiMM を調製します。
    2. ウェルあたり100 μLを分注し、5%CO2で37°Cでインキュベートします。
  3. 表面外胚葉の誘導(0日目)
    1. 次のステップに進む前に、氷上で適切な量の基底膜マトリックスを解凍します。基底膜マトリックス(2%)、BMP4(2.5 ng/mL)、SB431542(10 μM)、およびbFGF(4 ng / mL)(hiMinM + SFBと呼ばれる)を添加したhiPScミニマル培地(hiMinM)を氷上で調製します。
      注:BMP4濃度は、使用する細胞株に応じて調整する必要がある場合があります(説明を参照)。
    2. ワイドオリフィスP200ピペットチップを使用して、細胞凝集体を2mLの丸底チューブに収集します。
      注意: 市販のワイドオリフィスチップを使用してください。骨材への損傷を最小限に抑えるために、内径が少なくとも 2 mm のオリフィスを選択してください。または、赤外線ループ滅菌器でメスを加熱し、それを使用して従来のピペットチップから広いオリフィスを作成します。
    3. 骨材がチューブの底に沈殿するのを待ちます。培地を慎重に吸引し、2 mLのhiMinMを加えて凝集体を洗浄します。合計3回洗浄を繰り返します。
    4. ワイドオリフィスP1000ピペットチップを使用して、冷たいhiMinM + SFBの細胞凝集体を予冷された6ウェルプレートのウェルに移します。次に、100 μLのhiMinM + SFBの各凝集体を、ワイドオリフィスP200ピペットチップを使用して96ウェルU底超低付着プレートに移します。プレートを5%CO2で37°Cのインキュベーターに戻します。
      注:このステップでは、層流(LAF)フードの下に置かれた実体顕微鏡を使用してください。
  4. 非上皮細胞集団の誘導(3日目)
    1. LDN193189(1 μM)、bFGF(250 ng/mL)、およびAAS(100 μg/mL)を含むhiMinMを調製します。マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルに25 μLを分注します。
    2. プレートを軽くかき混ぜて、培地が均一に分布するようにします。プレートを5%CO2で37°Cのインキュベーターに戻します。
  5. 栄養素の供給(6日目)
    1. AAS(100 μg/mL)を含むhiMinMを調製します。マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルに75 μLを分注します。
    2. プレートを軽くかき混ぜて、培地が均一に分布するようにします。プレートを5%CO2で37°Cのインキュベーターに戻します。
  6. 中程度のリフレッシュメント(8日目と10日目)
    1. AAS(100 μg/mL)を含むhiMinMを調製します。マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルから100 μLの培地を慎重に取り除きます。マルチチャンネルピペットを使用して、100 μLの新鮮な培地を各ウェルに分注します。
    2. プレートを軽くかき混ぜて、培地が均一に分布するようにします。プレートを5%CO2で37°Cのインキュベーターに戻します。
  7. 低付着24ウェルプレートへの移行(12日目)
    1. 次のステップに進む前に、氷上で適切な量の基底膜マトリックスを解凍します。アドバンスト培地(49%v/v)、神経基礎培地(49%v/v)、グルタミンサプリメント(1x)、ビタミンAを除いたB-27サプリメント(0.5x)、N2サプリメント(0.5x)、2-メルカプトエタノール(0.1 mM)、およびAAS(100 μg/mL)を使用して、オルガノイド成熟培地(OMM)を調製します。1%基底膜マトリックス(OMM1%M)を含む適切な量のコールドOMMを調製し、氷上に置いておく。
      注意: 2-メルカプトエタノールを操作するときは、個人用保護具を使用し、換気の良い場所で作業してください。
    2. ワイドオリフィスP1000ピペットチップを使用して、細胞凝集体を2 mLの丸底チューブに収集します。
    3. 骨材がチューブの底に沈殿するのを待ちます。培地を慎重に吸引します。1.5 mLのアドバンスト培地を加えて凝集体を洗浄します。合計3回洗浄を繰り返します。
    4. ワイドオリフィスP1000ピペットチップを使用して、コールドOMM1%Mの細胞凝集体を予冷した6ウェルプレートのウェルに移します。次に、500 μLのOMM1%Mの各凝集体を、ワイドオリフィスP1000ピペットチップを使用して24ウェルの低付着プレートに移します。プレートを5%CO2で37°Cのインキュベーターに戻します。
      注:このステップでは、LAFフードの下に置かれた実体顕微鏡を使用してください。
  8. ミディアムリフレッシュメント(15日目)
    1. 次のステップに進む前に、氷上で適切な量の基底膜マトリックスを解凍します。適切な量の冷たいOMM1%Mを準備します。氷の上に置いてください。
    2. P1000チップを使用して、各ウェルから250 μLの培地を慎重に取り出します。次に、250 μLのOMM1%Mを各ウェルに加えます。プレートを37°Cのインキュベーターに戻し、65 rpmに設定されたオービタルシェーカーで5%CO2 を置きます。
  9. 18日目から45日目の間に、月曜日、水曜日、金曜日にOMMで半培地交換(250 μL)を実行します。
  10. 45日目から90日目の間に、月曜日と水曜日にOMMで半培地交換(250 μL)を実行し、金曜日に完全な培地交換を行います。

2. 嚢胞性SOから平面SOへの移行

注:嚢胞性SOは、表皮がオルガノイドの中心に向かって内側を向いており、真皮が外部環境と接触している逆さまの形態を示します。70日目から90日目の間に、細胞株と分化効率に応じて、表皮の初期基底上分化が十分に進み、ヘアペグが発達します。これは、嚢胞性SOがALI培養システムに移行して、ネイティブの人間の皮膚により近い組織を得る段階です。

  1. 平面 SO への移行のための 70 日目から 90 日目までの嚢胞性 SO の選択
    1. 直径が少なくとも5 mmで、副産物含有量が最小限の嚢胞性SO(嚢胞の一極に蓄積し、軟骨も含む可能性のある間葉系細胞)を選択します。皮膚オルガノイドの発達の品質指標として、毛のプラコード/ペグの存在を使用します(図1A および 図2B)。
      注:サイズに応じて、各嚢胞性SOから2〜4個の平面SOを平らにします。
  2. コラーゲンコーティングインサート(12ウェルフォーマット)の調製
    1. 適量のNaOHペレットを蒸留水に溶かしてNaOH溶液(1M)を調製します。0.2 μmの孔径のメンブレンフィルターを使用してNaOH溶液をフィルター滅菌します。
      注意: NaOH溶液(1 M)を操作するときは、個人用保護具を使用し、換気の良い場所で作業してください。
    2. 氷上で、10x PBS(最終濃度1倍)、NaOH(5 mM)、および蒸留水を使用して、I型コラーゲン溶液を最終濃度2 mg / mLに希釈し、最終容量を調整します。150 μLのコラーゲン溶液を、標準的な12ウェルプレートに配置された各インサートに分配します。プレートを37°Cで30分間インキュベートし、コラーゲンゲルを重合させます。
  3. 嚢胞性SOの平坦化(図3)
    注:このステップでは、LAFフードの下に置かれた実体顕微鏡を使用してください。
    1. 選択した嚢胞性SOを少量の培地とともに、ワイドオリフィスP1000ピペットを使用して10 cmのペトリ皿の蓋に置きます。滅菌メスを使用してSOの副産物を慎重に切除します。反対側に滅菌鉗子を使用して、切除中にオルガノイドを安定させます(図3A)。
      注:この段階では、嚢胞性SOは、2つの皮膚層が上下に配置された収縮した風船に似ています。
    2. メスを使用して、最初の切開に隣接するオルガノイドの端から約1 mmを切除します(図3B、F)。滅菌鉗子を使用して皮膚の上層をそっと広げます(図3C、G)。
    3. ティッシュをサイズに応じて2〜4個に切ります。各組織片を繊細に移し、滅菌鉗子を使用して表皮を上に向けてコラーゲンでコーティングされたインサートに配置します(図3D、H)。
      注:実体顕微鏡でペグを評価して、表皮の向きが正しいことを確認します。
    4. インサートを600 μLのOMMを含む標準的な12ウェルプレートに戻します。プレートを5%CO2 で37°Cのインキュベーターに戻します(図3E)。
  4. 長期間の気液界面培養メンテナンス
    1. 平坦化後 1 日目から 21 日目の間に、月曜日、水曜日、金曜日に OMM で完全な培地交換 (600 μL) を実行します。プレートをインキュベーターに戻し、37°C、5%CO2 、95%相対湿度で配置します。
    2. 平坦化後21日目から27日目の間に、プレートを湿度のない5%CO2 の37°Cのインキュベーターに入れ、皮膚バリアを強化します。OMMで毎日完全な培地交換(800 μL)を実行します。

結果

嚢胞性SOの生成のための最適化とチェックポイントは、広く説明されています14。したがって、ここで提示する方法は、嚢胞性オルガノイドの開発中に評価する重要なチェックポイント(図2A)、平面SOへの移行に適したものの選択(図2B)、および結果として得られる平面SOの品質を評価するために使用される基準(図1B-Dおよび図4)。

嚢胞性SOの発生における最初の重要なステップは、0日目にウェル内に存在する細胞の大部分を組み込んだ単一の高密度細胞凝集体の形成です(図2A)。これは、hiPS細胞の慎重かつ迅速な取り扱いと効率的な遠心分離を組み合わせることによって達成され、その結果、ウェルの中心に細胞が均一に分布します(図2A、-2日目)。表面外胚葉の適切な誘導は、3日目までに凝集体の最外層に薄くて透明な上皮を形成し(図2A)、その後、間葉系細胞誘導に続いて、8日目までに間葉系細胞の暗いコアを含む透明な嚢胞性凝集体に発達します。12日目から20日目の間に、上皮嚢胞は嚢胞の一極に蓄積する間葉系細胞の薄い層で覆われます(図2A、12日目)。上皮細胞と間葉系細胞の共誘導に成功すると、最終的には層状上皮が生じ、50日目から80日目の間に見えるようになる毛毛プラコードとペグの形成が可能になります(図2A、B)。これらの発生チェックポイントに基づいて適切なSOを選択することにより、平面SOへの移行時の形態学的およびサイズのばらつきを最小限に抑えることができます。

毛毛プラコードまたはペグの存在は、平面 SO へのさらなる発達のために嚢胞性 SO を選択するための主要な包含基準です。目に見えるプラコードの欠如は、通常、表皮層化の欠陥に起因し、非常に薄く見えます(図2B、50日目、中央のパネル)。平坦化には、副産物が1極に集中し、全体的に最小限の副産物を持つ大きな嚢胞(直径5 mm以上)のみが使用され、分極されていない副産物を持つ嚢胞は除外されます(図2B)。

平面構成に入ると、SOの一次品質チェックは、実体顕微鏡下でのHF成長の巨視的モニタリングに依存します。HFはALI培養の27日間を通じて徐々に伸長し、皮脂腺は14日目頃に見えるようになり、色素沈着は時間の経過とともに徐々に増加します(図1B、C)。薄いコラーゲンゲルのすぐ下にあるインサート膜によって課せられる空間的制約により、平面SOの周辺にあるHFのみが完全に成長でき、インサートと平行な方向で成長します(図1C)。特に、毛幹が皮膚の表面から突き出ることはめったにありません。開発された平面SOの品質をさらに評価するために、それらをパラフィンまたはOCTに包埋し、切片化し、染色して、その組成と形態を調べることができます。H&E染色は、それらの構造が人間の皮膚の構造に非常に似ていることを明らかにし(図4A)、完全に成層された上皮と真皮が基底膜によって分離されています。さまざまな表皮層、皮脂腺、およびメラノサイトの特定のマーカーを使用した免疫蛍光染色は、平面SOのヒト皮膚様組織構造をさらに確認します(図1D および 図4B)。

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図1:ALI培養システムを使用してhiPS細胞からHFを含む平面SOを生成するためのワークフロー。 主要なステップの概略図と代表的な画像が表示されます。 (A) 嚢胞性SOの生成は、基本的に前述の10で、目に見える毛のプラコード/ペグが80日目頃に形成されるまで。 (B) 嚢胞性SOは、I型コラーゲンでコーティングされた細胞培養インサートで、表皮側を上に向けて切開して平らにします。ALI培養は、加湿条件下で21日間維持され、その後乾燥条件下で6日間維持されます。 (C) 毛包の成長、皮脂腺様構造の発達(矢じり)、および時間の経過に伴う進行性色素沈着を示す、(B)に示されている領域の高倍率ビュー。 (D) 平坦化後27日目の平面SO切片の共焦点画像で、皮脂腺様構造をマークするナイルレッド、またはメラノサイトを染色する抗PMEL抗体のいずれかとともに抗IV型コラーゲン抗体で標識された。核はDAPIで対比染色されます。スケールバー:200 μm (A);500 μm (B、C);50 μm (D)。略語:SOs=皮膚オルガノイド;HF = 毛包;hiPS細胞=ヒト人工多能性幹細胞。ALI = 気液界面;Col IV = IV 型コラーゲン。PMEL =プレメラナソームタンパク質;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:SO産生中の主要なステップにおける細胞凝集体形態の代表的な画像。(A) さまざまな段階で適切な(左のパネル)および不十分な(中央および右 のパネル)形態を持つ嚢胞性SOの代表的な画像。-2日目に、細胞凝集体は均一な分布を示すはずです が(左のパネル )、遠心分離後のプレートの不適切な取り扱いは細胞分布を混乱させる可能性があります( 右のパネル)。0日目に、整形された凝集体はコンパクトで密な細胞クラスターとして現れますが (左のパネル)、細胞生存率が低いと、広範囲にわたる細胞死とコンパクトな3D構造の喪失 (右のパネル)が発生します。3日目に、明確な外側の上皮層が見えるようになり (左のパネル)、 それがないことは、BMP4濃度の最適化が必要であることを示している可能性があります (右のパネル)。12日目に、間葉系細胞は1つの極に蓄積し、上皮嚢胞を包み込むために移動 します(左のパネル)が、過剰な上皮(中央のパネル)または間葉系(右のパネル)の分化は、適切な上皮層別化を妨げます。50日目に、SOは双極性形態を示し、片側に嚢胞性皮膚、もう片側に主に軟骨の副産物があります (左パネル)。過剰な上皮(中央パネル)または間葉系(右側のパネル)の分化は、適切な皮膚の発達を妨げます。 (B) 80日目頃にヘアペグが見える嚢胞性SOの代表的な画像。皮膚に対する副産物の比率(破線の左側)の可変性に注目してください。左端の3つのパネルは2〜4個の平面SOを生成できますが、右端のパネルはフラット化するには品質が不十分なSOを示しています。スケールバー: -2 日目、50 日目、および 80 日目は 500 μm。0日目、3日目、12日目は200μm。略語:SO =皮膚オルガノイド。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:平面SOを製造するための技術的なステップの概略図。 LAFフード内の実体顕微鏡下で嚢胞性SOの平坦化を行います。 (A) 滅菌メスを使用して、嚢胞性SOから副産物が蓄積した極を切除します。 (B) 組織の展開を容易にするために、SOの上肢と下肢をトリミングします。 (C) 平面組織を2〜4個に切ります。滅菌鉗子を使用して、表皮面を上にして各部分をコラーゲンでコーティングされたインサートに移し、平らにします。 (D) 平らにした組織を含む培養インサートを、600 μLの培地を含む標準的な12ウェルプレートに入れます。 (E) プレートを37°Cで5%CO2でインキュベートします。 (F) (B)に示されている皮膚オルガノイドの概略的な横方向図。(G) (C)に示されている皮膚オルガノイドの概略的な横方向図。(H) 600 μLの培地を含む12ウェルプレートに配置された細胞培養インサートに注がれたI型コラーゲンゲル上に配置された平面SOの画像。略語:SO =皮膚オルガノイド;LAF = 層流。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:hiPSC由来の平面SOの特性評価。(A) 平坦化後1日目と27日目のH&E染色平面SOの代表的な明視野画像。27日目までに、平面SOは、多層化した表皮と皮脂腺様構造(矢じり)を含むHFを伴う皮膚の成熟を示します。 (B) 抗β4インテグリンおよび抗ケラチン10または抗ロリクリン抗体のいずれかで染色された平面SO切片の共焦点画像は、1日目に早期基底上分化(KRT10+ 細胞)と27日目に後期分化(LOR+ 層)を示します。核はDAPIで対比染色されます。スケールバー:50 μm (A);100 μm (B)。 略語:SO =皮膚オルガノイド;hiPSC = ヒト人工多能性幹細胞;H&E =ヘマトキシリンとエオシン;β4 = b4インテグリン;KRT10 = ケラチン 10;LOR =ロリクリン;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、組織の平坦化と頂端表皮の空気への曝露を通じて、本来の組織の向きと環境を回復することにより、嚢胞性SOシステムの重要な制限を克服します。この方法は、オルガノイドの固有の細胞および構造の複雑さを維持し、生理学的に関連する組織を促進し、実験操作のために多層化した表皮表面への直接アクセスを提供します。

プロトコルのいくつかのステップは、高品質の嚢胞性SOの生成から始まる、高品質の平面SOを達成するために重要です。主要な品質管理チェックと潜在的なプロトコル変更ポイントは、12 以前に広範囲に説明されています。簡単に言えば、出発点は、70〜80%のコンフルエンスで十分に維持された未分化のhiPS細胞培養であり、高い核対細胞質比で密に詰まった細胞を示す必要があります。嚢胞性SOの生成には表面外胚葉誘導中のBMP4シグナル伝達の正確な調節が必要12BMP4 感度は hiPSC ラインによって異なる可能性があるため、最適な結果を得るには滴定が必要になる場合があります。BMP4濃度を2.5〜15 ng / mLの間でテストすることは、この範囲外で成功したケースが報告されていないため、推奨されます。試薬源の一貫性も重要です。したがって、単一のサプライヤーからのバルク在庫は、完全な生物学的活性を確保し、ばらつきを最小限に抑えるために、推奨条件で準備および保管し、有効期限までに使用する必要があります。

SOの平坦化を成功させるには、適切な形態とサイズを持つ嚢胞性SOを選択することが重要です。嚢胞性SOの成熟、ひいてはペグと毛髪プラコードの形成は、hiPS細胞株によって異なる可能性があるため、平坦化のタイミングは70日目から90日目の範囲になります。増殖を促進し、神経堤の移動を阻害することにより、オルガノイドのサイズを増加させ、軟骨形成を減少させることが示されているため、嚢胞性SO形成の3日目にGSK3阻害剤およびWNTシグナル伝達アゴニストであるCHIR99021を追加することは考慮できます12。有望ではありますが、私たちの培養物ではこの変更で一元した結果は観察されていません。

平坦化プロセスには、手先の器用さと組織への精通が必要です。特に、皮膚片をコーティングされたインサートに移す際には、組織の向きが正しいように注意する必要があります。実体顕微鏡下で細い鉗子を使用して向きを確認し、頂端側が上を向くまで組織を穏やかに調整することをお勧めします。適切に配置すると、ペグ/ヘアプラコードは下を向く必要があります。平面SOをALI培養に移した後、HFは通常、数日以内に顕著な成長と毛幹色素沈着を示し始めます。

説明されているモデルの主な制限は、必要な時間と高レベルのメンテナンス、およびモデルの未熟さです。ヘアペグに恵まれた嚢胞性SOの発生には70〜90日かかり、その後4週間のALI培養が続きます。この長いタイムラインは、面倒な平坦化手順と相まって、特に市販の人間の皮膚に相当するものと比較して、このシステムはハイスループットアプリケーションにはあまり適していません。マイナーな最適化により培養時間がわずかに短縮される可能性がありますが、大幅に短縮される可能性は低いです。皮膚の高い細胞および構造の多様性は、上皮間葉系相互作用と機械的手がかりの複雑なシーケンスに依存しており、これはおそらくin vitroで外因性因子を追加することによって加速することはできません15,16,17,18。嚢胞性SOの形成と平面型への進行には、高レベルのメンテナンスが必要です。嚢胞培養の最初の18日間を除いて、最も取り扱い集中的な期間の1つは、平面SOが低湿度雰囲気に維持され、毎日の培地補充が必要なときに発生します。他のhiPSC由来モデルと同様に、SOはin vitroで胎児様表現型を保持します。さらに、SO14には汗腺と毛様起立筋がほとんど存在しませんが、これはおそらく血管新生、免疫細胞、およびせん断応力、伸張、摩擦などの機械的力の欠如によるものであり、これらはすべて適切な成熟に不可欠です15,16,17,18,19.これらの制限の一部は、モデルの複雑さを高めることで対処できます。自家hiPS細胞由来マクロファージ17との共培養、灌流システム9の統合9、または機械的ストレッチ17の適用は、モデルの成熟度20,21を促進するのに役立つ可能性があります。

トランスウェルインサート形式は、平面SOにおけるHFの下方成長をいくらか制限することに注意する必要があります。その結果、HFは横方向に広がる傾向があり、空気にさらされる可能性があります。HFは通常、 in vivoで皮膚内で保護されているため、実験を設計する際にはこれを考慮する必要があります。より厚いハイドロゲル層を塗布してインサートコーティングを変更すると、この問題を軽減できる場合があります。さらに、このモデルでは、毛幹が皮膚表面から突き出ていることはめったにありません。私たちの観察は、平面SOのHFがALI培養の27日目まで、活発な成長期である成長期にとどまることを示しています。ヒト心不全の成長期の期間が長いことを考えると、これはまったく予想外ではありません。長期培養は最終的に相転移をサポートする可能性がありますが、全身的な手がかりがない場合、これはありそうにありません。卵胞周期に必要な分子シグナルを特定して補うことで、退行期と休止期の人工誘導が可能になる可能性があります。

要約すると、平面SOを生成するプロトコルは、嚢胞性SOでは実現不可能または関連性のない幅広い実験的アプローチを可能にします。平面SOは、細菌11およびウイルス感染22、紫外線誘発組織損傷22、および関連する薬物応答12,22,23のモデル化にすでに成功しています。生理学的に関連性のある複雑な皮膚等価物の頂端表面にアクセスできることは、この分野の大幅な進歩を表し、皮膚研究におけるさまざまな新しい応用への扉を開きます。

開示事項

著者には宣言すべき利益相反はありません。

謝辞

ライデン大学医療センターのhiPSCホテルの同僚がhiPS細胞ラインを提供してくれたことに感謝します。この研究は、デンマークのノボ ノルディスク財団 (助成金番号 NNF21CC0073729) が K.R. KR に支援するノボ ノルディスク財団幹細胞医学センターによって支援されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
高度なDMEM/F12サーモフィッシャー・サイエンティフィック#12634010本文では「上級メディア」と呼ばれています。
ALK5、内装。TGFbタイプ1、SB431542トクリス・バイオサイエンス#1614アリコート、-20度に保管;C  4度に保つ;最大7日間のC 
抗CD104ラットモノクローナルクローンの抗体439-9B抗体BDバイオサイエンス#555719NA
抗コラーゲンタイプIVポリクローナル抗体メルク・ミリポア#Ab769NA
抗サイトケラチン10ウサギ多クローナル抗体バイオレジェンド#905401NA
抗ロリクリンウサギポリクローナル抗体バイオレジェンド#905101NA
抗PMELマウスモノクローナル抗体ノバス・バイオロジカルズ#NBP2-29407 NA
ビタミンAなしのB-27サプリメントサーモフィッシャー・サイエンティフィック#12587010アリコート、-20度に保管;注記;
細胞培養挿入グライナー・バイオワン#66564112井戸、孔径0.4 &マイクロ;m;透明(48個のインサート/ボックス);https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/3d-cell-culture/thincert/3d-thincert-cell-culture-inserts/665641.html
コラーゲンタイプIはコーニング#354249ストック溶液は4度に保ち、C
使い捨てメス 滅菌 0507 No. 21スワン・モートン#0507NA
ダルベッコリン酸塩緩衝生理食塩水(DPBS)サーモフィッシャー・サイエンティフィック#14190094NA
エッセンシャル6(E6)メディアンサーモフィッシャー・サイエンティフィック#A1516401hiPSC最小媒質(hiMinM)と呼ばれ、本文に。
ファスディルLCラボ#F-46601000倍のストック溶液を分割して、-20 & Cで保存します。解凍したら4度の温度で保ちます。最大14日間のC 
穏やかな細胞解離 試薬幹細胞技術#100-0485NA
グルタMAXサプリメントサーモフィッシャー・サイエンティフィック#35050038NA
ヒトFGF-2の基本プレニウムグレードミルテニ・バイオテック#130-093-842アリコート、-80度で保存;C  4度に保つ;最大7日間のC 
LDN 193189ジヒドロ塩酸塩トクリス#6053アリコート、光感度、-20度で保存;注記;
マトリジェル成長因子低減基底膜マトリックスコーニング#354230アリコート、-20度に保管;C  4度に保つ;最大7日間のC 
2-メルカプトエタノールサーモフィッシャー・サイエンティフィック#21985023有害物質、有害、腐食性、刺激性、健康および環境上の危険性があります。
ナオメルク#567530-250MG有害物質で、腐食性があり刺激性があります。即席で解決策を準備しましょう。
神経基底培地サーモフィッシャー・サイエンティフィック#21103049神経基礎媒体と呼ばれ、本文に。
ノルモシン 50 mg/mlインビボジェン#ant-nr-1検査では抗生物質-抗菌サプリメントと呼ばれています。アリコート、-20度に保管;C  4度に保つ;最大14日間のC 
ヌンクロン・スフェラ96ウェルU底マイクロプレートサーモフィッシャー・サイエンティフィック#174929NA
Nunclon Sphera 174930 24ウェルマルチディッシュサーモフィッシャー・サイエンティフィック#174930NA
N2補足サーモフィッシャー・サイエンティフィック#17502048アリコート、ストアは-20度に。注記;
軌道シェーカーサーモフィッシャー・サイエンティフィック#88881102NA
ペニシリン・ストレプトマイシンサーモフィッシャー・サイエンティフィック#15070063NA
組換えヒトBMP4タンパク質R&Dシステムズ#314-BP-010アリコート、-80度で保存;C  4度に保つ;最大7日間のC 
StemFlex(SF)メディアサーモフィッシャー・サイエンティフィック#A3349401hiPSCメンテナンス培地(hiMM)と呼ばれ、本文に。
SteriMax smart - 赤外線ループ滅菌装置WLD-TEC#4.002.000 随意
ピンセットメルク#T4537-1EAスタイル5;細かい針のように鋭く、耐磁性ステンレス鋼
ビトロネクチン幹細胞技術#07180NA

参考文献

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