SegElegansを用いたC .エレガンス 蛍光画像の自動解析

サマリー

ここでは、広視野顕微鏡画像内の個々のワームを自動セグメンテーションするために開発した深層学習システムであるSegElegansを、その後ImageJなどの画像解析ソフトウェアで使用するために効果的に活用する方法を説明します。オンラインとオフラインの両方でシステムの利用方法を提供します。

要約

顕微鏡、特に蛍光種類の顕微鏡は、 線虫 の研究で頻繁に使用されるツールです。ただし、顕微鏡実験からのデータの分析は非常に面倒で時間がかかる場合があります。したがって、自動化が望ましいです。私たちは、多数の個体が接触したり重なったりする画像であっても、ワームの自動セグメンテーションのために特別に設計された、2頭のU-netベースの畳み込みニューラルネットワークシステムであるSegElegansを開発しました。SegElegans の最初の部分は、1 つのエンコーダーと 2 つのデコーダーで構成されています。SmaAt ATモデルに基づくエンコーダーは、2つの畳み込み層とそれに続く畳み込みブロックアテンションモジュール(CBAM)を適用します。どちらのデコーダーも畳み込みLSTMを使用し、1つはワーム画像(本体、エッジ、背景、またはオーバーラップ)のセマンティックセグメンテーションを実行し、もう1つは各ワームに沿って線形スケルトンを抽出します。2 番目の部分は、2 つのデコーダーの出力を組み合わせ、それらを使用して正確なインスタンス セグメンテーションを生成する後処理アルゴリズムです。これらのセグメンテーションは、ImageJまたはその他の適切な画像解析ツールに供給できます。ここでは、このシステムにアクセスして実行する方法について説明します。オンラインのクラウドコンピューティングベースの実装と、必要なハードウェアが利用可能な場合、ローカルマシンでSegElegansモデルをオフラインで使用する2つの方法を提供します。

概要

Caenorhabditis elegansは、細胞生物学および分子生物学の分野で広く使用されている真核生物のモデル生物です^1,2,3。これは、ライフサイクルが速く(~3週間)、多数の子孫(通常、自家受精雌雄同体の親と遺伝的に同一)を持つ小型(野生型成虫の場合は~1 mm)土壌生活線虫です。その比較的単純さにもかかわらず、動物は依然として明確で明確な組織と器官を持つ複雑な多細胞生物であり、その小さなサイズと透明性のおかげで、固定やその他の侵襲的治療を必要とせずにin vivoで研究^{することができます4。}顕微鏡によるin vivo研究のためのワームの能力は、個々の細胞の容易な区別、またはミトコンドリア、脂質滴、またはタンパク質凝集体などの細胞内細胞小器官/成分の直接視覚化、およびシグナル伝達、遺伝子発現、小胞融合などのプロセスの直接視覚化を可能にする蛍光レポーターの使用によってさらに増幅することができます。 オートファジー、ニューロンおよび筋肉の活動電位など5,6,7,8,9,10,11。

プロトコル

次のセクションには、SegElegansを効果的に使用する方法に関する詳細な手順が含まれています(図2)。これには、準備画像取得(セクション1)、モデルをオンライン(セクション2)またはオフラインで実行する方法(セクション3-5)、およびImageJまたはその他のツールへのROIのインポート(セクション6)に関する手順が含まれます。モデルによる画像の評価には、少なくとも6GB(理想的にはそれ以上)のビデオランダムアクセスメモリ(VRAM)を搭載したCUDA互換のグラフィックスプロセッシングユニット(GPU)を搭載したPCが必要なため、ほとんどのユーザー(Googleのサービスにアクセスできる場合)は、クラウドコンピューティングを通じてこれらのハードウェア要件を満たし、それを超えるモデルのオンラインバージョンを利用することをお勧めします(セクション1>セクション2>セクション6)。あるいは、適切に強力なハードウェアにアクセスでき、コマンドライン/端末の使用に関する基本的な理解があるユーザー(または前述のクラウドコンピューティングオプションにアクセスできないユーザー)は、モデルをローカルで実行する方が便利であると感じるかもしれません(セクション1>セクション3>セクション4または5>セクション6)。

1. サンプル画像とガイド画像の取得

結果

このプロトコルに従うことで、研究者は、目に見えるワームの境界のない蛍光画像の分析でも、高品質のワームセグメンテーションを抽出できるはずです。プロトコルのセクション6で説明したように、これらのセグメンテーションはImageJに直接インポートし、蛍光レポーターの強度(発現定量に一般的に使用される)や蛍光タグ付き領域の数、サイズ、形態(タンパク質凝集体または細胞小器官の研究に頻繁に使用される)などの関連特性の迅速な測定に使用できます。さらに、SegElegansは、蛍光に依存しない方法で明視野画像からセグメンテーションを取得するように設計されているため、強度比の測定(たとえば、特定の細胞小器官のオートファジー分解を定量化するため)や共局在指標(細胞小器官間の相互作用を特定しようとする場合など)を含むマルチチャネル分析も支援できます。

SegElegansは、93%以上のセグメンテーションIoU(Intersection over Union)スコア(表1)を達成し、

ディスカッション

ここで紹介する方法論により、ユーザーは精度を損なうことなく、大幅に速い時間枠でC.エレガンス顕微鏡実験を分析できるはずです。実際の蛍光とは無関係に明視野ガイド画像からセグメンテーションを抽出するため(プロトコルセクション1で説明されているように)、ワームごとに表現型を測定する必要があるあらゆる株およびアプリケーションに使用できます。これらには、疾患モデル¹⁰における異常なタンパク質封入体の形成の定量化(図2に示す例のように)、転写レポー^ター26の活性、または脂質液滴のサイズおよび数⁴⁴などの単一チャネルアプリケーションが含まれ得る。また、レシオメトリック^{センサー27}による過酸化水素レベルの測定、細胞小器官およびタンパク質の共局在化の評価¹¹、高分子修飾の検出.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
インターネット接続可能なコンピュータ(例:Dell Vostro Desktop)	いくつか(例えばDellなど)	-	これにより、推奨されているクラウドコンピューティング経由でオンライン上でSegElegansを運用し、ImageJなどの画像解析ソフトウェアを使用できるようになります。
CUDA互換グラフィックス処理ユニット(CVP)で、少なくとも6GBのVRAM(例:MSI Geforce RTX RTX3050 Ventus 2X 6GB)(オプション)	NVIDIA + 複数のメーカー(例えばMicro Star International)	https://developer.nvidia.com/cuda-gpus	これにより、ローカルマシン上でSegElegansをオフラインで実行できるようになります。 CUDA対応GPUチップセットはこちらで入手可能です: https://developer.nvidia.com/cuda-gpus VRAMは、メーカーがチップセットをGPUに実際に実装するかどうかに依存します。 警告:クラウドコンピューティング版の性能に匹敵するには、最低要件(16+ GB VRAM)を大幅に超える高価で高性能なCUDAカードが必要です。
エピ蛍光顕微鏡(Invitrogen EVOS FL Auto 2)	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	AMAFD2000 例えば	明るい視野と1つ以上の蛍光チャネルからほぼ同時に画像を自動的に取得できるシステムの使用を推奨します。
ImageJ(任意)	NIH	https://imagej.net/software/fiji/downloads	フィジー版の配布をおすすめします。こちらで入手可能です: https://imagej.net/software/fiji/downloads
NVIDIA GPU対応のPC(例:Dell Vostro Desktop)(オプション)	いくつか(例えばDellなど)	-	これは、ローカルマシン上でオフラインでSegElegansを動かすためにGPUと連携して必要です。 GPUは、マザーボードに適切なPCIスロットを備えたWindows互換ハードウェア、カードを収めるスペース、十分なパワーサプライが必要です。
セゲレガン	-	https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0	詳細は原稿を参照してください。nbsp;