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方法論記事

SegElegansを用いたC .エレガンス 蛍光画像の自動解析

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DOI:

10.3791/69094

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2025年10月10日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology-Hellas, 3Instituto de Automática e Informática Industrial, Universitat Politècnica de València

この記事について

サマリー

ここでは、広視野顕微鏡画像内の個々のワームを自動セグメンテーションするために開発した深層学習システムであるSegElegansを、その後ImageJなどの画像解析ソフトウェアで使用するために効果的に活用する方法を説明します。オンラインとオフラインの両方でシステムの利用方法を提供します。

要約

顕微鏡、特に蛍光種類の顕微鏡は、 線虫 の研究で頻繁に使用されるツールです。ただし、顕微鏡実験からのデータの分析は非常に面倒で時間がかかる場合があります。したがって、自動化が望ましいです。私たちは、多数の個体が接触したり重なったりする画像であっても、ワームの自動セグメンテーションのために特別に設計された、2頭のU-netベースの畳み込みニューラルネットワークシステムであるSegElegansを開発しました。SegElegans の最初の部分は、1 つのエンコーダーと 2 つのデコーダーで構成されています。SmaAt ATモデルに基づくエンコーダーは、2つの畳み込み層とそれに続く畳み込みブロックアテンションモジュール(CBAM)を適用します。どちらのデコーダーも畳み込みLSTMを使用し、1つはワーム画像(本体、エッジ、背景、またはオーバーラップ)のセマンティックセグメンテーションを実行し、もう1つは各ワームに沿って線形スケルトンを抽出します。2 番目の部分は、2 つのデコーダーの出力を組み合わせ、それらを使用して正確なインスタンス セグメンテーションを生成する後処理アルゴリズムです。これらのセグメンテーションは、ImageJまたはその他の適切な画像解析ツールに供給できます。ここでは、このシステムにアクセスして実行する方法について説明します。オンラインのクラウドコンピューティングベースの実装と、必要なハードウェアが利用可能な場合、ローカルマシンでSegElegansモデルをオフラインで使用する2つの方法を提供します。

概要

Caenorhabditis elegansは、細胞生物学および分子生物学の分野で広く使用されている真核生物のモデル生物です1,2,3。これは、ライフサイクルが速く(~3週間)、多数の子孫(通常、自家受精雌雄同体の親と遺伝的に同一)を持つ小型(野生型成虫の場合は~1 mm)土壌生活線虫です。その比較的単純さにもかかわらず、動物は依然として明確で明確な組織と器官を持つ複雑な多細胞生物であり、その小さなサイズと透明性のおかげで、固定やその他の侵襲的治療を必要とせずにin vivoで研究することができます4。顕微鏡によるin vivo研究のためのワームの能力は、個々の細胞の容易な区別、またはミトコンドリア、脂質滴、またはタンパク質凝集体などの細胞内細胞小器官/成分の直接視覚化、およびシグナル伝達、遺伝子発現、小胞融合などのプロセスの直接視覚化を可能にする蛍光レポーターの使用によってさらに増幅することができます。 オートファジー、ニューロンおよび筋肉の活動電位など5,6,7,8,9,10,11。さらに、線虫は、突然変異誘発による遺伝子操作12、マイクロインジェクションまたは微粒子衝撃による導入遺伝子13、CRISPR編集14、そして最も重要なことに、簡単で費用対効果の高い遺伝子スクリーニングに関しては、RNAi15にも非常に適しています。この操作により、遺伝子と線虫自体におけるそれらの役割の広範な研究が可能になると同時に、C.エレガンスが他のモデル生物に示す重要な遺伝的相同性のおかげで、人間にまで関連する基礎的な発見が行われました16,17。最後に、この相同性/保存により、ワームは薬物および化学薬品の理想的な初期試験場となり、薬物活性のメカニズムの解明、潜在的な活性修飾遺伝的変異の同定、および潜在的な望ましくない相互作用およびオフターゲット効果の発見を可能にします18,19,20。

上記のすべての利点により、 C.エレガンス 細胞生物学および分子生物学研究、特に顕微鏡によるプロセスの生体内および多くの場合リアルタイムのモニタリングに関心のある科学者にとって、魅力的なモデルとなっています。このような研究には通常、特別なソフトウェアによる大量の画像分析が含まれ、最も広く使用されているオプションはImageJ 21,22,23です。このようなソフトウェアによる分析に共通する特徴は、ユーザー/研究者が選択ツールを使用して分析する関心領域 (ROI) を指定する必要があることです。非常に頻繁に、画像内の個々のワームは、単純な形態学的特徴(体の寸法など)または遺伝子の発現レベル(蛍光レポーターで測定)、レシオメトリックレポーターの読み出し、脂質滴の数とサイズ、 タンパク質凝集体の形成、個々の細胞小器官とそのネットワークの形態など5,8,10,24,25,26,27。標準的な画像処理アルゴリズムに基づく自動選択方法は、特にワームの輪郭がはっきりと見えない暗視野画像や、接触して重なり合う多数の動物を含む明視野画像では、通常、ワームの形状や特徴を区別するのに十分な能力がないため、これらのワームごとの選択は通常手動で行われます。ただし、手動プロセスは遅く(必要な精度とユーザーの経験に応じて、ワームあたり20秒から1分)、手間がかかり、ユーザーのバイアスやエラーの影響を受けます。

個々のC.エレガンスのROIを生成するための代替のはるかに強力なアプローチ(コンピュータービジョンの分野では通常セグメンテーションと呼ばれるタスク)は、ディープラーニング/ニューラルネットワーク技術の助けを借りてそれを自動化することです。主にマスクR-CNN28およびU-netアーキテクチャ29に基づく畳み込みニューラルネットワークは、C.エレガンス33、34、35、36、37、38、39を含む様々な生物学的モデルシステム30、31、32のセグメンテーションタスクでまともな結果を生み出しているしかし、多数の接触または完全に重なり合うワームを含む高解像度画像で個々の動物を正しく区別する全身セグメンテーション(インスタンスセグメンテーション)を生成するという問題に対する満足のいく解決策を提供したものはありません。このニーズを満たすために、このタスク40のために特別に設計および最適化された深層学習モデルであるSegElegansを開発しました。

SegElegans は、大きく分けて 2 つの部分で構成されています (図 1)。最初の部分は、2 頭の U-net バリアント畳み込みニューラル ネットワークです。これは、1 つのエンコーダ ブロックと 2 つのデコーダ ブロックで構成されています。エンコーダブロックは、SmaAt ATモデル41 に基づいており、畳み込みブロックアテンションモジュール(CBAM)42に供給される各層に二重畳み込みブロックを使用する。2つのデコーダブロックは、畳み込み長短期記憶(LSTM)ネットワーク43に基づいています。1 つのデコーダーは、画像の各ピクセルを、ワームの本体の一部、ワームのエッジの一部、背景の一部、またはワームが重なる領域の一部として分類する役割を果たします (これは通常、セマンティック セグメンテーションと呼ばれます)。もう一方のデコーダーは、各ワームの長さに沿って線形の「スケルトン」を描画する役割を果たします。2 番目の部分は、2 つのデコーダーの出力を組み合わせ、それらを使用して正確なインスタンス セグメンテーションを生成する後処理アルゴリズムです。最初に、セマンティックセグメンテーション出力とスケルトンセグメンテーション出力を比較することにより、真のオーバーラップのセグメントを識別します。次に、オーバーラップのないワームのインスタンスセグメンテーションを直接出力するか、オーバーラップするワームのセグメントから組み立てることによって出力します40。これらのセグメンテーションは、バイナリマスクとImageJ互換のROIとして保存されます。

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プロトコル

次のセクションには、SegElegansを効果的に使用する方法に関する詳細な手順が含まれています(図2)。これには、準備画像取得(セクション1)、モデルをオンライン(セクション2)またはオフラインで実行する方法(セクション3-5)、およびImageJまたはその他のツールへのROIのインポート(セクション6)に関する手順が含まれます。モデルによる画像の評価には、少なくとも6GB(理想的にはそれ以上)のビデオランダムアクセスメモリ(VRAM)を搭載したCUDA互換のグラフィックスプロセッシングユニット(GPU)を搭載したPCが必要なため、ほとんどのユーザー(Googleのサービスにアクセスできる場合)は、クラウドコンピューティングを通じてこれらのハードウェア要件を満たし、それを超えるモデルのオンラインバージョンを利用することをお勧めします(セクション1>セクション2>セクション6)。あるいは、適切に強力なハードウェアにアクセスでき、コマンドライン/端末の使用に関する基本的な理解があるユーザー(または前述のクラウドコンピューティングオプションにアクセスできないユーザー)は、モデルをローカルで実行する方が便利であると感じるかもしれません(セクション1>セクション3>セクション4または5>セクション6)。

1. サンプル画像とガイド画像の取得

  1. SegElegansを使用して、発現する蛍光レポーターの有無にかかわらず、あらゆるワーム株から成虫のセグメンテーションを取得します。目的の表現型/データが明視野画像で測定される場合は、広視野顕微鏡と互換性のあるソフトウェアを使用して、4倍または同様の対物レンズを使用して通常どおり取得します。
    注:SegEligansは、広範囲の明るさとコントラストで画像を分析できますが、飽和した明るいピクセルまたは暗いピクセルがないことが望ましいです。寸法に関しては、システムは 1328 x 1048 の画像でトレーニングされていますが、サイズが 512 x 512 以上の画像で動作するはずです。
  2. 目的の表現型/データが暗視野画像で測定される場合(1つまたは複数のトランスジェニック蛍光レポーターまたは色素を使用する場合に典型的)、ガイド画像として使用するデータと一緒に明視野画像を取得します(ステップ1.1で説明)。理想的には、顕微鏡の操作ソフトウェアによって提供されるマルチチャンネル取得オプションを使用して、ガイド画像が蛍光チャネルの暗視野画像と空間的に完全に一致し、時間的に可能な限り近いようにします。ガイド画像は、対応する暗視野データ画像とは別のフォルダーに、両方に同じ名前を使用して保存します。

2. SegElegans のオンライン版を実行する

  1. ウェブブラウザでGoogleアカウントにログインします。この目的のために、新しい専用ラボ アカウントを作成することをお勧めします。
  2. Google ドライブ (https://drive.google.com) に入り、明視野画像 (データまたはガイド) を含むフォルダーをアップロードします。前述のように、暗視野画像のROIを生成するためにガイド画像を使用する場合、このフォルダには、その暗視野データ画像を含めないでください。
  3. https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0 に移動し、SegElegans Body Prediction Interface.ipynb ファイルをクリックします。開いたファイルの上部にある「 Colabで開く 」ボタンをクリックします。SegElegans の Jupyter ノートブック/インターフェイスが Google Colab で開きます。
  4. タイトルの下にある再生 (figure-protocol-1) ボタンを押して、コード ブロック 1 を実行します。実行時にコードを実行し、実行終了後に出力を観察する権限をランタイムに付与します (再生ボタンの横に緑色のチェックマークが表示されます)。Colab は、CUDA 互換の正しいランタイムを自動的に実行し、NVIDIA-SMI 出力テーブルを表示します。それ以外の場合は、[ ランタイム] > [ランタイムの種類の変更 ] メニューを使用して T4 GPU ランタイムの使用を強制します。
  5. コードブロック2を実行して、Googleドライブのコンテンツをランタイムにロードします。すべての確認ダイアログを受け入れ、要求されたすべての権限を付与します。
  6. コードブロック3を実行し、次に4を実行します。ブロック 3 が完了するまでに数分かかるため、4 に進む前に緑色のチェックマークが表示されていることを確認してください。
  7. Colab インターフェイスの左側にあるフォルダー タブでアイコンを開きます。これにより、ドライブのインポートされたコンテンツを含む、ランタイムにロードされたファイルが /content/drive/MyDrive として表示されます。画像を含むフォルダーを右クリックし、パスをコピーして、コード ブロック 5 の test_images 入力フォームに貼り付けます。 /content/drive/MyDrive/Imageフォルダーのようになっていることを確認します。同様に、分析出力のパスを指定します ( 例: /content/drive/MyDrive/Imagefolder/Output)。この環境のパスでは、フォルダ (/) を区切るためにスラッシュが使用されることに注意してください。
  8. コードブロック5を実行します。
  9. モデルによって分析される画像の正確な拡張子を、提供されたコードブロック6の形式で指定します。この入力の目的のために ".tif"、".TIF」と「.tiff」は異なる拡張子として扱われます。
  10. システムがデフォルトの T4 GPU ランタイム (使用レベルに応じて、1 日あたり限られた時間数、すべてのユーザーに無料で提供される) で実行されている場合は、コード ブロック 6 の batch_crop_img 入力を調整しないでください。ランタイムでメモリ可用性の問題が発生する場合は、それを減らします。
  11. コードブロック 6 を実行します。これには時間がかかるため、続行する前に緑色のチェックマークが表示されていることを確認してください。
  12. コードブロック7を実行します。デフォルトの T4 ランタイムに合わせて入力を調整しないでくださいが、サブプロセスの数を減らすか、メモリー可用性の問題が発生した場合は並列処理を完全に無効にします。これにもかなりの時間がかかります。
  13. 別のブラウザウィンドウまたはタブでGoogleドライブにアクセスし、2.7で指定された出力フォルダに移動します。
    注:この時点で、SegElegansはセグメンテーションの初期評価と後処理を終了し、出力を含むいくつかのサブフォルダーを作成しました。 0_summary結果 には、各画像の出力を要約したグラフが含まれ、各ワームにインデックス番号が割り当てられています。 1_complete_mask には、アルゴリズムが分析に適していると判断したすべてのセグメンテーションのキュレーションされたバイナリマスクが含まれています。 1_edge_small_mask には、動物が小さすぎるか、画像の端で部分的に不明瞭になっているためにアルゴリズムが拒否することを決定したすべてのセグメンテーションのバイナリマスクが含まれています。 1_overlap_mask には、実際のオーバーラップを示したワームのすべてのセグメンテーションのバイナリマスクが含まれており、デフォルトではキュレーションされた出力には追加されません。 1_all_rois_results には、キュレーションに関係なく、ImageJ形式(ROIを含むzipファイル)の3つのタイプのセグメンテーションが含まれています。
  14. この時点で、次の 3 つのオプションのいずれかを選択します。
    1. ImageJ の 1_all_rois_results で提供されている ROI を使用し、インポート後に不要な ROI を拒否します (プロトコルのセクション 6 を参照)。
    2. 厳選された優れたマスクを手動で修正せずに(重複するワームを含めずに)受け入れます(2.16にスキップ)。
    3. 出力に含めるワーム(重複するワームを含む)を選択して、キュレーションを手動で調整します(2.15に進みます)。
  15. キュレーションを手動で調整するには、コードブロック 8 を使用します。 0_summary結果 フォルダーのサマリーグラフから初期キュレーションの結果を調べます。補正が必要な画像ごとに、元の入力画像のフルネーム(拡張子付き)を「name_image_change」形式で入力し、保持するマスクの番号を(サマリーグラフから)「index_images」形式でカンマで区切って入力します。コードブロック8を実行します。補正が必要な他の画像についても、この手順を繰り返します。
  16. 修正後、またはユーザーが修正なしで(および重複するワームなしで)最初のキュレーションを受け入れることを選択した場合は、コードブロック9を実行します。Google ドライブの出力フォルダーに 2_curated_rois_results という新しいサブフォルダーが作成されます。これには、ImageJ形式(ROIを含むzipファイル)の最終的なキュレーションされたすべてのセグメンテーションが含まれています。
  17. 別の画像フォルダに対してプロセスを再度実行するには、メニュー ランタイム > セッションの再起動 からランタイムをリセットし、最初からやり直してください。

3. 初回使用前にSegElegansのオフライン版を準備する

  1. ColabでSegElegansをオンラインで実行する代わりに、Googleのクラウドコンピューティングサービスを使用できない、または使用したくないユーザーがSegElegansのオフラインバージョンを利用できます。これには、少なくとも 6 GB の VRAM を搭載した CUDA 互換 GPU (https://developer.nvidia.com/cuda-gpus) を搭載した PC (Windows または Linux) が必要です (ただし、入手可能で手頃な価格の場合は 16 を推奨します)。
    注: セクション 3 から 5 の次の手順は Windows に焦点を当てていますが、使用するコマンドに若干の変更を加えることで、ソフトウェアは Linux ベースのシステムでも実行できます。
  2. 指示に従って https://developer.nvidia.com/cuda-downloads から CUDA ツールキット インストーラーをダウンロードし、使用するデバイスに適したバージョンを取得します。
    注: SegElegans は、ツールキットのバージョン 12.9 および 13.0 と Windows の CUDA バージョン 11 でテストされていますが、将来のバージョンでは下位互換性が維持されることが期待されます。
    1. インストーラ自体の指示に従って、ツールキットをインストールします。Visual Studio は必要ありません。
  3. デバイスに適したバージョンの Python インストーラを https://www.python.org/downloads/ からダウンロードします。インストーラー自体の指示に従って Python をインストールし、python.exe が PATH に追加されていることを確認します。
    注: SegElegans は Python 3.13 でビルドおよびテストされましたが、将来のバージョンでは下位互換性が維持されることが期待されます。
  4. https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOffline/releases/tag/v1 に移動します。[ソースコード(zip) ]リンクをクリックして、SegElegansをローカルでセットアップして実行するために必要なファイルを含むパッケージをダウンロードします。
  5. zipファイルを解凍します。C:\SegElegans などの上位フォルダーまたは最上位フォルダーに配置します。zipファイルの内容は、すでにサブフォルダ SegElegansOffline-1内にあります。
  6. Windows コマンドプロンプト (cmd.exe) を開きます。コマンド python -m venv "fullsegeleganspath" ("fullsegeleganspath"は引用符で囲まれたフルパス)を SegElegansOffline-1 サブフォルダーに入力します。
    注: たとえば、zip ファイルが C:\SegElegans で抽出された場合、フル パスは C:\SegElegans\SegElegansOffline-1 で、コマンドは python -m venv "C:\SegElegans\SegElegansOffline-1" になります。この環境のパスでは、バックスラッシュを使用してフォルダ ("\") を区切ることに注意してください。
  7. コマンド プロンプトで、標準コントロールを使用して SegElegansOffline-1 フォルダー内に移動し、 コマンド Scripts\activate を実行します。(SegElegansOffline-1) ラベルが次のプロンプトカーソルの前に表示され、Python 環境がアクティブになったことを示します。
  8. アクティブ(SegElegansOffline-1)環境内で、 コマンドpip install -r requirements.txtを実行します。このプロセスには時間がかかります。
  9. コマンドpython assemblenetworks.py を入力して実行します。
    注: SegElegans を実行する準備が整いました。これを実現するには、キュレーションを手動で修正するオプションなしで、すべてのセグメンテーションを ImageJ ROI として自動的に提供するクイックスクリプト (セクション 4) と、キュレーションの概要と修正のオプションを提供するローカル Jupyter ノートブック (セクション 5) の 2 つが用意されています。後者のアプローチは、ほとんどのユーザーに推奨されます。

4. クイックスクリプトでSegElegansのオフラインバージョンを実行する

  1. Windows コマンドプロンプト (cmd.exe) を開きます。手順 3.7 で説明したように、SegElegans 環境フォルダーに移動してアクティブ化します。
  2. クイックスクリプトを使用するには、アクティブな(SegElegansOffline-1)環境のコマンドプロンプトでコマンドpython SegElegansBodyQuickEval.py -i "pathtoinputfolder" -x <ファイル拡張子> を入力して実行します。ここで、"pathtoinputfolder"は、明視野画像を含むフォルダーへのフルパス(引用符で囲まれています)(例:"D:\Data\Experiment12365\Condition 1")、<ファイル拡張子>は、ユーザーが分析したい画像の正確なファイル拡張子です(例")。TIF」)。コマンドpython SegElegansBodyQuickEval.py-h を入力して、デバイスが処理できる場合にスクリプトによる処理を高速化するために変更できる追加パラメータの指示を表示します。
    注:この場合の出力フォルダは、入力フォルダ内に作成されます(上記の例では、「D:\Data\Experiment12365\Condition 1\Output」)。内部には、一連のサブフォルダーがあります。 0_summary結果 には、各画像の出力を要約したグラフが含まれており、各ワームにインデックス番号が割り当てられています。 1_complete_mask には、アルゴリズムが分析に適していると判断したすべての重複しないセグメンテーションのキュレーションされたバイナリマスクが含まれています。 1_edge_small_mask には、動物が小さすぎるか、画像の端で部分的に不明瞭になっているためにアルゴリズムが拒否することを決定したすべてのセグメンテーションのバイナリマスクが含まれています。 1_overlap_mask には、実際のオーバーラップを示したワームのすべてのセグメンテーションのバイナリマスクが含まれています。 1_all_rois_results には、キュレーションに関係なく、ImageJ形式(ROIを含むzipファイル)の3つのタイプすべてのセグメンテーションが含まれています。ここではキュレーションを手動で修正する方法がないため、 2_curated_rois_resultsアルゴリズム によって良好と見なされるすべてのセグメンテーションと、ImageJ形式のすべての重複するセグメンテーション(ROIを含むzipファイル)がデフォルトで含まれます。

5. Jupyter ノートブックで SegElegans のオフライン バージョンを実行する

  1. Windows コマンドプロンプト (cmd.exe) を開きます。手順 3.7 で説明したように、SegElegans 環境フォルダーに移動してアクティブ化します。
  2. Jupyter インターフェイスを使用するには、アクティブな (SegElegansOffline-1) 環境のコマンド プロンプトで、 コマンド jupyter notebook を入力して実行します。これにより、ローカルでホストされているサイトを含むWebブラウザウィンドウ/タブが開きます。最初の画面で、 SegElegansOfflineJupyterInterface.ipynb ファイルを選択します。
  3. コードブロック1のコードを選択し(実際のコードの外側の左側をクリック)、上のツールバーの再生(figure-protocol-2)ボタンを押して実行します。実行が完了すると、コードブロックの下に確認メッセージが表示されます。
  4. コードブロック2を実行します。これにより、コードブロックの下の読み出しにいくつかの入力フォームが生成されます。生成されたフォームに、明視野画像を含む入力フォルダーへのパス(例: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1")、分析出力の希望のパス(例: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1\Output")、および分析する画像の正確なファイル拡張子(例".TIF」)。デバイスが十分に機能している場合は、提供された追加の設定を調整します(バッチあたりのサブクロップの数を9または16に増やし、複数の後処理並列プロセスを実行します)。
  5. コードブロック 3 を実行します。
  6. コードブロック4を実行します。これには時間がかかるため、完了していることを確認してくださいから続行してください。
  7. コードブロック5を実行します。繰り返しになりますが、これには時間がかかります。この後、上記で指定された出力フォルダーに移動します。
    注:この時点で、SegElegansはセグメンテーションの初期評価と後処理を終了し、出力を含むいくつかのサブフォルダーを作成しました。 0_summary結果 には、各画像の出力を要約したグラフが含まれ、各ワームにインデックス番号が割り当てられています。 1_complete_mask には、アルゴリズムが分析に適していると判断したすべてのセグメンテーションのキュレーションされたバイナリマスクが含まれています。 1_edge_small_mask には、動物が小さすぎるか、画像の端で部分的に不明瞭になっているためにアルゴリズムが拒否することを決定したすべてのセグメンテーションのバイナリマスクが含まれています。 1_overlap_mask には、実際のオーバーラップを示したワームのすべてのセグメンテーションのバイナリマスクが含まれており、デフォルトではキュレーションされた出力には追加されません。 1_all_rois_results には、キュレーションに関係なく、ImageJ形式(ROIを含むzipファイル)の3つのタイプのセグメンテーションが含まれています。
  8. SegElegansのオンライン版と同様に、以下の3つのオプションのいずれかを使用します。
    1. ImageJ の 1_all_rois_results で提供されている ROI を使用し、インポート後に不要な ROI を拒否します (プロトコルのセクション 6 を参照)。
    2. 手動補正なしで(重複するワームを含めずに)自動的にキュレーションされた良好なマスクを受け入れます(ステップ5.11にスキップします)。
    3. 出力に含めるワーム(重なり合うワームを含む)を選択して、キュレーションを手動で調整します(手順5.9に進みます)。
  9. キュレーションを手動で調整するには、コードブロック 6 と 7 を使用します。最初に実行します 6.これにより、コードの下の読み出しに入力フォームが作成されます。
  10. 0_summary結果サブフォルダーのサマリーグラフから初期キュレーションの結果を調べます。補正が必要な画像ごとに、修正する画像:フォームにINPUT画像のフルネーム(拡張子付き)を入力し、保持するマスクの番号を(まとめグラフから)カンマで区切って保持するマスクの番号を保持するマスク:フォームに入力します。コードブロック7を実行し、実行が完了することを確認します。補正が必要な他の画像についても、この手順を繰り返します。
  11. キュレーションの修正が完了した後、またはユーザーが修正なしで(およびワームが重なり合わずに)最初のキュレーションを受け入れることを選択した場合は、コードブロック8を実行します。指定された出力フォルダーに新しいサブフォルダーが作成されます 2_curated_rois_results。これには、ImageJ形式(ROIを含むzipファイル)の最終的なキュレーションされたすべてのセグメンテーションが含まれています。
  12. イメージの別のフォルダーに対してプロセスを再度実行するには、メニューからランタイムをリセットします カー ネル > カーネルの再起動 と すべてのセルの出力のクリア 最初 からやり直し、最初からやり直します。

6. セグメンテーションをImageJ(または代替)にインポートする

  1. ImageJで実際のデータ画像の1つを開きます。
  2. そのイメージの ROI を含む対応する zip ファイルを開きます。これにより、選択内容が ImageJ ROI マネージャーに読み込まれます。それらが 2_curated_rois_results 出力からのROIである場合は、通常使用される目的の方法(できればマクロを使用してプロセスをさらに自動化および加速する)で分析する準備ができています。
  3. 1_all_rois_results出力の ROI である場合は、ROI マネージャーから不要なセグメンテーションを削除します。それらを選択し、マネージャーウィンドウ自体の[削除]ボタンを押します。キーボードの Delete キーを押すと、画像内の選択内容が削除されるため、押さないでください。
  4. 解析にImageJ以外のソフトウェアが必要な場合、ROI形式は互換性がない可能性が高いです。その場合は、 1_complete_mask フォルダーと 1_overlap_mask フォルダーで提供される、普遍的に利用されているバイナリマスクの形式でセグメンテーションをインポートします。そのインポートの実行方法については、受信ソフトウェアの指示を参照してください。

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結果

このプロトコルに従うことで、研究者は、目に見えるワームの境界のない蛍光画像の分析でも、高品質のワームセグメンテーションを抽出できるはずです。プロトコルのセクション6で説明したように、これらのセグメンテーションはImageJに直接インポートし、蛍光レポーターの強度(発現定量に一般的に使用される)や蛍光タグ付き領域の数、サイズ、形態(タンパク質凝集体または細胞小器官の研究に頻繁に使用される)などの関連特性の迅速な測定に使用できます。さらに、SegElegansは、蛍光に依存しない方法で明視野画像からセグメンテーションを取得するように設計されているため、強度比の測定(たとえば、特定の細胞小器官のオートファジー分解を定量化するため)や共局在指標(細胞小器官間の相互作用を特定しようとする場合など)を含むマルチチャネル分析も支援できます。

SegElegansは、93%以上のセグメンテーションIoU(Intersection over Union)スコア(表1)を達成し、

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ディスカッション

ここで紹介する方法論により、ユーザーは精度を損なうことなく、大幅に速い時間枠でC.エレガンス顕微鏡実験を分析できるはずです。実際の蛍光とは無関係に明視野ガイド画像からセグメンテーションを抽出するため(プロトコルセクション1で説明されているように)、ワームごとに表現型を測定する必要があるあらゆる株およびアプリケーションに使用できます。これらには、疾患モデル10における異常なタンパク質封入体の形成の定量化(図2に示す例のように)、転写レポーター26の活性、または脂質液滴のサイズおよび数44などの単一チャネルアプリケーションが含まれ得る。また、レシオメトリックセンサー27による過酸化水素レベルの測定、細胞小器官およびタンパク質の共局在化の評価11、高分子修飾の検出...

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開示事項

著者には宣言すべき利益相反はありません。

謝辞

著者の研究室での作業は、事務局によって資金提供されています。
ギリシャ開発省の研究とイノベーション、
欧州連合 - NextGenerationEU (プロジェクトコード: TAEDR-0535850、頭字語:
BrainPrecision)アクションの枠組みの中で「フラッグシップアクション
関連性に特に関心のある学際的な科学分野
生産的な構造に」を掲載しています。
計画「ギリシャ2.0」、欧州委員会研究執行機関
エクセレンスハブ「CHAngeing」(GA-101087071)とギリシャ財団
研究イノベーション(H.F.R.I.)の「第1回H.F.R.I.募集」
教員・研究者を支援する研究プロジェクト
高コスト研究機器の調達」(プロジェクト番号:
HFRI-FM17C3-0869、ニューロマイトファジー)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
インターネット接続可能なコンピュータ(例:Dell Vostro Desktop)いくつか(例えばDellなど) -これにより、推奨されているクラウドコンピューティング経由でオンライン上でSegElegansを運用し、ImageJなどの画像解析ソフトウェアを使用できるようになります。
CUDA互換グラフィックス処理ユニット(CVP)で、少なくとも6GBのVRAM(例:MSI Geforce RTX RTX3050 Ventus 2X 6GB)(オプション)NVIDIA + 複数のメーカー(例えばMicro Star International)https://developer.nvidia.com/cuda-gpusこれにより、ローカルマシン上でSegElegansをオフラインで実行できるようになります。
CUDA対応GPUチップセットはこちらで入手可能です:
https://developer.nvidia.com/cuda-gpus
VRAMは、メーカーがチップセットをGPUに実際に実装するかどうかに依存します。
警告:クラウドコンピューティング版の性能に匹敵するには、最低要件(16+ GB VRAM)を大幅に超える高価で高性能なCUDAカードが必要です。
エピ蛍光顕微鏡(Invitrogen EVOS FL Auto 2)サーモフィッシャー・サイエンティフィック AMAFD2000 例えば明るい視野と1つ以上の蛍光チャネルからほぼ同時に画像を自動的に取得できるシステムの使用を推奨します。
ImageJ(任意)NIHhttps://imagej.net/software/fiji/downloadsフィジー版の配布をおすすめします。こちらで入手可能です:
https://imagej.net/software/fiji/downloads
NVIDIA GPU対応のPC(例:Dell Vostro Desktop)(オプション) いくつか(例えばDellなど) -これは、ローカルマシン上でオフラインでSegElegansを動かすためにGPUと連携して必要です。
GPUは、マザーボードに適切なPCIスロットを備えたWindows互換ハードウェア、カードを収めるスペース、十分なパワーサプライが必要です。
セゲレガン-https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0 詳細は原稿を参照してください。nbsp;

参考文献

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